豬Delta冠狀病毒病的診斷與防控研究進展

王先松，郭世洪，趙 瑤，張德志,2，李前勇,2

(1.西南大學動物科學學院，重慶 榮昌 402460 ; 2.重慶市獸醫(yī)工程技術研究中心，重慶 榮昌 402460)

豬Delta冠狀病毒病是由豬Delta冠狀病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)引起的豬的一種急性腸道傳染病，各生長階段豬均能感染，哺乳仔豬最易感。被感染豬主要表現(xiàn)為持續(xù)嘔吐、水樣腹瀉和脫水等癥狀。該病病原最先于2012年在我國香港發(fā)現(xiàn)，隨后在世界多個國家和地區(qū)被檢測出。有資料指出，該病將會在我國及周邊呈現(xiàn)大量發(fā)生，嚴重威脅著生豬健康及養(yǎng)豬業(yè)安全。

1 PDCoV的病原特征與流行病學

PDCoV是屬于尼多病毒目(Nidovirales),冠狀病毒科(Coronaviridae),冠狀病毒屬(Coronavirus)的單股正鏈RNA病毒，電鏡下呈直徑80～160 nm的球體，有典型的冠狀顆粒?；蚪M大小為25.421～26.674 kb，是最小的冠狀病毒，共編碼4種結構蛋白和4種非結構蛋白，基因組排列順序為5′非編碼區(qū)(5′UTR)、開放閱讀框(ORF1A/1B)、纖突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、非結構蛋白NS6、核衣殼蛋白(N)、非結構蛋白NS7、3′非編碼區(qū)(3′UTR)，與其他動物的Delta冠狀病毒基因組特征和結構相似[1-2]。

自2012年PDCoV首次在香港被檢出，隨后在美國、加拿大、日本、韓國、老撾、越南和泰國等國家已發(fā)現(xiàn)了數(shù)十株PDCoV毒株[3-6]。同時PDCoV也在我國黑龍江、廣東、廣西、海南、四川、臺灣、貴州、湖北等多個地區(qū)被檢測到，表明PDCoV流行趨勢越來越嚴重。由于冠狀病毒獨特的基因組復制方式，PDCoV的RNA極易發(fā)生突變和重組，使該病的預防和控制變得更加困難[7]。

2 PDCoV病的癥狀與致病機制

PDCoV能夠感染各日齡豬群，以豬腸絨毛萎縮、嘔吐、腹瀉和脫水為特征，尤其對哺乳仔豬具有較強的致病性，病死率一般為30%～40%，有時可高達100%。剖檢可見腸壁變薄、腸腔內(nèi)充滿黃色液體，胃和小腸內(nèi)有未消化的凝乳塊，有的小腸黏膜充血、出血，腸系膜呈索狀充血等[8]。

病毒接種仔豬后4～7 d內(nèi)觀察到腸絨毛萎縮，隱窩深度增加。研究者用免疫組織熒光法只能在感染豬的十二指腸、空腸、回腸檢測到熒光，而用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法在腸道、腸系膜淋巴結、胃、心、肝、脾、肺、腎、扁桃體、膈肌、肌肉、血液中均檢測到該病毒，與豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的結果不一致[9-10]。PDCoV的致病機制尚不完全清楚，最新研究表明，存在于細胞膜和病毒包膜中的膽固醇，通過作為病毒進入的關鍵成分而促進PDCoV復制[11]。Wang等發(fā)現(xiàn)PDCoV使用豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroonteritis virus, TGEV)功能受體-豬氨基肽酶N(pAPN)進入細胞，證明pAPN是跨屬冠狀病毒的功能受體，該受體的鑒定為進一步研究PDCoV與宿主的相互作用及發(fā)病機制提供了重要參考[12]。

3 PDCoV病的診斷

鑒于PDCoV病的臨床癥狀和病理變化與豬流行性腹瀉(Porcine epizootic diarrhea, PED)、豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroonteritis,TGE)、仔豬黃痢等豬腸道疾病非常相似，且易發(fā)生混合感染，臨床上難以鑒別診斷。目前，對PDCoV病的診斷主要有病原學診斷和免疫學診斷(表1)。

