蛋白免疫印跡的發(fā)展和應用

吳妮妮 周濤

【摘 ?要】蛋白免疫印跡（Western Blot）是分子生物學和蛋白質(zhì)組學中最常用的技術(shù)之一，最初建立于20世紀70年代末，至今仍被積極使用。傳統(tǒng)蛋白免疫印跡方法存在著分辨率低、假條帶、靈敏度低和蛋白質(zhì)完整性差等缺點。多年來，蛋白免疫印跡的技術(shù)一直在不斷更新，致力于更快地獲得準確的結(jié)果。蛋白免疫印跡也能對多種疾病的進行檢測，改進蛋白免疫印跡靈敏度和重復性，才能更大程度上實現(xiàn)其在臨床上的應用。

【關(guān)鍵詞】Western Blot;免疫印跡;蛋白質(zhì);抗體

Western blot是一種常用的蛋白質(zhì)檢測方法，可以提供目標蛋白的半定量或定量數(shù)據(jù)，也可用于檢測蛋白的表達。免疫印跡法由Southern Blot進化而來，后者用于檢測凝膠電泳分離的DNA片段中的特定DNA序列[1]。20世紀70年代末，Towbin等人（1979）利用聚丙烯酰胺-尿素凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。伯內(nèi)特（1981）后來使用了更廣泛使用的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），最終導致這種方法被稱為Western Blot[2]。

通過使用蛋白免疫印跡，研究人員能夠從提取的復雜蛋白質(zhì)混合物中識別出特定的來自細胞的蛋白質(zhì)。這項技術(shù)使用三個要素來完成這項任務：（1）按大小分離，（2）轉(zhuǎn)移到固體載體上，（3）用適當?shù)囊豢购投箻擞洶械鞍?。這些結(jié)果被轉(zhuǎn)移到一種膜上，為每種蛋白質(zhì)產(chǎn)生一條帶。然后，該膜與特定目的蛋白質(zhì)的標簽抗體一起孵育。未結(jié)合抗體被洗掉，只剩下與抗體結(jié)合的目的蛋白質(zhì)。然后通過顯影膠片檢測結(jié)合抗體由于抗體只與目的蛋白質(zhì)結(jié)合，所以只有一條帶是可見的。條帶的厚度與蛋白質(zhì)的存在量相對應;因此，需要做一個標準對照可以指示蛋白質(zhì)的存在量[3]。

蛋白免疫印跡技術(shù)的發(fā)展

20世紀70年代末建立的蛋白免疫印跡技術(shù)至今仍在積極應用。然而，這種傳統(tǒng)的蛋白免疫印跡方法存在著分辨率低、假條帶、靈敏度低和蛋白質(zhì)完整性差等缺點，近年來的進展極大地改進了標準蛋白免疫印跡方法的許多方面，以產(chǎn)生更高質(zhì)量和定量的數(shù)據(jù)。雙Tris凝膠系統(tǒng)是傳統(tǒng)Laemmli系統(tǒng)的替代品，不僅可以使蛋白質(zhì)更好分離，保持蛋白質(zhì)完整性，分辨率更高，并將電泳時間縮短至35分鐘。此外，iBlot干吸系統(tǒng)通過減小電極之間的距離來提高傳輸速度，在7分鐘內(nèi)顯著提高了蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上的效率和速度。該傳輸系統(tǒng)較傳統(tǒng)方法提高了效率，減少了轉(zhuǎn)移時間[4]。雖然化學發(fā)光技術(shù)是蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)檢測中最常見和最傳統(tǒng)的技術(shù)，但雙色紅外熒光檢測能大大提高靈敏度、質(zhì)量，以及數(shù)據(jù)的準確性。這種檢測方法利用紅外激光在700nm和800nm兩種最佳波長下激發(fā)，生成信號最大的清晰數(shù)據(jù)圖像比率和最高敏感度。因此，兩個靶蛋白可以同時在同一膜上使用700nm和800nm的熒光檢測通道可視化[5]。

蛋白免疫印跡的臨床應用

蛋白免疫印跡技術(shù)可以從鑒定復雜混合物中的特定蛋白質(zhì)到直接檢測單個細胞中的蛋白質(zhì)，通過單細胞Western印跡，可以在復雜的細胞群中同時分析大約2000個細胞中的細胞-細胞變異。隨著完整細胞成像的整合，該技術(shù)允許在化療藥物柔紅霉素治療的人膠質(zhì)母細胞瘤細胞中，在異質(zhì)性腫瘤細胞群體中識別單個耐藥腫瘤細胞及其亞型的蛋白質(zhì)表達變化[6]。隨著雙向凝膠分離技術(shù)的應用以及通過肽質(zhì)量指紋識別蛋白質(zhì)，使得臨床相關(guān)幽門螺桿菌在相關(guān)胃?。晕秆?、十二指腸潰瘍）中的分析成為可能[7]。

蛋白免疫印跡通常用于臨床診斷各種寄生蟲和真菌疾病，應用于先天性弓形蟲病的早期和敏感診斷[8]，并被用于嚴重感染性疾病副球蟲?。≒CM）[9]的快速和敏感血清學診斷。在一項研究中，該試驗成功地用于農(nóng)民肺?。‵LD）的可靠血清學診斷，F(xiàn)LD是一種由吸入抗原顆粒引起的肺部疾病。因此，該技術(shù)可用于FLD的臨床快速常規(guī)診斷[10]。

因此，隨著進一步提高蛋白免疫印跡的靈敏度和重復性，蛋白免疫印跡技術(shù)的臨床應用將繼續(xù)向前發(fā)展，為人類的疾病診斷提供重要的技術(shù)支持。

參考文獻：

[1]He M，Herr AE. Polyacrylamide gel photopatterning enables automated protein immunoblot in a two-dimensional microdevice. J Am Chem Soc，2010;132（8），2512–2513.

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[6]Kang CC，Lin JM，Xu Z，Kumar S，Herr AE. Single-cell Western blot after whole-cell imaging to assess cancer chemotherapeutic response. Anal Chem，2014;86（20），10429–10436.

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[8]Perenha-Viana MC，Gonzales IA，Brockelt SR，Machado LN，Svidzinski TI. Serological diagnosis of paracoccidioidomycosis through a Western blot technique. Clin Vaccine Immunol，2012;19（4），616–619.

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