子宮內(nèi)膜異位癥纖維化小鼠模型構(gòu)建方法及其應(yīng)用

畢艷麗,倪喆鑫,李溪,俞超芹*

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203; 2. 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院,上海 200433)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EM)是子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)種植于子宮以外的一種慢性、雌激素依賴性疾病,在育齡期女性中發(fā)病率為10% ～15%[1-2]。 EM 雖是一種良性疾病,卻具有發(fā)病范圍廣、癥狀多樣、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)的惡性行為,至今其病因及發(fā)病機(jī)制仍不清楚。 目前EM 的治療手段主要包括手術(shù)和激素類(lèi)藥物,但療效均不理想。 因此,子宮內(nèi)膜異位癥是婦科學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。

子宮內(nèi)膜異位癥的病理學(xué)基礎(chǔ)為異位內(nèi)膜在體內(nèi)激素的作用下周期性剝脫出血,這種周期性出血長(zhǎng)期反復(fù)出現(xiàn)引起盆腔粘連、甚至纖維化。 研究顯示,80% 以上的EM 患者在初次手術(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)粘連形成,而術(shù)后 3 個(gè)月再粘連的發(fā)生率又可達(dá)50%[3-4]。 隨著疾病的進(jìn)展,盆腔粘連逐漸加重,由輕度EM 的亞臨床腹膜炎或輕度盆腔粘連,發(fā)展至重度EM 的嚴(yán)重而廣泛的粘連,形成盆腔纖維化,甚至冰凍盆腔,導(dǎo)致患者不孕、慢性盆腔痛,嚴(yán)重影響女性的身心健康。 然而,目前EM 盆腔纖維化的形成機(jī)制尚不清楚[5-6]。

構(gòu)建一種高效的子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型將有助于對(duì)本病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)和新藥的開(kāi)發(fā), 同時(shí)可以為探索子宮內(nèi)膜異位癥纖維化發(fā)病機(jī)制提供理想模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

90 只 SPF 級(jí) 6 周齡性成熟 BALB/c 雌小鼠,體重18 ～20 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】,飼養(yǎng)于上海長(zhǎng)海醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SCXK(滬)2017-0005】,溫度22 ～25℃,濕度55% ～60%,12 h光照和12 h黑暗交替,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。 所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵照動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定執(zhí)行并通過(guò)長(zhǎng)海醫(yī)院倫理委員會(huì)審查,批準(zhǔn)號(hào)：CHEC2019-127。

1.1.2 試劑與儀器

苯甲酸β-雌二醇(Sigma,E2758),實(shí)驗(yàn)用芝麻油(Acros organics,241002500),伊紅-蘇木精染色劑、小鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(TGF-β1)ELISA 檢測(cè)試劑盒(武漢博士德),兔抗鼠E-cadherin 抗體(CST,3195S),兔抗鼠Collagen I 抗體(Abcam,AB34710),兔抗鼠 α-SMA 抗體(Abcam,AB5694),兔抗鼠SMMHC-II 抗體(Abcam,AB53219)。

兩套眼科常規(guī)手術(shù)器械(剪刀、鑷子、止血鉗)、注射用生理鹽水、1 mL 注射器、20 mL 注射器、細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning,USA),RPMI-1640 培養(yǎng)基(Gibco,USA),低溫離心機(jī)、組織包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡(Olympus,Japan)等。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制

稱(chēng)取1.5 mg 苯甲酸β-雌二醇粉末以50 mL 實(shí)驗(yàn)用芝麻油溶解,配成濃度為30 μg/mL 的苯甲酸β-雌二醇溶液置4℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

