清肺透邪湯介導(dǎo)NLRP3 炎性小體抑制NF-κB 信號通路改善肺炎支原體小鼠炎性反應(yīng)

王子,王雪峰,吳振起

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學研究生學院,沈陽 110847; 2. 遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,沈陽 110032)

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae,MP)是一種常見的可以引發(fā)兒童及青少年肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)的病原體,該病多在秋冬季節(jié)流行,患兒除具有肺部病征外,重者還可出現(xiàn)多器官損害,嚴重影響了兒童的健康。 目前MPP 發(fā)病機制尚不完全清楚,但普遍認為與機體免疫功能異常有關(guān)[1]。 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NLRP3)炎性小體和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的重要通路。 有研究表明,肺炎支原體可被NLRP3 識別,觸發(fā)機體固有免疫應(yīng)答,誘發(fā)炎癥反應(yīng),從而參與MPP 的發(fā)生與發(fā)展[2]。

近年來,MPP 發(fā)病率不斷升高,同時肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性的不斷擴大導(dǎo)致了難治性MPP 的比例也逐漸升高。 隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展,傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療兒童肺炎支原體肺炎的優(yōu)勢逐步顯現(xiàn),有研究表明,應(yīng)用中藥方劑可以明顯減輕臨床癥狀并增強機體免疫力,以防復(fù)發(fā),其即使長期服用中藥制劑也無明顯不良反應(yīng)[3]。 清肺透邪湯是臨床治療肺炎支原體肺炎及病毒性肺炎的常用中藥制劑,由炙桑白皮、黃芩、石膏、麻黃、麥冬、虎杖、蘇子、杏仁、桔梗組成,具有清熱化痰止咳之功效[4]。 本實驗室前期研究表明清肺透邪湯可以明顯抑制MPP 小鼠的炎癥反應(yīng),但是其作用機制尚未報道[5]。 因此,本研究旨在通過建立MPP 小鼠模型,觀察清肺透邪湯對其治療作用,并且從NLRP3 炎性小體和NF-κB 信號通路方面探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

8 周齡雄性 SPF 級 BALB/c 小鼠 40 只,體重(20 ± 2)g,購于遼寧長生生物有限公司【SCXK(遼)2015-0001】,實驗在遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心屏障系統(tǒng)內(nèi)進行【SYXK(遼)2019-0004】。 所有本研究中使用的實驗方案由遼寧中醫(yī)藥大學動物管理委員會及動物福利倫理委員會批準,嚴格按照3R 原則進行動物飼養(yǎng)及實驗, 項目批準號： 201711。

1.1.2 菌株

MP 標準株FH 來自遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院病毒實驗室,由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院兒科吳振起教授惠贈。 將凍存的MP 接種至液體培養(yǎng)基中,在37℃含5%CO2飽和氮的厭氧培養(yǎng)箱中孵育。 當培養(yǎng)液由紅變黃時進行連續(xù)傳代,取第3 代MP 菌液備用。 以培養(yǎng)基由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色時的最高稀釋濃度作為顏色改變單位(color change unite,CCU),采用 CCU/mL 方法測定 MP 濃度,取 MP 菌液濃度 1×107CCU/mL 備用。

1.1.3 清肺透邪湯

清肺透邪湯由炙桑白皮9 g、黃芩9 g、石膏12 g、麻黃 6 g、麥冬 9 g、虎杖 9 g、蘇子 9 g、杏仁 6 g、桔梗9 g 組成,中藥由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院門診中草藥局提供,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學中藥分析教研室李峰教授鑒定為正品,遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室加工制成含生藥2 g/mL 的濃縮液,用于后續(xù)實驗。

1.1.4 試劑與儀器

IL-1β (批 號： 19010847 M)、 TNF-α ( 批 號：19010880 M)、IL-6(批號：19010890 M)、IL-18(批號：19010896 M)ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;HiScriptQ RT SuperMix for qPCR(批號：7E272CB) 和 HieffTMqPCR SYBR? Green Master Mix(批號：7E380A9)購自諾唯贊生物科技有限公司;NLRP3、MyD88、NF-κB 和 β-actin 引物由上海生工生物有限公司合成;NLRP3(19771 - 1-AP)、MyD88(23230-1-AP)、p-NF-κB(14220-1-AP)和 βactin(66009-1-AP)抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

