脂多糖誘導(dǎo)SD 大鼠膝關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞炎癥模型建立及特征分析

熊 翱, 熊仁平,彭 艷, 李 宇, 江 旭,許建中*

(1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科,鄭州450052;2. 中國(guó)人民解放軍陸軍特色醫(yī)學(xué)中心野戰(zhàn)外科研究部,重慶400042)

纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)是關(guān)節(jié)滑膜的主要細(xì)胞之一[1]。 生理狀態(tài)下的FLS 參與潤(rùn)滑和免疫調(diào)節(jié)功能,維持關(guān)節(jié)腔穩(wěn)態(tài),參與關(guān)節(jié)的正常功能[2];滑膜炎癥狀態(tài)下的FLS,由關(guān)節(jié)保護(hù)作用轉(zhuǎn)變?yōu)殛P(guān)節(jié)破壞作用,分泌炎癥介質(zhì),使滑膜免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。 免疫細(xì)胞誘導(dǎo)滑膜纖維化和滑膜新生血管形成[3],加重FLS 的促炎狀態(tài),導(dǎo)致蛋白酶和促炎細(xì)胞因子增加[4],逐步導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失。所以,滑膜 FLS 在炎性關(guān)節(jié)病(inflammatory joint disease,IJD)中的作用研究越來(lái)越受到重視。 但要對(duì)FLS 進(jìn)行深入研究,首先要解決的問題,是建立滑膜FLS 的原代培養(yǎng)及其病理模型。

有研究者通過手術(shù)時(shí)獲取傷病患的關(guān)節(jié)滑膜分離原代培養(yǎng)滑膜細(xì)胞進(jìn)行FLS 研究[5-6],但獲取病人滑膜的影響因素多,為IJD 的FLS 研究增加了難度。 據(jù)此,有學(xué)者采用手術(shù)和化學(xué)法(木瓜蛋白酶、單碘乙酸鈉和膠原酶等)誘導(dǎo)OA 模型[7],分離其滑膜FLS,偏重于骨關(guān)節(jié)退行性變的研究;有學(xué)者采用膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)[8],分離其滑膜 FLS,偏重于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)的發(fā)病機(jī)制和治療研究;有學(xué)者建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜成纖維細(xì)胞(AA-FLS)[9],偏重于類風(fēng)濕藥物研究,等等。 國(guó)內(nèi)外學(xué)者從誘導(dǎo)的各類動(dòng)物疾病模型中分離出的FLS,對(duì)FLS 的鑒定,絕大多數(shù)采用的是形態(tài)觀察以及組織化學(xué)染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FLS 的蛋白標(biāo)志物波形蛋白(Vimentin),只有極少數(shù)進(jìn)行了FLS 的細(xì)胞增殖功能鑒定[6]。 但他們都沒有進(jìn)行原代培養(yǎng)的正常FLS 和誘導(dǎo)模型的FLS 特征蛋白檢測(cè)和分析。

不論是OA,還是RA 和強(qiáng)制性脊椎炎等IJD,都要釋放促炎因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等[10-11],并且這些炎癥因子與信號(hào)通路之間存在級(jí)聯(lián)反應(yīng),通過各種途徑促使IJD 的發(fā)生發(fā)展。 促炎因子不僅參與炎癥生成階段的調(diào)節(jié),且在隨后的炎癥消退中也發(fā)揮重要作用。 促炎因子已被確定為炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)[11]。 鑒于此,若能誘導(dǎo)出FLS 的炎癥模型,勢(shì)必對(duì) IJD 的抑炎研究提供了工具。 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌壁外壁的組成成分,是由脂質(zhì)和多糖構(gòu)成的物質(zhì)。 當(dāng)其作用于人類或動(dòng)物等其他生物細(xì)胞時(shí),就會(huì)表現(xiàn)出多種生物活性。 LPS 是動(dòng)物免疫系統(tǒng)對(duì)入侵的革蘭氏陰性菌的首要識(shí)別及攻擊目標(biāo),它能夠誘導(dǎo)動(dòng)物分泌多種炎性細(xì)胞因子,如 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等,廣泛用于動(dòng)物疾病建模。 國(guó)內(nèi)外學(xué)者,通過小鼠乳頭乳導(dǎo)管灌注0.2 mg/mL 的LPS 50 μg 成功誘導(dǎo)小鼠乳腺炎模型[12],D-氨基半乳糖聯(lián)合LPS 腹腔注射8 周,隔日1 次,成功誘導(dǎo)了小鼠慢性肝損傷模型[13]。 OA 和 RA 的研究中,LPS 制激上調(diào)了IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的蛋白水平[11,14]。 由此可見,LPS 制激FLS 可以模仿類似于OA 和RA 的炎癥環(huán)境。 在IJD 體外研究中,用 LPS 誘導(dǎo) FLS 炎癥狀態(tài),建立FLS 炎癥模型在理論上是可行的。

