小鼠及獼猴Graves 病動(dòng)物模型的比較研究

王悅,張萌,趙鳳儀,伍麗萍,施秉銀

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科,西安 710061)

Graves 病(Graves’disease,GD)是一種常見(jiàn)的器官特異性自身免疫性疾病,人群患病率0.5% ～2%[1]。 臨床表現(xiàn)主要有甲狀腺毒癥、彌漫性甲狀腺腫大,部分伴有突眼或脛前粘液性水腫。 嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致病人發(fā)生重度心律失常、重度肝損害、重度肌萎縮及重度貧血等[2]。 在動(dòng)物活體水平建立真實(shí)反應(yīng)人類(lèi)疾病的疾病模型,對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制探討、在體功能研究、藥物新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和臨床前藥效學(xué)評(píng)價(jià)至關(guān)重要[3]。

近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)于GD 的疾病模型展開(kāi)了諸多探索。 穩(wěn)定表達(dá)促甲狀腺素受體(TSHR)的細(xì)胞在免疫佐劑的幫助下,能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生促甲狀腺素受體抗體(TRAb)升高、甲狀腺毒癥及甲狀腺病理等GD 相關(guān)表現(xiàn),但其操作的可能性較差且誘導(dǎo)成功率不穩(wěn)定[4]。 此后,研究者們更換了抗原的表達(dá)載體,發(fā)現(xiàn)表達(dá)TSHR 全長(zhǎng)的重組腺病毒可以獲得甲亢發(fā)生率為 30% ～ 50%的 BALB/c 小鼠[5]。 隨著“TSHR A 亞單位可能是 GD 發(fā)生的主要抗原”這一發(fā)病機(jī)制的重大發(fā)現(xiàn),研究者們利用表達(dá)TSHR A 亞單位的重組腺病毒將甲亢的發(fā)生率提高至60% ～80%[6-8]。 雖然近期有自發(fā)產(chǎn)生促甲狀素受體刺激性抗體(TSAb)的TSHR/NOD.H2h4轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的相關(guān)報(bào)道,但該小鼠甲狀腺激素水平正常,沒(méi)有甲狀腺功能亢進(jìn)癥狀,分析原因認(rèn)為該抗體是針對(duì)人TSHR 的,因此與小鼠體內(nèi)TSHR 結(jié)合比較微弱[9]。 因此,利用表達(dá) TSHR A亞單位的腺病毒免疫誘導(dǎo)模型是目前最為廣泛接受的GD 小鼠模型[4]。

但由于嚙齒類(lèi)動(dòng)物與人類(lèi)遺傳背景、免疫學(xué)、病理學(xué)特征上存在較大差異,Graves 病的一些典型臨床表現(xiàn)難以在小鼠模型中成功再現(xiàn),且醫(yī)藥轉(zhuǎn)化研究中,嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型也存在著不可忽視的局限性[10]。 為了突破嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型在免疫學(xué)研究中的局限性,非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物在免疫學(xué)研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。 其中,獼猴模型作為最常見(jiàn)的非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于包括感染免疫,免疫應(yīng)答,免疫衰老及自身免疫性疾病的研究領(lǐng)域中。 系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)模型已經(jīng)被陸續(xù)報(bào)道,給構(gòu)建獼猴的GD 動(dòng)物模型提供了可能性和寶貴的經(jīng)驗(yàn)[10]。

本研究旨在從GD 發(fā)病機(jī)制出發(fā),通過(guò)比較我們既往研究中小鼠及獼猴GD 動(dòng)物模型[11-12],一方面探討不同動(dòng)物GD 模型特點(diǎn)差異,另一方面基于不同動(dòng)物模型的特點(diǎn),為日后免疫治療新方法提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

16 只 6 周齡 SPF 級(jí)雌性 BALB/c 小鼠,體重約18 ～20 g,購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SCXK(陜)2018-001】,飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(陜)2015-002】,所有操作均符合西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物科研倫理要求(審批號(hào)：IACUC 2015036)。

12 只3 周歲普通級(jí)雌性獼猴,體重約3.8 ～4.0 kg,購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所【SCXK(滇)2017-0003】,飼養(yǎng)于空軍醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(陜)2019-001】。 單籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)室溫度控制在24 ～26℃,相對(duì)濕度控制于40% ～60%,自由活動(dòng)。 所有操作均符合陜西省林業(yè)廳生物科研倫理要求(審批號(hào)：IACUC 2011065)。 整體實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合3R 原則。