造模前,每日定時(shí)對(duì)所有小鼠進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片(美藍(lán)染色法),連續(xù)觀察兩個(gè)動(dòng)情周期,選取動(dòng)情周期規(guī)律的小鼠用于實(shí)驗(yàn)。 90 只實(shí)驗(yàn)小鼠中48 只用于子宮內(nèi)膜異位癥模型建立,32 只作為假手術(shù)組,另外10 只作為空白對(duì)照,用于模型對(duì)比鑒定。 用于模型建立的48 只小鼠按照1 ∶2的比例隨機(jī)分為供體鼠16 只和受體鼠32 只。 32 只受體小鼠隨機(jī)分為4 組,每組8 只,分別為種植后1 周組、種植后2 周組、種植后4 周組和種植后6 周組。

1.2.3 建模方法

所述模型的建立方法,按如下步驟操作：

(1)注射雌激素：所有實(shí)驗(yàn)小鼠(包括供體鼠和受體鼠)頸背部皮下注射苯甲酸雌二醇溶液150 μg/kg,每4 天注射1 次,共注射兩次。

(2)從注射雌激素開(kāi)始至腹腔種植當(dāng)日,每日定時(shí)對(duì)供體鼠和受體鼠進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查,觀察小鼠動(dòng)情周期。 動(dòng)情周期判斷依據(jù)如下：動(dòng)情前期：圓形或橢圓形的有核上皮細(xì)胞為主,夾有少量角化細(xì)胞和白細(xì)胞;動(dòng)情期：幾乎全是無(wú)核的角化細(xì)胞;動(dòng)情后期：角化細(xì)胞減少,出現(xiàn)有核上皮細(xì)胞和白細(xì)胞;動(dòng)情間期：細(xì)胞少而皺縮,白細(xì)胞為主。

(3)種植前標(biāo)本準(zhǔn)備：供體小鼠的子宮取出用預(yù)冷的生理鹽水清洗血液和粘液,將子宮一分為二分別放入盛有0.5 mL 預(yù)冷的RPMI1640 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,用眼科剪將子宮縱向剖開(kāi),剝離子宮內(nèi)膜層并迅速將其剪成體積≤1 mm3的內(nèi)膜碎片制成懸浮液備用。

(4)腹腔注射內(nèi)膜：受體小鼠腹部皮膚消毒后,以1 mL 注射器針筒接20 mL 注射器針頭,以小鼠下腹部正中尿道口上方0.5 cm 處為進(jìn)針點(diǎn),將子宮內(nèi)膜碎片注射入受體小鼠腹腔,針孔處涂抹適量青霉素軟膏預(yù)防感染,供體鼠與受體鼠數(shù)量比為1 ∶2。從取出供體小鼠子宮到注射子宮內(nèi)膜碎片入受體小鼠所有操作應(yīng)在5 min 內(nèi)連續(xù)完成,全程保持無(wú)菌。 假手術(shù)組注射雌激素的方法與模型組相同,不同的是,假手術(shù)組腹腔注射的是等體積的供體小鼠的腹腔脂肪組織。

(5)種植后處理：腹腔種植內(nèi)膜當(dāng)日開(kāi)始對(duì)受體小鼠頸背部皮下注射苯甲酸β-雌二醇溶液150 μg/kg,每4 天注射1 次,共注射兩次,之后待內(nèi)膜自然生長(zhǎng)。

1.2.4 觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

分別于造模后第1 周末、第2 周末、第4 周末、第6 周末脫頸法隨機(jī)處死模型組小鼠和假手術(shù)組小鼠各8 只,經(jīng)75%乙醇消毒后以2 mL 預(yù)冷的生理鹽水注入小鼠腹腔,腹部充分按摩后收集腹腔灌洗液,取出腹腔種植物,從以下方面觀察和檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。

(1)觀察種植物形態(tài)：開(kāi)腹后觀察小鼠腹腔種植物的生長(zhǎng)部位、形態(tài)、顏色、體積等。 之后放入4%多聚甲醛溶液,室溫固定24 h 后常規(guī)石蠟包埋切片做HE 染色,觀察種植物病理組織形態(tài)學(xué)特征。