本研究通過分離SD 雄性大鼠的膝關(guān)節(jié)滑膜組織,原代培養(yǎng)至第 3 代,進(jìn)行 FLS 蛋白標(biāo)志物Vimentin 和增殖功能鑒定,同時(shí),用滑膜組織作為對(duì)照,檢測(cè)原代培養(yǎng)FLS 的特征蛋白的表達(dá),篩選具有生理功能且純度達(dá)95%的FLS,用LPS 進(jìn)行FLS炎癥模型誘導(dǎo),檢測(cè)其促炎細(xì)胞因子和特征蛋白的表達(dá),建立FLS 炎癥模型,為IJD 發(fā)病機(jī)制及其治療研究提供實(shí)驗(yàn)工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4 周齡 SPF(specific pathogen free animals)級(jí)雄性SD 大鼠45 只,體重約為100 g,購(gòu)于陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(軍)2017-0026】,飼養(yǎng)于陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(軍)2017-0058】。 所有操作均符合陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(審批號(hào)：AMUWEC20201267),嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 儀器與試劑

顯微外科手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械有限公司),25 cm2培養(yǎng)瓶(Hyclone), 0.22 μm 濾器(millipore),CO2培 養(yǎng) 箱 (Thermo, 美 國(guó)), MillicellREZISLIDE(Millipore)。 戊巴比妥鈉(德國(guó)進(jìn)口分裝),DMEM(high glucose)(BI), 雙抗(GiBco), 0.25%胰酶(GiBco),4% 多聚甲醛(博士德),Anti-vimentin(Abcam, ab8978)。 Anti-mouse Alexa Fluor 488(Abcam,ab15017),DAPI(Abcam,ab228549),小鼠SP試劑盒(中杉金橋),DAB 染色試劑盒(中杉金橋)。Western Blot 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和試劑(Bio Rad,美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 滑膜細(xì)胞的獲取與原代培養(yǎng)

采用腹腔注射1.5% 戊巴比妥鈉麻醉SD 大鼠,劑量為2 mL/(kg·bw)。 75%乙醇浸泡大鼠10 ～20 min,取雙側(cè)后膝關(guān)節(jié)(圖 1A、1B)。 先后用自來(lái)水和含雙抗(100 μ/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin)的PBS 沖洗膝關(guān)節(jié)后,轉(zhuǎn)移膝關(guān)節(jié)至超凈工作臺(tái)盛有含雙抗的PBS 平皿中,進(jìn)行滑膜組織分離。 分離條件：冰浴,無(wú)菌,PBS 浸泡,銳性。 剪碎滑膜組織至1mm × 1mm × 1mm,將其移至10 mL無(wú)菌離心管短暫低速離心, 棄上清,加入 1 mL 0.2% Ⅰ型膠原酶重懸滑膜組織,轉(zhuǎn)移其至25 cm2培養(yǎng)瓶,用0.2% Ⅰ型膠原酶定容至3 mL,輕晃培養(yǎng)瓶,使其底部滑膜組織均勻分布。 在37℃和5%CO2下,消化滑膜組織4 ～6 h,使其變成棉絮狀,向培養(yǎng)瓶加入10% FBS 終止消化。 收集滑膜組織轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管,短暫低速離心,棄上清,加入完全培養(yǎng)基重懸洗滌一次后,移至25 cm2培養(yǎng)瓶,用高糖完全培養(yǎng)基(含雙抗)定容至3 mL,輕晃培養(yǎng)瓶,使滑膜組織在底部均勻分布。 在37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)滑膜組織,每天觀察細(xì)胞游出情況,第2 天可見梭形細(xì)胞游出(圖1C),2 ～3 d 換液一次。

1.2.2 滑膜細(xì)胞傳代

待原代培養(yǎng)細(xì)胞融合度達(dá)70% ～80%,吸棄培養(yǎng)基。 向培養(yǎng)瓶加入含EDTA-2Na 的0.25%胰酶消化,輕晃培養(yǎng)瓶,使消化液覆蓋瓶底,輕拍瓶底,幫助消化。 倒置顯微鏡觀察到細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞回縮變圓且懸浮時(shí),向培養(yǎng)瓶加入10% FBS 終止消化。 收集細(xì)胞至離心管,短暫低速離心。 完全培養(yǎng)基洗滌1 次,再用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,混勻,按1 ∶2～1 ∶3傳代至新的無(wú)菌培養(yǎng)瓶中。

1.2.3 滑膜細(xì)胞鑒定

(1) 細(xì)胞形態(tài)觀察

在倒置顯微鏡下,每天觀察滑膜細(xì)胞的形態(tài),生長(zhǎng)狀態(tài)。 梭形為FLS,圓形、橢圓形為巨噬樣滑膜細(xì)胞。 觀察每代梭形細(xì)胞占視野細(xì)胞中的比例,目測(cè)FLS 的純度。