1.1.2 試劑與儀器

表達(dá)TSHR A 亞單位的重組腺病毒(A-sub-Ad)(深圳市百恩維生物科技有限公司,S2AD1005-1),對(duì)照病毒(con-Ad)(深圳市百恩維生物科技有限公司,P8V0034-2),碘[125I]- 甲狀腺素放射免疫分析藥盒(天津市協(xié)和醫(yī)藥科技集團(tuán)有限公司,RA10102),TRAb 滴度ELISA 法檢測(cè)(德國(guó)Medipan GmbH,3505),Treg 細(xì)胞檢測(cè)試劑盒(eBiosciences,A42925)。

正置光學(xué)顯微鏡(Olympus,BX53,日本),流式細(xì)胞儀(BD,FACSCalibur,美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及誘導(dǎo)GD 動(dòng)物模型

小鼠隨機(jī)分為造模組和對(duì)照組,采取國(guó)際公認(rèn)的腺病毒造模方案[5-6],造模組用表達(dá)TSHR A 亞單位的重組腺病毒進(jìn)行免疫(A-sub-Ad),對(duì)照組用對(duì)照病毒進(jìn)行免疫(con-Ad)。 小鼠造模組用PBS稀釋病毒原液,取50 μL 病毒稀釋液經(jīng)股四頭肌肌肉注射。 每只小鼠每次注射劑量為1 × 108vp,每三周免疫1 次,共3 次,于末次免疫后四周安樂(lè)死小鼠。 獼猴隨機(jī)分為造模組和對(duì)照組,造模組用PBS稀釋病毒原液,取1 mL 病毒稀釋液經(jīng)兩側(cè)股四頭肌肌肉注射,每側(cè)500 μL。 獼猴組的病毒用量是基于小鼠劑量通過(guò)體重和體表面積換算出的,每三周注射1 次,共5 次,于末次免疫后四周安樂(lè)死獼猴。 取小鼠和獼猴的外周血、甲狀腺、脾等組織測(cè)定T4、TRAb 及免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 甲狀腺激素、TRAb 測(cè)定

血清總甲狀腺素TT4 水平由放射免疫法檢測(cè)：含T4 的血清和125I 標(biāo)記的T4 與相應(yīng)的抗體反應(yīng)后形成抗原抗體復(fù)合物。 加入二抗和聚乙二醇,使免疫復(fù)合物沉淀并離心,使用γ 計(jì)數(shù)器測(cè)定沉淀物放射性強(qiáng)度。 最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到血清中T4 最終濃度。

TRAb 滴度ELISA 法檢測(cè)：含 TRAb 的血清加入包被著TSHR 蛋白的ELISA 板進(jìn)行孵育,隨后加入M22 單克隆抗體與TRAb 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TSHR。 加入二抗和辣根過(guò)氧化物酶,用四甲基聯(lián)苯胺進(jìn)行顯色,使用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD 值。 最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到血清中TRAb 最終濃度。

1.2.3 甲狀腺病理

甲狀腺組織用10%甲醛固定,石蠟包埋切片,HE 染色,光鏡下觀察其組織病理學(xué)改變。

1.2.4 流式細(xì)胞測(cè)定

使用流式染色緩沖液將脾或外周血單個(gè)核細(xì)胞重懸至每毫升5 × 106個(gè)。 Treg 細(xì)胞染色按照商品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,首先使用FITC 標(biāo)記的CD4 和APC標(biāo)記的CD25 進(jìn)行表面染色,固定破膜后使用PE 標(biāo)記的Foxp3 進(jìn)行核內(nèi)染色。 最后使用多通道流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),Cell Quest 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。 計(jì)量資料數(shù)據(jù)形式為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤( ˉx ± sˉx)。 兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn),檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以P＜0.05 表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 GD 小鼠及GD 獼猴體重變化