倒置熒光生物顯微鏡(NIB-100F,寧波永新光學股份有限公司), qPCR 儀(QuantStudioTM3,Thermo scientific 公司),酶標儀(Mr-96 A,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司),Western Blot 電泳槽與轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-rad 公司),凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius,UVP,上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 肺炎支原體感染小鼠模型的建立及分組

按文獻報道的方法建立肺炎支原體感染小鼠模型[6],用乙醚將40 只小鼠進行輕度麻醉,用1 mL 注射器緩慢向每只小鼠的鼻腔中滴入0. 1 mL 的 MP 菌液(滴度為 1×107CCU/mL),接種后將小鼠呈45°靜置 30 s,以利于 MP 菌液的充分吸入并防止小鼠窒息,連續(xù)滴鼻 3 d,另取8 只小鼠在同等條件下滴入等量生理鹽水作為對照組。接種后觀察記錄各組小鼠的體重、進食、大便、活動度等情況的變化。 隨后將模型制備成功的小鼠隨機分為模型組(MPP)、清肺透邪湯低劑量(200 mg/kg)組(QFTXTL)、中劑量組(400 mg/kg) ( QFTXTM)、 高 劑 量 ( 800 mg/kg) 組(QFTXTH),每組8 只。 治療組的小鼠按照劑量連續(xù)灌胃給藥2 周,每天1 次,對照組(sham)及模型組給予等體積的蒸餾水。

1.2.2 樣本的采集

處死各組小鼠,打開胸腔,用預(yù)冷的PBS 對右肺進行支氣管肺泡灌洗,回收肺泡灌洗液(BALF)3000 r/min 離心15 min,吸取上清。 隨后取出肺組織一部分立即放入4%的多聚甲醛溶液中固定用于制備肺組織切片,另一部分置于液氮中凍存,用于qPCR 及 Western Blot 檢測。

1.2.3 MPP 小鼠肺指數(shù)計算

處死各組小鼠前稱取每只小鼠的體重,處死后冰上快速取出各組小鼠的肺組織,濾紙吸去表面水分后稱取肺組織重量。 按下面公式計算肺指數(shù)：肺指數(shù) = 肺重/體重 × 100%,得到各組小鼠的肺指數(shù)。

1.2.4 HE 染色檢測各組小鼠肺組織病理變化

首先將各組小鼠肺切片放入蘇木精液中染色5～10 min;蒸餾水洗去染色液,1%鹽酸乙醇1 ～3 s,蒸餾水快速洗滌,伊紅染色液染色1 ～2 min,依次浸入70%、80%、90%、100%乙醇中10 s,浸入二甲苯中透明5 min 后中性樹膠進行封片,顯微鏡下觀察并拍照[7-8]。

1.2.5 TUNEL 法檢測各組小鼠肺組織中細胞凋亡情況

各組小鼠肺組織中細胞凋亡的檢測嚴格按照TUNEL 試劑盒說明書進行操作。 將切片置于倒置熒光顯微鏡下觀察,并利用Image J 軟件進行計數(shù)分析。

1.2.6 ELISA 檢測各組小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18 的含量

取肺泡灌洗液樣品用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測樣品中 IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18 水平,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。 于酶標儀在450 nm 波長下檢測吸光度值,根據(jù)不同濃度標準品的OD 值繪制標準曲線,得到回歸方程,根據(jù)回歸方程計算樣品中IL-1β、TNF-α、IL-6 及 IL-18 水平。

1.2.7 qPCR 法檢測各組小鼠肺組織中NLRP3、MyD88、NF-κB 的 mRNA 水平

按TRIzol 法提取各組小鼠肺組織RNA,用分光光度計檢測各組總RNA 的純度及純度;按HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)所示比例將mRNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA,按HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit 所示比例構(gòu)建qPCR反應(yīng),相關(guān)引物序列如表1。 反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5 min,變性95℃ 10 s,退火55℃ 30 s,擴增40 個循環(huán)。 以 U6 為內(nèi)參,得到的結(jié)果用 2-△△CT表示。