(2) 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色

第3 代滑膜細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞比例為4 × 104/mL,按每孔0.2 mL 的容量接種至腹腔小室,培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。 向腹腔小室加入 4%多聚甲醛 300 μL, 固定20 min 后,PBS 洗 2 ～ 3 次。 用 0.2% Triton X-100,在37℃下透化20 min 后,向腹腔小室加入鼠抗Vimentin 抗體(1 ∶200),4℃濕盒孵育過夜,加入熒光488 抗鼠 IgG(1 ∶500),在 37℃ 下 避光孵育 1 h 后,用DAPI 對(duì)細(xì)胞核染色(37℃)15 min 后,用防熒光淬滅劑封片。 熒光顯微鏡觀察并拍照。 根據(jù)所測(cè)滑膜細(xì)胞中Vimentin 染色情況,判斷FLS 的純度。如滑膜細(xì)胞中染色Vimentin 的細(xì)胞在98%以上,即98% 以上的細(xì)胞為FLS。

(3) 細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色

第3 代滑膜細(xì)胞參照細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色加入鼠抗Vimentin 單抗,下面步驟按小鼠SP 試劑盒說明書進(jìn)行。 DAB 顯色后顯微鏡下觀察拍照分析。判斷滑膜細(xì)胞FLS 純度的方法同(2)。

(4) FLS 的EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)

注：A：SD 正常大鼠。 B：膝骨關(guān)節(jié)滑膜分離。 C：滑膜細(xì)胞培養(yǎng)第 1 天(×10)。 D：滑膜細(xì)胞培養(yǎng)第 6 天第 1 代傳代前(×10)。 E：滑膜細(xì)胞培養(yǎng)至第 3 代(× 10)。 F：滑膜細(xì)胞培養(yǎng)至第 8 代(× 10)。 G-M：滑膜細(xì)胞培養(yǎng)至第 3 代 Vimentin 熒光化學(xué)鑒定(× 40,標(biāo)尺 = 25 μm)(G：Vimentin,綠色;L：DAPI,藍(lán)色; M： Merge)。 N-P：滑膜細(xì)胞培養(yǎng)至第 3 代 Vimentin 組織化學(xué)鑒定(×40,標(biāo)尺 = 50 μm)(N：Vimentin 為棕黃色,DAPI 缺失;O：DAPI 為藍(lán)色,Vimentin 缺失;P：Vimentin 為棕黃色,DAPI 為藍(lán)色即細(xì)胞核)。圖1 SD 大鼠正?；ぜ?xì)胞原代培養(yǎng)及其鑒定Note. A, SD normal rats. B,Synovium of knee joint was separated. C,Synovial cells cultured on day 1(× 10). D,Synovial cells were cultured on the 6th day before the first passage(× 10). E, Synovial cell culture to the third generation. F, Synovial cell culture to the eighth generation(× 10). GM, Fluorescence identification of vimentin from synovial cell culture to the third generation (×40, bar = 25 μm)(G, Vimentin, green. L, DAPI,blue. M,Merge). N-P,Histochemical identification of vimentin from synovial cell culture to the third generation(× 40,bar = 50 μm)(N, Vimentin is brownish yellow, DAPI is absent. O, DAPI is blue, vimentin is absent. P, vimentin is brownish yellow, DAPI is blue, i.e. nucleus).Figure 1 Primary culture and identification of normal synovial cells of SD rats

參照EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)(廣州銳博生物科技有限公司,產(chǎn)品編號(hào)： C10310-1)說明書完成。 簡(jiǎn)述如下：第七代滑膜細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞比例為4 × 104/mL,按每孔0.2 mL 的容量接種至腹腔小室,培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。 用細(xì)胞完全培養(yǎng)基按 1000 ∶1稀釋 EdU 溶液,制備成 50 μmol/L EdU 培養(yǎng)基;每孔加入100 μL 50 μmol/L 培養(yǎng)基孵育12 h。 向腹腔小室加入含4%多聚甲醛的 PBS 300 μL 固定 30 min。 用 0.5% Triton X-100 滲透劑孵育 10 min 后,每孔加入 100 μL Apollo?染色反應(yīng)液,脫色搖床孵育30 min。 用100 μL 0.5% Triton X-100 滲透劑脫色搖床清洗2 ～3次,每次 10 min。 在 37℃下,用 100 μL 1 × Hoechst 33342 對(duì) DNA 避光染色 25 min,PBS 洗 2 ～ 3 次,用防熒光淬滅劑封片。 熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 LPS 制激 FLS

采用鑒定純度超過98%的FLS,細(xì)胞比例為4 × 104/mL, 按每孔0.2 mL 容量接種至腹腔小室,培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。 向腹腔小室加入LPS,使其終濃度為1000 ng/mL(經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得),制激FLS 細(xì)胞24 h。 在 0、1、3、6、12、24 h 的時(shí)間點(diǎn),分別用0.25%的胰酶消化FLS 2 ～5 min,用10% FBS 終止消化,各收集細(xì)胞5 例,貯于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Western Blot 測(cè)定FLS 中的細(xì)胞因子和特征蛋白表達(dá)