3.1 病原學診斷

表1 PDCoV檢測

3.1.1 病毒分離培養(yǎng)鑒定 病毒的分離培養(yǎng)可為PDCoV感染提供最直接的病原學依據(jù)，也為進一步的病毒學研究提供材料。Jang等將PDCoV陽性樣本接種到豬睪丸(ST)細胞進行病毒的分離傳代,成功分離得到了PDCoV HB-BD株。通過對分離株的S、M和N基因進行測序鑒定及經(jīng)序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)HB-BD分離株S、M和N基因與近年來國內(nèi)外的流行病毒核苷酸同源性分別為95.8%～99.1%、98.6%～99.4%和97.8%～99.4%，親緣性分析表明，HB-BD與中國毒株處于同一分支[13]。

3.1.2 電子顯微鏡檢查 電鏡技術可以最直觀地觀察到PDCoV粒子的形態(tài)和大小。Xu等使用電子顯微鏡對純化的PDCoV CHN-GD-2016進行檢測，觀察到PDCoV病毒粒子呈直徑80～160 nm的球形，粒子外包裹著一層囊膜，囊膜外有密集的尖刺狀纖突[2]。由于病毒粒子形態(tài)和其他冠狀病毒差別不大，僅從形態(tài)學上很難確診PDCoV，因此需要結合其他手段才能準確診斷。

3.1.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR) RT-PCR技術廣泛應用于RNA病毒檢測，可實現(xiàn)微量的核酸大幅擴增，提高檢測效率。韋學雷等根據(jù)PDCoVN基因、PEDVM基因和TGEVN基因設計合成了3對特異性引物,構建重組質(zhì)粒,并對RT-PCR反應條件進行優(yōu)化,建立了檢測PDCoV, PEDV和TGEV的多重RT-PCR診斷方法，結果顯示，與常規(guī)單一RT-PCR的結果完全符合，且能有效避免對豬博卡病毒(PboV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)和豬圓環(huán)病毒(PCV)等豬常見病毒的誤診[14]。Hu等根據(jù)編碼Alpha、Beta、Gamma和Delta冠狀病毒最保守的蛋白結構域設計了1套新的引物來擴增RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)基因中的668 bp區(qū)域，建立一步法RT-PCR測定標準，反轉(zhuǎn)錄和PCR順次進行,其敏感性和特異性為100%，可鑒別診斷動物的4種冠狀病毒，且檢出率高于普通RT-PCR方法[15]。

3.1.4 實時熒光定量RT-PCR(RT-qPCR) 相比RT-PCR，RT-qPCR檢測方法更快速、更靈敏，逐漸被廣泛應用于PDCoV檢測。Masuda等根據(jù)PEDV和TGEVN基因、PDCoVM基因和豬A型輪狀病毒(PRVA)VP6基因開發(fā)了一種新的多重Real time RT-PCR方法，可以在75 min內(nèi)同時檢測4種豬腹瀉病毒，大大縮短診斷時間，其敏感性最高可達普通RT-PCR的1 000倍，而且沒有出現(xiàn)假陽性[5]。張立衛(wèi)等根據(jù)PDCoV毒株HKU15-155M基因和PEDV毒株CHLY-09ORF3基因序列設計特異性引物,建立并完善了能同時準確檢測PDCoV和PEDV的SYBR Green I雙重熒光RT-PCR檢測方法，具有良好的敏感性和特異性[16]。

3.1.5 恒溫絕熱式RT-PCR(RT-iiPCR) RT-iiPCR與傳統(tǒng)的RT-PCR檢測方法相比,具有操作簡便、快速高效、特異性強、儀器成本低等優(yōu)點，已開始運用于各種病原體的檢測。Zhang等使用PDCoVM基因，建立了PDCoV RT-iiPCR檢測方法并與基于M基因的PDCoV RT-qPCR檢測方法進行了比較，結果顯示，PDCoV RT-iiPCR的敏感性、特異性和準確性均為100%[17]，具有極好的敏感性、特異性和準確性。