(2)測(cè)量種植物體積：種植物取出后用游標(biāo)卡尺測(cè)量其長(zhǎng)度、寬度與高度,按公式V=Π/6×長(zhǎng)×寬×高[7],計(jì)算種植物體積。

(3)腹腔粘連評(píng)分：采用Blauer 粘連評(píng)分系統(tǒng)對(duì)小鼠腹腔粘連程度進(jìn)行評(píng)分[8-9]。 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分,無(wú)粘連;1 分,盆腔輕微的膜狀粘連;2 分,粘連致密,通常宮角與腸管和膀胱均有粘連;3 分,粘連更致密,范圍更廣,雙側(cè)宮角均與腸管和膀胱粘連,子宮尚有一定活動(dòng)度;4 分,嚴(yán)重的粘連,雙側(cè)宮角均與腸管和膀胱粘連,子宮固定不動(dòng)。 粘連評(píng)分由兩位實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立進(jìn)行,取兩位實(shí)驗(yàn)人員所評(píng)分?jǐn)?shù)的平均值作為最終粘連評(píng)分。

(4)TGF-β1 表達(dá)水平：2 mL 離心管收集模型組小鼠腹腔灌洗液,4℃,2000 rpm,離心15 min,留取上清,-80℃冰箱保存。 ELISA 試劑盒檢測(cè)小鼠腹腔灌洗液TGF-β1 表達(dá)水平。

(5)Masson 染色：常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟,Masson 三色染色液浸泡15 ～20 min;常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。 顯微鏡下觀察種植物膠原纖維沉積情況,評(píng)估種植物膠原沉積程度。

(6)免疫組化：常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟,抗體孵育、封片。 纖維化相關(guān)蛋白抗體 E-cadherin(1 ∶400)、Collagen I(1 ∶200)、α-SMA(1 ∶200)、SMMHCII(1 ∶300)的表達(dá)情況,評(píng)估種植物纖維化情況。 顯微鏡下觀察免疫組化染色切片,染色區(qū)域內(nèi)顯示為黃棕色或黃褐色為陽(yáng)性表達(dá),每張切片高倍鏡下拍攝三個(gè)不同視野,將采集的所有圖像應(yīng)用Image pro Plus 6.0 圖像分析軟件進(jìn)行分析,計(jì)算每張圖像上陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域的累積光密度(sum IOD),再測(cè)量對(duì)應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域的面積(area of interest,AOI),以平均光密度(mean IOD)值作為該圖像陽(yáng)性表達(dá)的定量標(biāo)準(zhǔn),反映圖像上免疫反應(yīng)物的表達(dá)強(qiáng)度。 平均光密度(mean IOD)= 累積光密度(sum IOD)/陽(yáng)性區(qū)域面積(AOI)。 每個(gè)樣品拍攝的三張圖像分析的平均光密度(mean IOD)再作一次平均,作為這個(gè)樣品的平均光密度(mean IOD)。 針對(duì)每個(gè)樣本的平均光密度(mean IOD)值,用t 檢驗(yàn)或單因素方差分析比較各組蛋白表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料比較,滿足方差分析條件者,采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較用SNK 法;若不滿足方差分析條件者,采用多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H Test)。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差( ˉx ± s)表示,以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,使用GraphPad Prism 5.0 對(duì)數(shù)據(jù)處理作圖。

2 結(jié)果

2.1 小鼠陰道脫落細(xì)胞學(xué)觀察

小鼠動(dòng)情周期為4 ～5 d,具有規(guī)律的性周期,動(dòng)情前期：圓形或橢圓形的有核上皮細(xì)胞為主,夾有少量角化細(xì)胞和白細(xì)胞;動(dòng)情期：幾乎全是無(wú)核的角化細(xì)胞;動(dòng)情后期：角化細(xì)胞減少,出現(xiàn)有核上皮細(xì)胞和白細(xì)胞;動(dòng)情間期：細(xì)胞少而皺縮,白細(xì)胞為主。 如圖1 所示,不同動(dòng)情周期小鼠陰道脫落細(xì)胞涂片(美藍(lán)染色)。 在內(nèi)膜種植當(dāng)日小鼠動(dòng)情周期較一致,處于動(dòng)情前期。