收集滑膜組織和培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且純度達(dá)到98%的第 3 ～ 8 代 FLS 及其經(jīng) 1000 ng/mL LPS 制激不同時(shí)間觀測(cè)點(diǎn)的細(xì)胞,各5 例,提取總蛋白?？捡R斯亮藍(lán)法定量總蛋白,調(diào)整樣品總蛋白終濃度為 1.5 mg/mL。 每孔上樣 20 μL,SDS-PAGE 電泳分離。 0.3A 恒流濕轉(zhuǎn)50 min 或1.5 h,將凝膠電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,PVDF 膜置入6%脫脂奶粉封閉。 PVDF 膜經(jīng)封閉洗膜后,加入兔抗 IL-1β、TNF-α、PCNA、Collagen IV、 Fibronectin、 VEGF、 Lubricin 和Hyaluronan Synthose 2 多抗,按 1 ∶1000 稀釋。 使PVDF 膜與上面相應(yīng)的一抗,在室溫孵育50 min 或1.5 h。 再次洗膜后,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG(1 ∶10 000),使 PVDF 膜 與 之 在 室 溫 孵 育50 min, ECL 法檢測(cè)。 檢測(cè)完畢,用 0.01 mol/L pH 7.2 的 PBS 洗滌 PVDF 膜 2 次 × 15 min,用抗體洗脫液(pierce 公司)洗脫P(yáng)VDF 膜上抗體,1 次× 15 min,同上法洗膜和封閉后,用辣根過氧化物酶標(biāo)記的甘油三磷酸脫氫酶(glycerol 3 phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(1 ∶10 000),與 PVDF在室溫孵育50 min,ECL 法檢測(cè)。 掃描分析軟件系統(tǒng)掃描X 射線光片蛋白條帶進(jìn)行密度分析。 結(jié)果采用目的蛋白的光密度值與GAPDH 內(nèi)參蛋白的光密度值比值校正上樣量誤差。

1.2.6 QRT-PCR 檢測(cè) IL-1β 和 TNF-α mRNA 基因變化

將用終濃度為1000 ng/mL 的LPS 制激FLS 后收集的細(xì)胞,采用TRIzol 法提取總RNA,promega 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑合成 cDNA,用 IL-1β (Forward：5′-CCTTGTGCAAGTGTCTGAAG-3′; Reverse： 5′- GGG CTTGGAAGCAATCCTTA-3′)、TNF-α (Forward： 5’-CAAGGAGGAGAAGTTCCCA-3’;Reverse： 5’-TTGG TGGTTTGCTACGACG-3’)和 GAPDH (Forward： 5’-TCTTCCAGGAGCGAGATCCC-3 ’; Reverse： 5 ’-TTCAGGTGAGCCCCAGCCTT-3’)引物[15]去擴(kuò)增,分析 IL-1β 和 TNF-α mRNA 的表達(dá)。 復(fù)管,重復(fù) 5 次。qRT-PCR 反應(yīng)體系：2 × master mix(promega 公司)10 μL, 消毒水 7 μL, primer 0.5 μL,cDNA 2 μL。 PCR條件：95℃,10 s 變性,PCR 優(yōu)化的退火溫度,59℃,15 s 退火,40 個(gè)循環(huán)。 55℃ to 95℃ 觀察melt cure。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx ± s)表示,兩組間數(shù)據(jù)比較采用 t 檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。 以P ＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 滑膜細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況

分離的滑膜組織經(jīng)培養(yǎng)6 ～8 h 后,開始貼壁,1 d 后細(xì)胞游出,絕大部分為梭形(圖1C),圓形、橢圓形較少。 培養(yǎng)第 6 天,細(xì)胞融合度達(dá) 70% ～80%,貼壁生長(zhǎng),但仍有極少的圓形、橢圓形細(xì)胞(圖1D)。 培養(yǎng)第12 ～ 14 天,已傳至第3 代的滑膜細(xì)胞形態(tài)基本上全為梭形,圓形、橢圓形等其他形狀基本消失(圖1E)。 第8 代滑膜細(xì)胞增長(zhǎng)緩慢,形態(tài)從梭形變?yōu)榻茩E圓形,細(xì)胞間隙增大(圖1F)。 滑膜細(xì) 胞 第 3 ～ 7 代, 增 殖 活 躍, 生 長(zhǎng) 情 況 良好(圖1G-M)。

2.2 滑膜細(xì)胞的免疫熒光化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色

I 型膠原酶消化法獲得的滑膜細(xì)胞第3 代,用免疫染色觀察：形態(tài)規(guī)則,呈梭形,其細(xì)胞核為卵圓形且位于細(xì)胞中央;滑膜細(xì)胞Vimentin 染色陽(yáng)性率大于98%(圖 1G-P)。 Vimentin 為 FLS 特征性標(biāo)注蛋白,提示培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞為FLS,且純度達(dá)98%以上。