3.1.6 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導的等溫擴增(RT-LAMP) RT-LAMP為快速準確地鑒定病毒病原體提供了有效手段，其在等溫條件下擴增出具有高靈敏度和特異性的核酸，這種新型基因檢測技術有效地節(jié)省了時間和成本。Zhang等使用PDCoVN基因的保守序列片段作為靶區(qū)域，開發(fā)了單管一步法RT-LAMP法用于PDCoV診斷和監(jiān)測，其靈敏度比RT-PCR高約100倍，且與PEDV、TGEV等6種病毒無交叉擴增[17]，特異性良好，是一種具有研究價值的方法。

3.2 免疫學診斷

3.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) ELISA是血清學檢測的常用方法之一。與其他豬冠狀病毒相比，用于PDCoV病的ELISA診斷方法仍處于研發(fā)階段。2015年Thachil等基于PDCoV-IA2014-1株S蛋白的S1結構域開發(fā)了間接ELISA，用于測定美國51個農(nóng)場的PDCoV流行情況,發(fā)現(xiàn)在25.5%的農(nóng)場中存在抗PDCoV IgG抗體，診斷靈敏度為91%，特異性為95%[18]。SU等開發(fā)了一種間接ELISA，以組織標記的重組PDCoV N蛋白作為抗原檢測PDCoV的抗體，均未與TGEV、PEDV、豬輪狀病毒A型(Porcine group A rotavi ruses, GAR)、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV發(fā)生交叉反應,具有100%的敏感性和90.4%的特異性[19]。國內(nèi)Luo等建立了以PDCoV M蛋白為基礎的間接ELISA法，檢測了河北省抗PDCoV IgG情況，與抗TGEV、PEDV、RV、PCV-2、CSFV和PRRSV的抗血清無交叉反應，診斷敏感性為90.6%，特異性為93.3%[20]。

3.2.2 熒光微球免疫檢測(FMIA) FMIA方法又被稱為液相芯片技術，是集流式細胞技術、激光技術、數(shù)字信號處理技術及傳統(tǒng)化學技術為一體的生物分子檢測技術。Okda等使用碳化二亞胺偶聯(lián)反應將純化的重組PDCoV N蛋白抗原與熒光微球偶聯(lián)，優(yōu)化條件后得到最佳信噪比，診斷特異性為95.8%，敏感性為98.1%[21]。該方法敏感性通常高于ELISA，且適用于單一復雜樣品中不同分析物的高通量、多重和同時檢測，是一種正在發(fā)展的新型檢測技術。

3.2.3 免疫熒光試驗(IFA) Zhang等通過擴增PDCoV的N基因，用抗PDCoV N蛋白的單抗IFA和Western Blot檢測了純化的PDCoV CHN-HG-2017株在LLC-PK1細胞中的傳染性。在感染后24 h時，大多數(shù)細胞中檢測到PDCoV特異性免疫熒光，N蛋白主要定位于細胞質(zhì)中[22]。

3.2.4 病理切片和免疫組織化學染色(IHC) Zhang等將被感染豬十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸和直腸組織制作成H.E.染色石蠟切片，結果顯示，PDCoV感染仔豬的空腸和回腸絨毛變鈍、碎裂，出現(xiàn)萎縮和空泡，淋巴細胞聚集和腸固有層充血。用PDCoV N特異性單克隆抗體孵育，然后用HRP綴合的山羊抗小鼠IgG二抗孵育的IHC結果與病理切片結果一致，在感染絨毛腸細胞的胞漿中檢測到PDCoV抗原[22]。IFA 及 IHC 等原位檢測方法主要優(yōu)勢在于可以顯示PDCoV抗原的組織分布，但由于該方法的分析靈敏度較低，不能成為檢測PDCoV的首選方法，多用于檢測感染期抗體狀況。