對(duì)照組和造模組小鼠體重平均值分別從(20.9± 0.7)g 和(19.7 ± 0.6)g,增長(zhǎng)為(26.5 ± 0.9)g和(26.6 ± 0.4)g,至整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束,兩組體重差異無(wú)顯著性(圖1A)。 而在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,對(duì)照組獼猴體重由(3.9 ± 0.2)kg 增長(zhǎng)至(4.0 ± 0.3)kg。而造模組中甲亢獼猴(3/6)體重從(3.9 ± 0.05)kg下降至(3.6 ± 0.2)kg(P ＜ 0.05)。 與 GD 小鼠體重前后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不同,GD 獼猴體重顯著下降,這說(shuō)明GD 獼猴出現(xiàn)了消瘦的臨床表現(xiàn)(圖1B)。從圖1C 可以看出,GD 小鼠至造模結(jié)束時(shí),單位攝食量下的體重增加顯著低于對(duì)照組[(1.1 ± 0.01)vs(1.5 ± 0.05),P ＜ 0.05],該結(jié)果說(shuō)明與對(duì)照小鼠相比,造模組小鼠攝入相同重量飼料,但其體重增長(zhǎng)顯著低于對(duì)照小鼠。 這可能是由于小鼠自身體重過(guò)輕,攝食量可以顯著影響體重的變化。 圖1D所示,對(duì)照組獼猴靜息心率維持在190 次/分左右,未出現(xiàn)明顯的波動(dòng)。 而造模組中甲亢獼猴(3/6)靜息心率由(192 ± 11)次/分上升至(255 ± 14)次/分(P ＜0.05),說(shuō)明GD 獼猴出現(xiàn)類(lèi)似GD 患者心動(dòng)過(guò)速的表現(xiàn)。

2.2 GD 小鼠及GD 獼猴TT4

造模結(jié)束時(shí),對(duì)照組和造模組小鼠TT4 平均值分別為(57.1 ± 2.9)μg/dL 和(96.7 ± 13.8)μg/dL,差異具有顯著性(P＜0.05)。 以對(duì)照小鼠TT4平均值 + 2 倍標(biāo)準(zhǔn)差為正常 TT4 上限(63.1 μg/dL),超過(guò)該上限判定甲亢。 造模組小鼠甲亢發(fā)生率為75%(圖2A)。 以對(duì)照獼猴血清TT4 平均值 +2 倍標(biāo)準(zhǔn)差為正常上限(5.72 μg/dL),超過(guò)該值視為甲亢。 在第3 次免疫結(jié)束聯(lián)周后,造模組6 只獼猴中有1 只獼猴出現(xiàn)了TT4 升高。 而在5 次免疫結(jié)束后兩周,造模組共3 只獼猴出現(xiàn)了TT4 升高,即甲亢發(fā)生率為50%(圖2B)。

2.3 GD 小鼠及GD 獼猴TRAb

造模結(jié)束時(shí),對(duì)照組和造模組小鼠血清TRAb平均值分別為(8.1 ± 0.6)IU/I 和(423.1 ± 61.4)IU/I,差異具有顯著性(P ＜ 0.05)。 以對(duì)照小鼠TRAb 平均值 + 2 倍標(biāo)準(zhǔn)差為正常TRAb 上限(9.3 IU/I),造模組小鼠TRAb 陽(yáng)性率達(dá)100%(圖3A)。以對(duì)照獼猴血清TRAb 的平均值 + 2 倍標(biāo)準(zhǔn)差為正常上限,ELISA 法大于0.06 IU/L 為陽(yáng)性,5 次免疫結(jié)束后,造模組6 只獼猴TRAb 100%陽(yáng)性(圖3B)。

2.4 GD 小鼠及GD 獼猴甲狀腺病理

光鏡下,對(duì)照小鼠或獼猴甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞呈低立方或者扁平狀,濾泡中中膠質(zhì)豐富。 造模組中6/8 只小鼠,3/6 只獼猴出現(xiàn)明顯的濾泡上皮增生呈立方狀或高柱狀,部分視野下還可觀察到由于增生導(dǎo)致的乳頭狀結(jié)構(gòu)凸入濾泡腔。 但小鼠及獼猴均未觀察到淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。 (圖4)

2.5 GD 小鼠及 GD 獼猴 Treg 細(xì)胞比例

與對(duì)照組小鼠相比(12.2 ± 0.5)%,造模組小鼠脾中CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞在CD4+T 淋巴細(xì)胞中的比例顯著降低(10.3 ± 0.6)%(圖5A,P＜0.05)。 在外周血和脾,造模組獼猴 CD4+CD25+FOXP 3+Treg 細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中的比例分別是(0.9 ± 0.3)% 和(0.6 ± 0.2)%,顯著低于對(duì)照組的(1.3 ± 0.1)% 和 (2.3 ± 0.5)%(圖 5B,P ＜0.05)。 但CD4+IL-17+ Th17 細(xì)胞在造模獼猴和對(duì)照獼猴中差異無(wú)顯著性(圖5B,P＞0.05)。