2.3 原代滑膜細(xì)胞的增值功能檢測(cè)

對(duì)第7 代滑膜細(xì)胞的EdU 增殖實(shí)驗(yàn),顯示細(xì)胞具有增殖能力(圖2A,B)。 通過對(duì)滑膜組織和第3 ～8 代各代滑膜細(xì)胞的增殖核抗原PCNA 蛋白的Western Blot 檢測(cè)分析,各代培養(yǎng)細(xì)胞同滑膜組織一樣,都有增殖功能。 與第3 代比較,除第8代 PCNA 蛋白表達(dá)下調(diào)(t = -51.056,**P ＜0.01),差異具有顯著性外,余各代差異不具有顯著性(圖2C,D)。

2.4 滑膜組織和滑膜FLS 的細(xì)胞因子和特征蛋白檢測(cè)

通過原代培養(yǎng)滑膜組織而獲得的FLS,與滑膜組織一樣,都能表達(dá)具有天然免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子和特征蛋白。 與第 3 代 FLS 的 IL-1β 和 TNF-α 蛋白表達(dá)量比較,第 4 ～ 7 代的每代 FLS 的 IL-1β 和 TNF-α 蛋白表達(dá)差異不顯著,第 8 代 FLS 的 IL-1β 和 TNF-α 蛋白表達(dá)下調(diào),差異具有顯著性(圖3A-C)。 原代培養(yǎng)獲得的FLS 具有分泌對(duì)關(guān)節(jié)囊有修復(fù)作用的結(jié)締組織成分,與第3 代FLS 比較,第4 ～ 7 代的每代FLS分泌Collagen IV 和Fibronectin 蛋白水平差異不顯著,第 8 代 FLS 分泌 Collagen IV 和 Fibronectin 蛋白的能力下降,差異顯著(圖4A-C)。 同時(shí),原代培養(yǎng)獲得的FLS 還有產(chǎn)生與滑膜組織一樣的Lubricin 和Hyaluronan Synthose 2 蛋白的能力,與第 3 代 FLS 比較,第4 ～7 代的每代FLS 分泌功能沒有顯著差異,第8 代分泌功能減弱,差異顯著(圖4A、D 和 E)。 綜合對(duì)原代培養(yǎng)滑膜細(xì)胞獲得的FLS 的細(xì)胞因子和特征蛋白檢測(cè)結(jié)果,確定滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)的第3 ～7代FLS 可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.5 LPS 制激 FLS 后不同時(shí)間點(diǎn)炎癥因子的mRNA 和蛋白的表達(dá)

1000 ng/mL 的 LPS 制激 FLS 后,與 0 h 相比較,IL-1β 和 TNF-α mRNA 的表達(dá)迅即上升,在 3 h達(dá)到高峰,其均值是0 h 的17.865 倍和19.177 倍,隨后下降,但仍高于 0 h(圖 5A,B)。 同時(shí),IL-1β 和TNF-α 在蛋白質(zhì)上的表達(dá),與0 h 相比較也迅即上調(diào),在6 h 達(dá)到高峰,但與3 h 比較無(wú)顯著差異,6 h的 IL-1β 和 TNF-α mRNA 蛋白表達(dá)與 GAPDH 內(nèi)參蛋白表達(dá)的比值是1.003 和1.380,隨后下降。 6 h后但仍高于0 h(圖 5C,D)。 綜合 LPS 制激 FLS 后的細(xì)胞因子IL-1β 和TNF-α 在基因和蛋白質(zhì)上的表達(dá)情況,確定LPS 制激FLS 的時(shí)間為3 h,制激FLS的LPS 終濃度為1000 ng/mL,完成LPS 誘導(dǎo)FLS 的炎癥模型。

2.6 LPS 制激FLS 后3 h 細(xì)胞因子和特征蛋白的表達(dá)

1000 ng/mL LPS 制激FLS 3 h,與制激前比較,細(xì)胞因子IL-1β 和 TNF-α 在蛋白質(zhì)上上調(diào)顯著,增殖核抗原PCNA 蛋白增加明顯(圖6A);Collagen IV和Lubricin 蛋白表達(dá)增加且差異顯著,具有修復(fù)關(guān)節(jié)囊作用的結(jié)締組織成分Fibronectin 蛋白明顯下調(diào)(圖 6B);Hyaluronan Synthose 2、VEGF 和 Cadherin蛋白表達(dá)增加且差異顯著(圖6C)。