4 PDCoV病的防控措施

由于目前關于PDCoV的感染和傳播研究較少，而且沒有針對PDCoV開發(fā)有效商業(yè)化疫苗或治療藥物，因此只能借鑒其他病毒性腹瀉病PED、TGE采取的綜合性防制措施，從養(yǎng)豬生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)入手，堅持“預防為主，防重于治”原則，以減少疾病發(fā)生。

4.1 合理選擇場址，嚴格引種檢疫 場址應選在地勢較高，干燥，陽光充足，水源良好，排污方便，污染較少的地方。豬場應遠離公路、城鎮(zhèn)居民區(qū)。生活區(qū)與生產(chǎn)區(qū)、隔離區(qū)要嚴格分開。引種前要確定所引進的豬已經(jīng)有可靠的免疫,種源豬場應出具檢疫證明。引種后需隔離觀察1-2個月，經(jīng)檢疫合格后方可與本場豬合群。

4.2 加強飼養(yǎng)管理，提升抵抗能力 養(yǎng)殖場要提高飼料營養(yǎng)水平，杜絕飼喂變質(zhì)飼料，保持營養(yǎng)平衡，從而提高豬只健康水平及其抵抗力。做好場內(nèi)的生物安全，堅持自繁自養(yǎng)、全進全出原則。保持圈舍干凈，減少病毒通過糞-口傳播，保證通風換氣，做好母豬產(chǎn)前乳房清潔和消毒以及產(chǎn)房的保溫工作，同時應降低濕度，給予充足而干凈的飲水，不要頻繁地更換飼料。

4.3 重視消毒工作，輔以適當給藥 及時控制傳染源，切斷傳播途徑，隔離已感染豬群和保護易感豬只；做好消毒工作，對清潔后的豬場使用化學消毒液消毒，增加對疫區(qū)的消毒頻次。對發(fā)病豬可使用抗生素、抗炎藥、抗病毒藥物和液體電解質(zhì)等，減少脫水和體重減輕等癥狀，降低因細菌或病毒的繼發(fā)感染而引起的死亡。KM等發(fā)現(xiàn)市售飼料酸化劑(UltraAcid P,Activate D A,KEMGEST,Acid Booster, Luprosil, Amasil)和鹽可降低飼料中傳播PDCoV的風險，特別是在推薦濃度的2倍下可降低飼料中PDCoV的含量，但不能使病毒完全滅活[23]。有報道稱，多克隆免疫血清可用于控制已發(fā)病豬群的感染[24]。

4.4 做好預防接種，減少混合感染 結合當?shù)氐膭游镆咔橐约梆B(yǎng)殖場的生產(chǎn)實際情況制定合理的免疫程序，避免PDCoV與PEDV、TGEV、GAR等腹瀉疾病混合感染。提高母豬的基礎免疫可使仔豬獲得高濃度的母源抗體，增強初生仔豬的抵抗力。國內(nèi)常見有哈爾濱獸醫(yī)研究所研發(fā)的PEDV、TGEV、GAR三聯(lián)弱毒苗以及多種PEDV、TGEV、GAR三聯(lián)滅活疫苗和PEDV、TGEV二聯(lián)滅活疫苗等，各豬場可根據(jù)實際情況進行預防接種，控制仔豬腹瀉疾病，減少與PDCoV的混合感染。

5 展望

PDCoV作為一種新發(fā)現(xiàn)的致病性病毒，人們對其的分子病原學、流行病學、致病機制等了解尚不夠全面和深入，對PDCoV的預防和治療方法的研究也較少。加強對該病毒NS6和其他輔助蛋白的功能的研究，可能對尋找新的治療靶點和開發(fā)有效疫苗提供依據(jù)。已建立的PDCoV反向遺傳系統(tǒng)，對研究病毒基因的突變或缺失、探索NS6缺失對IFN-β產(chǎn)生、病毒復制和宿主譜的影響等有很積極的意義。從當前全球PDCoV流行狀況來看，該病毒蔓延速度非?？?，并可能會在我國全面流行，因此迫切需要研制出針對PDCoV的疫苗來控制本病的傳播。