2.2 種植物形態(tài)學(xué)觀察

小鼠腹腔子宮內(nèi)膜異位灶大多數(shù)生長(zhǎng)在腸系膜上,其次為脾下、腹壁、子宮附近,與周?chē)M織輕中度粘連。 異位灶為囊性不規(guī)則形態(tài),有的呈半透明色,有的呈暗紅色,囊內(nèi)含淡黃色或半透明液體,囊壁表面有細(xì)小血管形成,囊壁邊緣有少量結(jié)締組織,病灶直徑范圍1 ～10 mm 不等(圖2),造模后1 周即見(jiàn)典型的子宮內(nèi)膜異位灶,造模成功率為100%。 組織病理學(xué)觀察種植物可見(jiàn)生長(zhǎng)良好的腺體和間質(zhì),腺體數(shù)目較正常在位子宮內(nèi)膜明顯減少,囊腔內(nèi)可見(jiàn)炎性細(xì)胞。(圖2)

圖1 小鼠陰道脫落細(xì)胞染色(美藍(lán)染色,× 100)Figure 1 Methylene blue staining of mouse vaginal exfoliated cells(× 100)

圖2 種植物形態(tài)和小鼠子宮內(nèi)膜HE 染色Figure 2 Morphology and diameter of ectopic lesions and HE staining of endometrium

2.3 種植物體積比較

如圖3 所示,隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),EM 模型小鼠腹腔種植物數(shù)量無(wú)明顯變化,但體積呈先增大后縮小再增大的趨勢(shì),其中造模后2 周較造模后1 周體積顯著縮小,差異具有顯著性(P＜0.05);造模后4 周、造模后6 周種植物體積與造模后2 周比較再次增大,造模后4 周與造模后1 周種植物體積比較,差異不具有顯著性(P＞0.05);造模后6 周與造模后1 周種植物體積比較,差異具有顯著性(P ＜0.05)。 假手術(shù)組小鼠腹腔脂肪組織稍有增多,均未見(jiàn)明顯腹腔種植物。

2.4 腹腔粘連評(píng)分

隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),假手術(shù)組(對(duì)照組)不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠腹腔粘連評(píng)分比較,差異不具有顯著性。 模型組小鼠腹腔粘連程度有逐漸加重趨勢(shì),與造模1 周的小鼠腹腔粘連評(píng)分相比,造模后2 周、4 周、6 周的小鼠腹腔粘連評(píng)分均有顯著性增加(P＜0.05,P＜0.001,P＜0.001),造模后6 周的小鼠腹腔粘連評(píng)分最高。 (圖4)

注：與造模后1 周比較,*P＜0.05。圖3 小鼠腹腔種植物體積Note. Compared with 1 week after modeling,*P＜0.05.Figure 3 Volume of ectopic lesions in mice

2.5 腹腔灌洗液 TGF-β1 表達(dá)

ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示(圖5),假手術(shù)組(對(duì)照組)小鼠腹腔灌洗液TGF-β1 表達(dá)水平在腹腔注射后不同時(shí)間變化不顯著(P ＞0.05)。 模型組小鼠腹腔灌洗液TGF-β1 表達(dá)水平在造模后呈先升高后降低再升高的趨勢(shì),其中造模后1 周較造模當(dāng)日TGF-β1 表達(dá)水平顯著升高(P ＜0.05),造模后2 周較造模后1 周TGF-β1 表達(dá)水平有輕度降低,造模后4周到6 周TGF-β1 表達(dá)水平再次顯著性升高(P ＜0.05)。

2.6 種植物Masson 染色

Masson 染色后肌纖維呈紅色,膠原纖維呈藍(lán)色,細(xì)胞核呈黑褐色,顯微鏡下觀察種植物膠原纖維沉積明顯,隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),膠原纖維沉積有增多趨勢(shì)。 (圖6)