3 討論

建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體內(nèi)和體外模型,目的都是為了更好地研究疾病的發(fā)病機(jī)制、治療方法及其效果評(píng)價(jià),但動(dòng)物的選擇要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和研究目的來(lái)確定,同時(shí)還要兼顧實(shí)驗(yàn)時(shí)間的長(zhǎng)短、動(dòng)物飼養(yǎng)成本的高低、操作難易程度等。 為了研究RA 的滑膜增生,陳芳等[16]改良了組織塊法,分離培養(yǎng)了兔膝關(guān)節(jié)FLS。 滑膜炎癥是 OA 和 RA 等 IJD 的共同病理過程,其動(dòng)物模型,應(yīng)選擇動(dòng)物成熟期短,能滿足較短的實(shí)驗(yàn)周期,且生存及抗感染能力較強(qiáng)的動(dòng)物。 據(jù)統(tǒng)計(jì),目前1/4 OA 動(dòng)物模型選擇大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[17]。 大鼠模型能模擬人類IJD 發(fā)病機(jī)制和病理過程,且具有操作方便易行、穩(wěn)定性高、干擾因素少等特性。 本實(shí)驗(yàn)不僅是建立滑膜FLS 原代培養(yǎng)方法,更重要的是建立FLS 炎癥模型,所以我們選擇了SPF 級(jí)SD 大鼠。 建模獲得成功,為研究IJD 提供了良好的實(shí)驗(yàn)條件。

注：A：滑膜組織(ST)及其原代培養(yǎng)第 3 代 ～ 第 8 代 FLS 的 IL-1β、TNF-α 及其 GAPDH 的 Western Blot 結(jié)果。 B：各組 IL-1β 蛋白相對(duì)含量。組間單因素方差分析,F = 5.115,P = 0.002。 IL-1β 蛋白表達(dá)相對(duì)光密度值,與第3 代FLS 比較,第8 代FLS 降低非常顯著(t = -5.639,**P＜0.01)。 ST、第4 代 ～ 第7 代FLS 變化差異不具有顯著性。 C：各組TNF-α 蛋白相對(duì)含量。 組間單因素方差分析, F = 8.672,P ＜0.001。TNF-α 蛋白表達(dá)相對(duì)光密度值,與第3 代FLS 比較,第8 代 FLS 降低非常顯著,**P ＜ 0.01。 ST、第4 代 ～ 第 7 代 FLS 變化差異不具有顯著性。圖3 滑膜組織和滑膜FLS 的細(xì)胞因子Western Blot 檢測(cè)分析Note. A, Western Blot results of IL-1β, TNF-α and GAPDH in synovium tissue (ST) and primary synovium cells after passage. B, One-way ANOVA between IL-1β protein groups, F = 5.115, P = 0.002. Compared with the expression of IL-1β protein in the third generation FLS, the expression of IL-1β protein in the eighth generation FLS decreased significantly (t = -5.639,**P ＜ 0.01). There was no significant difference between the ST, the fourth generation to the seventh generation FLS and the third generation FLS. One way ANOVA between TNF-α protein groups,F = 8.672,P ＜ 0.001.Compared with the expression of TNF-α protein in the third generation FLS, the expression of TNF -α protein in the eighth generation FLS decreased significantly(**P ＜0.01). There was no significant difference between the ST, the fourth generation to the seventh generation FLS and the third generation FLS.Figure 3 Western Blot analysis of cytokines in synovial tissue and FLS

在OA 和RA 等IJD 中,由于可溶活性因子和細(xì)胞表面的相互作用激活FLS,合成并釋放促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 等,激活免疫系統(tǒng),從免疫防御轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咂茐?破壞關(guān)節(jié),改變關(guān)節(jié)正常功能[18]。越來(lái)越多的研究[19]顯示：IJD 滑液促炎因子分泌增加,滑膜明顯增厚,其FLS 異常增殖和侵襲。 IJD 中潤(rùn)滑素水平降低,透明質(zhì)酸分子的數(shù)量下降,滑液的潤(rùn)滑能力也下降,增高了磷脂水平,脂肪鏈變短,不能有效減輕關(guān)節(jié)活動(dòng)的摩擦力[20]。 促炎因子在炎癥模型的高表達(dá),是模擬炎癥病理狀態(tài)的關(guān)鍵。尤欣等[21]以hIL-1β 為炎癥抗原誘導(dǎo)兔膝關(guān)節(jié)炎,檢測(cè)到關(guān)節(jié)滑膜組織hIL-1β mRNA 的表達(dá),滑膜組織呈結(jié)節(jié)樣增生,關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度與注入關(guān)節(jié)腔的MFG hIL-1β 轉(zhuǎn)染兔滑膜細(xì)胞數(shù)目成正相關(guān)。 熊樂等[22]向大鼠坐骨神經(jīng)斷端顯微注射LPS(2 g/L)1 μL,術(shù)后 1.5 h 和 24 h 的 IL-1β mRNA 和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)mRNA 的表達(dá)明顯升高。運(yùn)用 LPS 誘導(dǎo)乳腺炎模型[12],導(dǎo)致 IL-1β、IL-6、TNF-α 等促炎因子釋放異常增加,加重炎癥。 LPS作為炎癥抗原,LPS 激活了固有的免疫系統(tǒng),可通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)激活單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、FLS、上皮細(xì)胞等合成和釋放多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì),具有良好的一致性和重復(fù)性[12]。 利用LPS 制激FLS 促進(jìn)促炎因子的分泌,可以誘導(dǎo)出FLS 的炎癥病理過程,LPS 誘導(dǎo)的FLS 炎癥模型,符合IJD 的基本特征[20]。