表1 qPCR 引物列表Table 1 qPCR primers

1.2.8 Western Blot 檢測

提取各組小鼠肺組織蛋白,12 000 r/min 離心15 min,使用BCA 蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量分析,100℃加熱10 min 對蛋白進行變性,隨后進行SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳,使用PVDF 膜轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉液封閉,TBST 洗膜,分別加入β-actin、兔抗 NLRP3、MyD88、p-NF-κB 及 β-actin 一抗(1 ∶1000),4℃孵育過夜,TBST 洗膜,加入相應(yīng)HRP 標記二抗稀釋濃度為 1 ∶1000,室溫避光孵育 1 h。TBST 洗膜,ECL 發(fā)光試劑盒發(fā)光,凝膠成像系統(tǒng)成像,Image J 軟件計算灰度值,統(tǒng)計分析目的條帶與內(nèi)參蛋白條帶光密度的比值。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進行分析處理,作圖采用Graphpad 5.0 處理。 數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標準差(),多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析,其中兩兩比較采用LSD-t 法,以P＜0.05 作為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 清肺透邪湯對MPP 小鼠外觀表現(xiàn)及肺指數(shù)的影響

對照組小鼠觀察期內(nèi)精神狀態(tài)良好,皮毛光澤,活動、呼吸及進食情況正常,體質(zhì)量逐漸增加;而模型組小鼠精神狀態(tài)變差,皮毛無光澤,活動減少,進食量減少,體質(zhì)量增長速度減緩;清肺透邪湯治療后,小鼠精神狀態(tài)改善,活動量增多,進食量增加,體質(zhì)量增長速度增加。

對照組小鼠取出的肺組織表面呈淡紅色,無病理性瘀斑;模型組小鼠肺組織呈暗紅色,表面可見大量的肺實變病灶,看見大量瘀點;而各個劑量清肺透邪湯治療后的小鼠肺組織的肺實變病灶明顯減少。 各組的小鼠肺指數(shù)的結(jié)果如圖1 所示,與對照組相比,模型組小鼠肺指數(shù)顯著升高(P＜0.05);經(jīng)過不同劑量清肺透邪湯治療后,MPP 小鼠肺指數(shù)顯著降低(P＜0.05)。

2.2 清肺透邪湯改善MPP 小鼠肺組織病理改變

HE 染色結(jié)果如圖2 所示,對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)較為均勻與清晰,肺泡內(nèi)無滲出,支氣管和血管周圍及肺泡間隔中偶見淋巴細胞和巨噬細胞浸潤。模型小鼠肺組織中可見間質(zhì)性炎癥改變,肺泡內(nèi)有滲出肺泡間隔增寬,在支氣管和血管周圍及肺泡間隔有大量的淋巴細胞和巨噬細胞浸潤。 而給予不同劑量清肺透邪湯治療后的MPP 小鼠肺組織炎癥反應(yīng)開始減輕,間質(zhì)性炎癥呈現(xiàn)輕度改變,肺泡間隔稍有增寬,淋巴細胞和巨噬細胞浸潤在支氣管和血管周圍及肺泡間隔的浸潤減少。

2.3 清肺透邪湯減少MPP 小鼠肺組織細胞凋亡

如圖3 所示,與對照組相比,模型組小鼠肺處細胞凋亡數(shù)顯著增多(P＜0.05);與模型組相比,不同劑量清肺透邪湯治療組小鼠肺處細胞的凋亡數(shù)顯著減少(P＜0.05),說明清肺透邪湯可以抑制MPP小鼠肺組織中細胞凋亡。

2.4 清肺透邪湯減少MPP 小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18 的含量

如圖4 所示,與對照組相比,模型組肺泡灌洗液中 IL-1β、TNF-α、IL-6 及 IL-18 含量顯著升高(P ＜0.05);給予清肺透邪湯治療后的MPP 小鼠肺泡灌洗液中 IL-1β、TNF-α、IL-6 及 IL-18 含量顯著降低(P＜0.05),說明清肺透邪湯能改善MPP 小鼠肺組織中的炎癥反應(yīng)。

注：與對照組相比,*P＜0.05;與模型組相比,#P＜0.05。 (下圖同)圖1 清肺透邪湯對MPP 小鼠肺指數(shù)影響Note. Compared with control group,*P＜0.05. Compared with MPP group,#P＜0.05.(The same in the following Figures)Figure 1 Effects of Qingfei Touxie decoction on lung index in MPP mice

圖2 清肺透邪湯對MPP 小鼠肺組織病理改變(HE 染色)Figure 2 Effects of Qingfei Touxie decoction on pathological changes of lung tissue in MPP mice (HE staining)

圖3 清肺透邪湯減少MPP 小鼠肺組織細胞凋亡影響(TUNEL 染色)Figure 3 Effects of Qingfei Touxie decoction on apoptosis of lung tissue in MPP mice (TUNEL staining)