注：與造模后1 周比較,*P＜0.05,***P＜0.001。圖4 小鼠腹腔粘連評(píng)分Note. Compared with 1 week after modeling,*P＜0.05,***P＜0.001.Figure 4 Score of pelvic adhesion in mice

2.7 免疫組化

免疫組化染色結(jié)果顯示,纖維化相關(guān)蛋白E-cadherin、Collagen I、α-SMA、smooth muscle myosin heavy chain 11(SMMHC-II)于在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜均有陽(yáng)性表達(dá)(圖7)。 在位內(nèi)膜,E-cadherin 主要表達(dá)于子宮腺體上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜,呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)且分布均勻,Collagen I 主要表達(dá)于子宮上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì),α-SMA 和SMMHC-II 主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜肌層的平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,子宮間質(zhì)部分幾乎不表達(dá)。 異位內(nèi)膜,E-cadherin 在上皮細(xì)胞膜表達(dá)弱陽(yáng)性,Collagen I 表達(dá)在上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)但分布無(wú)明顯規(guī)律,α-SMA 和SMMHC-II 在整個(gè)異位組織中可見(jiàn)廣泛陽(yáng)性表達(dá),分布無(wú)明顯規(guī)律(圖7)。 應(yīng)用Image pro Plus 6.0 圖像分析軟件分析染色切片的平均光密度,結(jié)果見(jiàn)表1。

注：與造模后1 周比較,*P＜0.05。圖5 小鼠腹腔灌洗液TGF-β1 表達(dá)水平Note. Compared with 1 week after modeling,*P＜0.05.Figure 5 Concentration of TGF-β1 in peritoneal lavage fluid

圖6 造模后腹腔種植物Masson 染色結(jié)果(× 200)Figure 6 Masson staining results of peritoneal plants after modeling(× 200)

圖7 在位子宮內(nèi)膜和造模后異位種植物免疫組化染色結(jié)果(× 200)Figure 7 Immunohistochemical staining results of eutopic endometrium and ectopic plants after modeling(× 200)

表1 正常子宮和異位種植物免疫組化染色圖像的平均光密度( , n=8)Table 1 Mean IOD of immunohistochemical staining images of normal uterus and ectopic plants ( , n=8)

注：與正常在位子宮內(nèi)膜相比,△P ＜ 0.05,△△P ＜ 0.01。 與造模后 1 周種植物相比,*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01。Note. Compared with normal uterus endometrium,△P ＜ 0.05,△△P ＜ 0.01. Compared with ectopic plants,*P ＜ 0.05,**P＜ 0.01.

images/BZ_30_236_2262_2240_2311.png正常 Control 0.3366 ± 0.0188 0.0579 ± 0.0144 0.1389 ± 0.0254 0.0361 ± 0.0119 1 周 1 week 0.3159 ± 0.0181△ 0.0509 ± 0.0088△ 0.1623 ± 0.0200△ 0.0382 ± 0.0062△△2 周 2 weeks 0.2604 ± 0.0172** 0.1283 ± 0.0167* 0.2536 ± 0.0253** 0.0651 ± 0.0116*4 周 4 weeks 0.1228 ± 0.0245** 0.2600 ± 0.0160** 0.3674 ± 0.0019** 0.1662 ± 0.0199**6 周 6 weeks 0.0628 ± 0.0121** 0.3592 ± 0.0161** 0.4882 ± 0.0259** 0.2025 ± 0.0148**