圖1 GD 小鼠及GD 獼猴的體重變化Figure 1 Body weight changes in GD mice and GD rhesus monkeys

圖2 GD 小鼠及GD 獼猴TT4Figure 2 TT4 levels of GD mice and GD rhesus monkeys

圖3 GD 小鼠及GD 獼猴TRAbFigure 3 TRAb levels of GD mice and GD rhesus monkeys

圖4 GD 小鼠及GD 獼猴甲狀腺病理切片F(xiàn)igure 4 Pathological sections of thyroid gland of GD mice and GD rhesus monkeys

2.6 GD 小鼠及GD 獼猴肝病理

GD 小鼠和獼猴身體機(jī)能處于穩(wěn)定狀態(tài)。 造模組與對(duì)照組小鼠、獼猴的肝在光鏡下未發(fā)現(xiàn)炎癥或其他病理學(xué)改變,包括細(xì)胞水腫或壞死等。 (圖6)

3 討論

理想的GD 動(dòng)物模型有以下特點(diǎn)：(1)自發(fā)模型優(yōu)于誘導(dǎo)的模型。 但目前唯一的自發(fā)模型TSHR/NOD.H2h4 轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生TSAb 周期較長(zhǎng),花費(fèi)較高,因此不方便廣泛推廣使用。 (2)可復(fù)制性。 表達(dá)TSHR 的質(zhì)粒誘導(dǎo)的GD 模型目前在世界多個(gè)實(shí)驗(yàn)室可重復(fù)性較低[5]。 (3)GD 發(fā)病率高,便于觀察病因及協(xié)助新治療。 (4)在多品系小鼠中可誘導(dǎo)GD 發(fā)生。 Shimojo 和M12 模型都只能在易感品系誘導(dǎo)GD。 綜合以上四點(diǎn),表達(dá)TSHR A 亞單位的腺病毒誘導(dǎo)GD 模型是目前被廣泛認(rèn)可,且重復(fù)性最好的模型[13]。

3.1 小鼠及獼猴GD 模型的成功構(gòu)建

本研究中,通過(guò)注射表達(dá)TSHR A 亞單位的重組腺病毒,獼猴造模組(注射5 次)和小鼠造模組(注射3 次)均出現(xiàn)了TRAb 陽(yáng)性,甲狀腺激素水平升高和甲狀腺組織顯著增生等表現(xiàn)。 此外,獼猴造模組還出現(xiàn)了體重下降和靜息心率增高等典型GD的臨床癥狀,小鼠造模組也出現(xiàn)了單位攝食量下的體重增加顯著下降。

圖5 GD 小鼠及GD 獼猴Treg 細(xì)胞比例Figure 5 Proportion of Treg cells in GD mice and GD rhesus monkeys

圖6 GD 小鼠及GD 獼猴肝病理切片F(xiàn)igure 6 Liver pathological sections of GD mice and GD rhesus monkeys

值得注意的是,獼猴造模組的GD 發(fā)生率是隨著注射次數(shù)等增加逐漸增高的,在第3 次免疫結(jié)束時(shí),獼猴造模組的TT4 升高率僅為16.7%,但是在第5 次免疫結(jié)束時(shí),獼猴造模組的TT4 升高率達(dá)到了50%。 我們未公布的數(shù)據(jù)顯示,繼續(xù)免疫下去,TT4 升高率會(huì)繼續(xù)增高。 這一結(jié)果間接證明了TSHR 是誘發(fā)GD 最有力的抗原也說(shuō)明在建立獼猴GD 模型時(shí),為了獲得更高的GD 發(fā)病率,可能需要延長(zhǎng)免疫時(shí)間和增加免疫次數(shù)。