注：A 和 B：顯示用 2-△△CT表示 IL-1β 和 TNF-α mRNA 的相對(duì)表達(dá)含量。 單因素方差分析結(jié)果：IL-1β 的 F = 172.477,P ＜ 0.0001。 與 0 h比較,其余各觀察時(shí)間點(diǎn)均**P ＜ 0.01,3 h 為其表達(dá)峰值(17.865 ± 1.754);TNF-α 的F = 162.478,P ＜ 0.0001。 與0 h 比較,其余各觀察時(shí)間點(diǎn)均**P ＜ 0.01,3 h 為其表達(dá)峰值(19.177 ± 1.317)。 C 和 D：IL-1β 和 TNF-α 蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。 單因素方差分析結(jié)果：IL-1β 的F = 28.694,P ＜0.0001,與0 h 比較,1 h 和24 h 觀察時(shí)間點(diǎn)的P 值分別為0.057 和0.078,其余各觀察時(shí)間點(diǎn)均**P ＜0.01,6 h 為其表達(dá)峰值(1.003 ± 0.096);TNF-α 的 F = 175.03,P ＜ 0.0001,與 0 h 比較,1 ～ 24h 觀察時(shí)間點(diǎn)均**P ＜ 0.01,6 h 為其表達(dá)峰值(1.380 ±0.099)。圖5 熒光qRT-PCR 法和Western Blot 法檢測(cè)1000 ng/mL LPS 制激FLS 后不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β 和TNF-α 的表達(dá)(n = 5)Note. A and B show the relative expression data of IL-1β and TNF-α mRNA with 2-△△CT. In statistical analysis, One-way ANOVA of IL-1β, F =172.477, P ＜ 0.0001, compared with 0 h,**P ＜ 0.01 at other observation time points, 3 h was its expression peak (17.865 ± 1.754); F =162.478, P ＜ 0.0001 of TNF-α. Compared with 0 h observation time point,P value of other observation time points were less than 0.01,3 h was its expression peak (19.177 ± 1.317) . C and D showed the Western Blot analysis of IL-1β and TNF-α protein. One-way ANOVA of IL-1β, F = 28.694, P ＜0.0001. Compared with 0 h, P value of 1 h and 24 h observation time points were 0.057 and 0.078, respectively. P value of other observation time points were less than 0.01,6 h was its expression peak (1.003 ± 0096)(C) . One-way ANOVA of TNF-α protein,F = 175.03,P＜ 0.0001. Compared with 0 h,**P ＜ 0.01 at 1-24 h, and the peak value was (1.380 ± 0.099) at 6 h (D).Figure 5 Detection of IL-1β and TNF-α expression at different time points after FLS stimulation with 1000 ng/mL LPS by fluorescence QRT- PCR and Western Blot (n = 5)