圖4 清肺透邪湯減少MPP 小鼠肺泡灌洗液中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18 的含量Figure 4 Qingfei Touxie decoction reduced the content of inflammatory cytokines IL-1β, TNF-α, IL-6,and IL-18 in bronchoalveolar lavage fluid of MPP mice

2.5 清肺透邪湯減少MPP 小鼠肺組織中NLRP3、MyD88 及 NF-κB 的 mRNA 的表達

為了探討清肺透邪湯對MPP 小鼠抗炎作用的機制,我們采用了 qPCR 法檢測了 NLRP3、MyD88及 NF-κB mRNA 的表達。 結(jié)果如圖 5 所示,與對照組相比,MPP 小鼠肺組織中 NLRP3、MyD88 及 NF-κB mRNA 水平均顯著升高(P＜0.05);而經(jīng)清肺透邪湯治療后,MPP 小鼠肺組織中 NLRP3、MyD88 及NF-κB mRNA 水平明顯降低(P＜ 0.05)。

2.6 清肺透邪湯減少MPP 小鼠肺組織中NLRP3、MyD88 及 NF-κB 蛋白的表達

如圖6 顯示,與對照組相比,模型組肺組織中NLRP3、MyD88 及 NF-κB 蛋白的表達顯著升高(P＜0.05);清肺透邪湯治療后,肺組織中 NLRP3、MyD88 及NF-κB 蛋白的表達顯著降低(P＜ 0.05),以上結(jié)果提示清肺透邪湯對MPP 小鼠的治療作用可能與抑制NLRP3 炎癥小體從而抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

3 討論

圖5 qRT-PCR 檢測清肺透邪湯減少MPP 小鼠肺組織NLRP3,MyD88 及NF-κB mRNA 含量Figure 5 Qingfei Touxie decoction reduced NLRP3, MyD88 and NF-κB mRNA content in lung tissue of MPP mice as measured by qRT-PCR

圖6 Western Blot 檢測清肺透邪湯減少MPP 小鼠肺組織NLRP3,MyD88 及NF-κB 蛋白含量Figure 6 Qingfei Touxie decoction reduced NLRP3, MyD88 and NF-κB mRNA content in lung tissue of MPP mice as measured by Western Blot

MPP 屬于中醫(yī)學“肺炎喘嗽”、“咳嗽”等范疇,歸屬于溫病范疇。 中醫(yī)藥由于其獨特的優(yōu)勢在治療MPP 方面發(fā)揮了重要的作用。 本實驗室前期已經(jīng)證實清燥救肺湯可明顯抑制肺炎支原體感染小鼠肺部炎癥因子的表達及凋亡相關(guān)蛋白BcL-2、Bax及Caspase-3的表達[7-8]。傳統(tǒng)中醫(yī)學認為該病由于風溫之邪侵襲肺衛(wèi),邪氣蘊結(jié)于內(nèi)而見邪熱蘊肺證;其病機為風溫之邪閉阻于肺,則肺失宣肅,肺絡(luò)受損。 因此提出“風溫伏肺”理論,確立清肺透邪之法治療小兒MPP[9]。 清肺透邪湯具有清肺透邪、宣肺止咳之功效,組方以桑白皮、黃芩、石膏、麻黃為君藥,桑白皮瀉肺平喘,黃芩清熱瀉火解毒,石膏配麻黃清熱宣肺;麥冬、虎杖為臣藥,麥冬潤肺止咳,虎杖解毒化痰止咳;杏仁、蘇子止咳平喘,為佐藥;桔梗宣肺去談,引諸藥上行于肺,為使藥。 本研究顯示,我們利用鼻腔滴注MP 菌液的方法建立MPP小鼠模型,發(fā)現(xiàn)模型組小鼠精神狀態(tài)不佳,反應(yīng)遲鈍,呼吸頻率加快,皮毛無光澤,自主活動減少,進食量減少,體質(zhì)量增長速度減緩且肺部結(jié)構(gòu)存在明顯的病理學改變,表明MP 感染可導(dǎo)致小鼠肺組織結(jié)構(gòu)和功能損傷,說明MPP 小鼠模型制備成功,可用于后續(xù)實驗。 而且給予不同劑量清肺透邪湯治療后小鼠肺組織病理損傷明顯減輕,肺指數(shù)降低,炎癥細胞浸潤及壞死程度減輕,且細胞凋亡數(shù)量明顯減少,提示清肺透邪湯能夠減輕MP 誘導(dǎo)的肺組織損傷。