3.2 GD 模型與Treg 細(xì)胞的關(guān)系

Treg 細(xì)胞是一類(lèi)以免疫抑制功能為特點(diǎn)的T淋巴細(xì)胞亞群[14]。 作為重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,其在自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程中起著核心的作用[15]。叉頭盒蛋白3(fork head box P3,Foxp3)是Treg 細(xì)胞發(fā)育和功能的重要調(diào)節(jié)因子[16]。 本研究中,小鼠GD 模型與獼猴 GD 模型均展現(xiàn)了 CD4+CD25+Foxp3+的Treg 細(xì)胞比例的顯著降低,這一結(jié)果與之前報(bào)道的GD 臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[17-19]。 這一現(xiàn)象再次佐證了Treg 細(xì)胞可能與GD 發(fā)病有關(guān),而這兩個(gè)動(dòng)物模型都是未來(lái)研究Treg 細(xì)胞與GD 的發(fā)病關(guān)系和針對(duì)Treg 細(xì)胞免疫療法的良好工具。

3.3 小鼠及獼猴GD 模型的比較

造模結(jié)束時(shí),獼猴造模組的6 只小鼠中有3 只出現(xiàn)了以上的現(xiàn)象(50%),而小鼠造模組的8 只小鼠中有6 只小鼠出現(xiàn)了以上的現(xiàn)象(75%),與報(bào)道的數(shù)據(jù)相符合[6-7]。 因此,小鼠造模組的GD 發(fā)病率略高于獼猴組,但沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 但在相同注射次數(shù)(三次注射)下,獼猴造模組的GD 發(fā)病率(16.7%)是顯著低于小鼠造模組的(P＜0.05)。這說(shuō)明在相同的免疫時(shí)間和次數(shù)的情況下,小鼠GD 模型的發(fā)病率更高。

與小鼠GD 模型相比,獼猴GD 模型會(huì)出現(xiàn)顯著的與人類(lèi)GD 患者類(lèi)似的臨床表現(xiàn),包括體重顯著降低和靜息心率的增加[20-21]。 另外,對(duì)比小鼠及獼猴的TT4、TRAb 水平的數(shù)據(jù)可以看出,小鼠TT4、TRAb 水平均顯著高于獼猴,這也可能是因?yàn)榉N屬不同而造成的生化差異,其中獼猴與人類(lèi)的數(shù)據(jù)更為接近[22-24]。

本研究中,在小鼠和獼猴模型造模時(shí)使用均為表達(dá)人TSHRA 的腺病毒。 事實(shí)上,在氨基酸水平上,人類(lèi)和小鼠TSHRs 的同源性約為87%,而人類(lèi)與獼猴TSHRs 的同源性高達(dá)97%。 有研究證實(shí),在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠TSHR 時(shí),人a 亞基免疫誘導(dǎo)的抗體的交叉反應(yīng)性較差[25]。 從造模機(jī)制的層面,GD 及并發(fā)癥尤其是甲狀腺功能亢進(jìn)性心臟病(甲亢心),其發(fā)病機(jī)制是靶器官分布的TSHR 受體與自身抗體的結(jié)合啟動(dòng)下游的反應(yīng)導(dǎo)致,我們有理由推測(cè),獼猴GD 模型在復(fù)制人類(lèi)GD 及其并發(fā)癥中更具備說(shuō)服力。

從模型的應(yīng)用來(lái)看,小鼠GD 模型具備造模時(shí)間教短、場(chǎng)地要求不高及實(shí)驗(yàn)成本較低的優(yōu)勢(shì),但對(duì)于更加深入的研究GD 的發(fā)病機(jī)制、尤其是并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制等還是有著不小的限制性。 而獼猴GD 模型從發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)、并發(fā)癥層面及與人類(lèi)GD 患者更加相似,尤其為GD 的并發(fā)癥的研究提供了切實(shí)可行的有效途徑及方案,隨著大動(dòng)物價(jià)格昂貴、飼養(yǎng)成本高、難以進(jìn)行規(guī)模化等問(wèn)題的逐漸被解決,其研究前景和應(yīng)用前景將極為廣闊[10]。

綜上所述,小鼠模型的GD 發(fā)生率略高于獼猴模型,但是經(jīng)過(guò)對(duì)基礎(chǔ)生理生化指標(biāo)和免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè),GD 獼猴顯示出更多的與人類(lèi)GD 患者類(lèi)似的表現(xiàn)及機(jī)制。 因此,我們應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求及經(jīng)費(fèi)安排,選擇適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型,從而更合理的完成預(yù)期目標(biāo)。