IJD 的主要特征是促炎因子 IL-1β、IL-6、TNF-α高表達(dá),通過一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和激活各類信號(hào)通路,調(diào)節(jié)下游因子,促使 IJD 的發(fā)生和加劇,直至關(guān)節(jié)破壞。 IJD 的臨床癥狀是關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和關(guān)節(jié)殘廢[14]。 軟骨降解在IJD 的發(fā)病中起著重要作用,絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號(hào)通路是軟骨降解的主要途徑。促炎因子是激活p38-MAPK 信號(hào)通路的主要因素之一,MAPK 信號(hào)通路的異常激活又可促進(jìn)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解酶的釋放,從而加速軟骨退化[23]。 體外 FLS 炎癥模型的建立,對(duì) MAPK 信號(hào)通路研究提供了工具。 IL-1β 是IJD 首要致病因子之一,其可通過制激產(chǎn)生磷酸化的p38-MAPK 來(lái)合成大量NO,反饋激活 MAPK 通路,促進(jìn) IL-1β 的產(chǎn)生,增加前列腺素E2 及環(huán)氧化酶-2(COX-2)的水平,引起軟骨損傷。 TNF-α 可介導(dǎo)多種炎癥因子,可以與p38-MAPK 形成正反饋環(huán)路,活化的 p38-MAPK 通路可促進(jìn) TNF-α 的表達(dá),過度表達(dá) TNF-α可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。 這些促炎因子通過各種途徑激活信號(hào)通路,促使 IJD 的發(fā)生發(fā)展。 NF-κB 信號(hào)通路影響著OA、RA 等IJD 炎癥反應(yīng)的各個(gè)階段。NF-κB 信號(hào)通路參與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)并且與KOA 患者淤血狀態(tài)密切相關(guān)。 淤血和患處新生毛細(xì)血管是關(guān)節(jié)疼痛的重要因素。 NF-κB 信號(hào)通路也是軟骨降解進(jìn)程中的關(guān)鍵分子途徑,其通過促進(jìn) MMP-1、MMP-2、MMP-3 等多種降解酶的分泌及COX-2、NO 等分解代謝因子的合成,加劇關(guān)節(jié)炎軟骨的凋亡和軟骨的炎癥反應(yīng)[24]。 TNF-α 對(duì)FLS 的增殖有促進(jìn)作用,可使滑膜組織纖維樣變并增加滑液中的炎癥因子,加重病情。 FLS 還具有類似腫瘤細(xì)胞增殖的特性,可突破生理屏障侵入軟骨和骨,導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞。 FLS 入侵體參與FLS 與軟骨的附著,其內(nèi)富含基質(zhì)金屬蛋白酶,可特異性地使細(xì)胞外基質(zhì)變性[25]。 LPS 既是炎癥抗原,又是NF-κB 的激動(dòng)劑,運(yùn)用 LPS 誘導(dǎo)體外FLS 炎癥模型的建立,有利于進(jìn)行信號(hào)通路的干預(yù),探討如何降低IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF 和 MMP 等蛋白的表達(dá),從而減弱或抑制住IJD 誘導(dǎo)的疼痛和炎癥,延緩或阻止關(guān)節(jié)退變,達(dá)到治療的目的。

注：A：1000 ng/mL LPS 制激FLS 3 h,與制激前比較,IL-1β 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高,t = -6.817,**P ＜0.01;TNF-α 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高 ,t =-11.443,**P ＜0.01;PCNA 蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào),t =-17.801,**P ＜0.01。 B：1000 ng/mL LPS 制激 FLS 3 h,與制激前比較,Collagen IV蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào),t = -6.702,**P ＜0.01;Lubricin 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高,t = -5.686,**P ＜0.01;Fibronectin 蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào),t= 2.518,*P ＜0.05。C：1000 ng/mL LPS 制激FLS 3 h,與制激前比較,Hyaluronan Synthose 2(HYS2)蛋白相對(duì)表達(dá)量升高,t = -4.364,**P＜0.01;VEGF 蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào),t = -16.668,**P ＜0.01;Cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào),t = -7.637,**P ＜0.01。圖6 Western Blot 法檢測(cè)1000 ng/mL LPS 誘導(dǎo)FLS 后3 h 細(xì)胞因子和特征蛋白的表達(dá)Note. A, 1000 ng/mL LPS stimulated FLS for 3 h, compared with that before stimulation,the relative expression of IL-1β protein was increased,t =-6.817,**P ＜ 0.01; the relative expression of TNF-α protein was increased, t = -11.443,**P ＜ 0.01; the relative expression of PCNA protein was increased, t = -17.801,**P ＜0.01. B, 1000 ng/mL LPS stimulated FLS for 3 h, compared with that before stimulation, the relative expression of collagen IV protein was increased, t = -6.702,**P ＜ 0.01; the relative expression of lubricin protein increased, t = - 5.686,**P ＜0.01; the relative expression of fibronectin protein decreased, t = 2.518,*P ＜0.05. C, 1000 ng/mL LPS stimulated FLS for 3 h, compared with that before stimulation, the relative expression of hyaluronan synthose 2 (HYS2) protein increased,t = -4.364,**P ＜0.01;the relative expression of VEGF protein increased, t = -16.668,**P ＜ 0.01; the relative expression of cadherin protein was up-regulated, t = -7.637,**P ＜ 0.01.Figure 6 Detection of the expression of cytokines and characteristic proteins in 3 hours after FLS stimulation with 1000 ng/mL LPS by Western Blot

綜上所述,本研究建立的SD 大鼠正常膝關(guān)節(jié)滑膜FLS 原代培養(yǎng)方法,FLS 純度高,成本低,來(lái)源容易,重現(xiàn)性好,操作簡(jiǎn)單,實(shí)驗(yàn)時(shí)間可控。 關(guān)鍵是第3 ～7 代FLS 具有宿主骨關(guān)節(jié)滑膜組織中的FLS的生理功能,且能分泌具有關(guān)節(jié)囊修復(fù)作用的結(jié)締組織成分,還能合成透明質(zhì)酸和潤(rùn)滑素等保證關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定的物質(zhì)。 LPS 能誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的滑膜組織FLS 分泌促炎細(xì)胞因子和誘導(dǎo)IJD 特征蛋白的表達(dá)改變,復(fù)制出IJD 的基本特征。 總之,LPS 誘導(dǎo)的FLS 炎癥模型可作為體外研究IJD 的細(xì)胞模型。