致病源過度激活免疫系統(tǒng),誘導(dǎo)機體釋放多種炎癥因子,從而造成炎癥反應(yīng),是MPP 的發(fā)病機制之一。 有研究表明,MPP 可誘導(dǎo)炎癥因子 IL-1β、TNF-α、IL-6 及 IL-18 等的釋放[10]。 先前研究證明了 IL-1β、TNF-α、IL-6 及 IL-18 等炎癥因子的表達水平與MPP 的嚴重程度呈正比,則MPP 越重,炎癥因子的水平越高[11]。 本研究結(jié)果顯示,模型組小鼠BALF 中 IL-1β、TNF-α、IL-6 及 IL-18 含量顯著高于對照組,提示MP 菌液可激活機體免疫炎癥系統(tǒng),誘導(dǎo)肺內(nèi)炎癥因子的大量表達并釋放,而不同劑量清肺透邪湯治療后小鼠 BALF 中 IL-1β、TNF-α、IL-6及IL-18 含量顯著下降,說明清肺透邪湯能夠抑制MP 菌液誘導(dǎo)的炎癥因子大量釋放,抑制炎癥反應(yīng)。

NLRP3 炎性小體與MPP 等多種病原體引起的呼吸系統(tǒng)感染有關(guān),其激活的方式可能主要與溶酶體破裂方式、半通道方式及活性氧方式激活[12]。 活化的NLRP3 通過其 N 端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain,PYD)與ASC 的PYD 域相連,進而誘導(dǎo)ASC的胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain,CARD)招募 Caspase-1 形成 NLRP3 炎癥復(fù)合體,可以使無活性的pro-IL-1β 加工成為有活性的IL-1β,并分泌到細胞外參與MMP 的炎癥反應(yīng)[13]。此外,有研究表明,在MPP 模型中,MP 可以與組織細胞表面的Toll 樣受體(TLRs)結(jié)合,激活NF-κB 信號通路引發(fā)炎癥反應(yīng)。 TLR4 在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,是機體固有免疫反應(yīng)中的上游關(guān)鍵因子,MyD88 是TLRs 的接頭蛋白,是TLR4 的下游因子,在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用[14]。 TLR4 被激活后與MyD88 相互作用,使其活化,并將信號傳遞給下游,后經(jīng)激酶磷酸化激活NF-κB 通路,誘導(dǎo)炎癥因子TNF-α、IL-6 等釋放,從而參與MMP 炎癥反應(yīng)[15-16]。 Segovia 等[2]首次證實了 NLRP3 是 MP感染過程中炎癥和先天免疫細胞反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。 Chen 等[17]證明了桑色素可通過抑制NF-κB信號通路減輕支原體肺炎。 Liu 等[18]也證實了金絲桃苷可通過抑制顯著NF-κB 信號通路降低MP 誘導(dǎo)的IL-8 和TNF-α 的表達,從而改善MPP,以上研究說明NLRP3 炎性小體與 NF-κB 信號通路是調(diào)控MPP 病理進程的潛在的有效靶點。 因此本研究利用Western Blot 檢測肺組織中NLRP3 炎性小體與NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白的表達,結(jié)果顯示,鼻腔滴注 MP 菌液后小鼠肺組織中 NLRP3、MyD88、NF-κB基因和 NLRP3、MyD88、NF-κB 蛋白表達含量顯著增加,說明 NLRP3 炎性小體和 NF-κB 信號通路參與了MPP 的炎癥反應(yīng),與文獻報道一致[2-3,17-18]。 而給予清肺透邪湯可顯著降低小鼠肺組織中NLRP3、MyD88、NF-κB 基因和 NLRP3、MyD88、NF-κB 蛋白表達含量,說明清肺透邪湯抑制炎癥因子釋放,減輕炎癥反應(yīng)與抑制NLRP3 炎性小體和NF-κB 信號通路有關(guān)。

綜上所述,清肺透邪湯改善MPP 小鼠的肺損傷,減輕炎癥反應(yīng)的機制可能與抑制NLRP3 炎癥小體和NF-κB 信號通路有關(guān),為清肺透邪湯抗MPP作用機制的研究提供了理論和實驗依據(jù)。 本研究只是初步探討了清肺透邪湯治療MPP 的可能機制,具體有效成分及具體分子作用機制仍需要進一步研究。