3 討論

目前除人類(lèi)外,只有靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物可以自發(fā)形成子宮內(nèi)膜異位癥,但由于代價(jià)昂貴、造模成功率低等原因,應(yīng)用受限。 嚙齒類(lèi)動(dòng)物由于經(jīng)濟(jì)實(shí)用、動(dòng)情周期短、成模率高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛使用。 常用的嚙齒類(lèi)動(dòng)物子宮內(nèi)膜異位癥造模方法主要有同源內(nèi)膜腹膜縫合法、同源內(nèi)膜腹腔注射法、同源內(nèi)膜皮下注射法等,但以上方法均有不足之處。 腹膜縫合法需要開(kāi)腹手術(shù),操作繁瑣,動(dòng)物感染幾率大、死亡風(fēng)險(xiǎn)高。 另外,更重要的是,腹膜縫合法不能避免手術(shù)因素對(duì)疾病模型的影響,不適于子宮內(nèi)膜異位癥這種自發(fā)性疾病的研究。 單純的子宮內(nèi)膜皮下注射法雖操作簡(jiǎn)單,但造模部位不符合臨床子宮內(nèi)膜異位癥的好發(fā)部位。 單純的腹腔注射法雖比較符合臨床子宮內(nèi)膜異位癥的好發(fā)部位,但是不能很好地模擬子宮內(nèi)膜異位癥雌激素依賴的臨床特征,且造模成功率較低。 另外,還有用人子宮內(nèi)膜種植的方法,雖能夠觀察人子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病特征,但是為避免異體排斥反應(yīng),模型需使用裸鼠,而裸鼠免疫功能缺陷,不能模擬正常免疫狀態(tài)下的疾病情況。 本模型所采用的BALB/c 小鼠基因與人高度相似,遺傳背景明確,重復(fù)性好,價(jià)格經(jīng)濟(jì),飼養(yǎng)方便,多用于腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等的研究。 本模型具有以下優(yōu)勢(shì)：采用皮下注射雌激素的方法人為地將小鼠的動(dòng)情周期同步化,之后在動(dòng)情前期注射子宮內(nèi)膜,使異位內(nèi)膜在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)同步化;腹腔注射法種植子宮內(nèi)膜,以小鼠下腹部正中尿道口上方0.5 cm 處為進(jìn)針點(diǎn),該處對(duì)應(yīng)的腹腔內(nèi)容物主要為脂肪組織,進(jìn)針容易,出血概率低,降低了小鼠死亡風(fēng)險(xiǎn);本發(fā)明內(nèi)膜種植后按照小鼠動(dòng)情周期規(guī)律皮下注射雌激素,促進(jìn)異位內(nèi)膜的生長(zhǎng),模擬了子宮內(nèi)膜異位癥雌激素依賴的發(fā)病特征;本發(fā)明腹腔注射法避免了開(kāi)腹手術(shù)對(duì)模型的影響,最大程度地降低了手術(shù)創(chuàng)傷造成小鼠盆腔纖維化的可能性,為探索正常免疫狀態(tài)下子宮內(nèi)膜異位癥盆腔纖維化的發(fā)病機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

Blauer 粘連評(píng)分系統(tǒng)是一種公認(rèn)的腹腔粘連評(píng)分方法,廣泛用于EM 模型腹腔內(nèi)粘連的分級(jí)和評(píng)價(jià),該方法使用簡(jiǎn)便,應(yīng)用性強(qiáng)。 本研究使用Blauer粘連評(píng)分系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)EM 模型小鼠腹腔粘連程度隨造模時(shí)間的推移有加重趨勢(shì),造模4 ～6 周粘連明顯,可作為EM 動(dòng)物模型腹腔粘連和纖維化研究的時(shí)間參考。

TGF-β1 是目前發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)促纖維化因子[10-12],能夠活化多種細(xì)胞,促使細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)并促進(jìn)組織中膠原纖維沉積,最終導(dǎo)致組織纖維化。 本研究顯示EM 模型小鼠腹腔灌洗液TGF-β1水平隨造模時(shí)間逐漸升高,提示TGF-β1升高可作為EM 模型盆腔纖維化的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。 本研究結(jié)果顯示造模第2 周的種植物體積有輕度縮小且腹腔灌洗液TGF-β1 水平較造模1 周相比有下降趨勢(shì),其原因可能是異位內(nèi)膜種植在小鼠腹腔后激發(fā)的局部炎性反應(yīng),促炎因子和抑炎因子均反應(yīng)性升高,激活體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,短時(shí)間內(nèi)抑制了異位內(nèi)膜的生長(zhǎng),后期TGF-β1 再次升高可能是異位內(nèi)膜在多種細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞交互調(diào)節(jié)后繼續(xù)侵襲和生長(zhǎng)的結(jié)果。 研究顯示TGF-β1 在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,TGF-β1可能影響T輔助細(xì)胞(Th)的分化,產(chǎn)生更多IL-17和IL-10,可能會(huì)間接影響腹腔炎癥反應(yīng),與更高的IL-1β 和IL-6水平相關(guān),子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液中TGF-β1可能促進(jìn)異位病灶的形成[13-14]。

Masson 染色是組織纖維染色中最經(jīng)典的一種方法,可以顯示組織中膠原纖維的沉積情況,是纖維化相關(guān)研究常用的一種染色方法[15-16]。 本研究發(fā)現(xiàn),EM 模型小鼠腹腔種植物膠原纖維沉積明顯,且隨時(shí)間推移膠原沉積有逐漸增多趨勢(shì),提示Masson 染色可作為EM 模型腹腔異位灶纖維化的一種評(píng)價(jià)方法。

E-cadherin 即e-鈣粘蛋白,是上皮細(xì)胞的標(biāo)記蛋白,正常上皮細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性,主要定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞間質(zhì),分布均勻,可維持細(xì)胞間緊密連接,具有抑制細(xì)胞活動(dòng),阻止細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的功能,在發(fā)生纖維化的組織中E-cadherin 在上皮細(xì)胞的表達(dá)明顯減弱[17-18]。 本研究發(fā)現(xiàn)與在位內(nèi)膜相比,異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞的 E-cadherin 表達(dá)明顯減弱。Collagen I 即I 型膠原蛋白,廣泛分布在細(xì)胞外基質(zhì),是組織纖維化過(guò)程細(xì)胞分泌的一種重要的蛋白,其過(guò)度沉積造成不可逆的組織纖維化[19-21]。α-SMA即α-平滑肌肌動(dòng)蛋白,目前被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志,SMMHC-II 即平滑肌肌動(dòng)蛋白重鏈II,廣泛表達(dá)于平滑肌細(xì)胞,若過(guò)度表達(dá)則提示組織處于纖維化的病理狀態(tài),二者常應(yīng)用于纖維化疾病的研究[22-23]。 本研究中由于異位內(nèi)膜的上皮、間質(zhì)、肌層結(jié)構(gòu)紊亂,平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞錯(cuò)雜分布,界限模糊,α-SMA 和SMMHC-II 呈廣泛強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。 本研究結(jié)果顯示,子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型的腹腔種植物免疫組化染色E-cadherin、Collagen I、α-SMA、SMMHC-II 均呈陽(yáng)性表達(dá),其中 E-cadherin隨著時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)逐漸減弱,Collagen I、α-SMA、SMMHC-II 隨著時(shí)間的延長(zhǎng),表達(dá)有逐漸增強(qiáng)趨勢(shì),以造模后 4 ～6 周的表達(dá)最顯著。 故 E-cadherin、Collagen I、α-SMA、SMMHC-II 均可應(yīng)用于子宮內(nèi)膜異位癥纖維化的實(shí)驗(yàn)研究,且造模4 ～6 周纖維化表現(xiàn)較明顯。

綜上所述,本模型的建立方法具有操作簡(jiǎn)便、造模周期短、成功率高的特點(diǎn)。 造模后移植的內(nèi)膜仍保持子宮間質(zhì)和腺體的組織形態(tài),增殖活性好,模型穩(wěn)定,能夠廣泛應(yīng)用于子宮內(nèi)膜異位癥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥纖維化機(jī)制研究、新藥開(kāi)發(fā)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。