鴨甲肝病毒抗體的間接ELISA檢測(cè)方法的建立

殷 茵，張琰杰，閆艷新，任慧英，劉文華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109)

鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus，DHV)可引起雛鴨急性高度致死性感染，尤其是3周齡內(nèi)最易感，死亡率高達(dá)80%，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。DHV可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個(gè)血清型，其中Ⅰ型DHV屬于小RNA病毒科禽肝病毒屬的鴨甲肝病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)，Ⅱ型DHV和III型DHV屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬鴨星狀病毒(Duck astrovirus，DAstV)[2]。其中DHAV又根據(jù)基因同源性差異分為3個(gè)基因型，分別為1型DHAV、2型DHAV和3型DHAV[3]。目前臨床鴨肝炎主要是由1型和3型DHAV引起[4]。我國(guó)臨床上針對(duì)DHAV商品化的生物制品主要是1型DHAV弱毒苗，3型DHAV 疫苗還沒(méi)有得到正式審批。由于3型DHAV的廣泛存在，大部分種鴨場(chǎng)也會(huì)利用3型DHAV臨床分離株制備自家滅活苗與1型DHAV疫苗同時(shí)免疫。商品鴨場(chǎng)為了預(yù)防鴨肝炎，通常在3～5日齡進(jìn)行卵黃抗體注射，目前臨床應(yīng)用的也多是1型+3型的雙聯(lián)抗體，所以針對(duì)DHAV建立一種快速、敏感、特異的抗體檢測(cè)方法是非常必要的。雖然有針對(duì)鴨肝炎病毒的商品化ELISA試劑盒，但價(jià)格昂貴。由于DHAV顆粒太小，不易得到純化病毒，而以全病毒作為包被抗原對(duì)病毒的純化要求又較高，本試驗(yàn)擬以表達(dá)蛋白作為包被抗原，建立一種檢測(cè)DHAV抗體的間接ELISA方法，為臨床種鴨免疫效果的判定及DHAV卵黃抗體效價(jià)測(cè)定提供方便。

1 材料

表達(dá)載體pCold TF,為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑,為Sigma公司產(chǎn)品；山羊抗鴨IgG酶標(biāo)二抗,為美國(guó)KPL公司產(chǎn)品；鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體,為T(mén)op Science公司產(chǎn)品；3型DHAV雙抗原夾心ELISA試劑盒,為上海嵐派生物科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑，均為Solarbio公司產(chǎn)品；試驗(yàn)用各類(lèi)病毒陽(yáng)性血清，為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所黃兵研究員惠贈(zèng)。

2 間接ELISA方法的建立

2. 1 包被抗原和抗體最佳工作濃度確定 將實(shí)驗(yàn)室前期表達(dá)鑒定的DHAV的VP3蛋白通過(guò)切膠回收法進(jìn)行純化[5]。將純化蛋白用包被液分別進(jìn)行1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000的倍比稀釋?zhuān)尤朊笜?biāo)板中4 ℃包被過(guò)夜。PBST洗滌5次，300 μL/孔加入封閉液，37 ℃孵育1.5 h；洗滌后再100 μL/孔分別加入1∶50、1∶100、1∶200的陽(yáng)性和陰性血清，每個(gè)稀釋度做復(fù)孔；洗滌后按100 μL/孔分別加入0.2 μg/mL的山羊抗鴨IgG-HRP，37 ℃孵育1 h；洗滌后每孔加100 μL TMB顯色液，室溫避光顯色15 min，每孔加50 μL 2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，立即在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450值。根據(jù)陽(yáng)性和陰性血清的OD450值，選取P/N最大時(shí)對(duì)應(yīng)的包被抗原和血清稀釋度作為最佳稀釋倍數(shù)[6]。

2.2 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度確定 根據(jù)山羊抗鴨IgG-HRP酶標(biāo)抗體說(shuō)明書(shū)提供的工作濃度范圍分別做1∶100、1∶200、1∶300、1∶400和1∶500倍稀釋?zhuān)谝呀?jīng)確定的最佳條件下進(jìn)行ELISA，比較各組陰陽(yáng)性血清的OD450值和P/N值，確定酶標(biāo)二抗最佳稀釋倍數(shù)[7-8]。

2.4 特異性試驗(yàn) 用VP3重組蛋白建立的間接ELISA方法分別檢測(cè)鴨流感、鴨瘟、黃病毒、鴨甲肝病毒1型、鴨甲肝病毒3型、鴨甲肝病毒1+3型以及陰性血清進(jìn)行交叉反應(yīng)性測(cè)定，每個(gè)樣本重復(fù)2次。

2.5 敏感性試驗(yàn) 對(duì)3份不同的DHAV血清，從1∶100開(kāi)始進(jìn)行2倍倍比稀釋?zhuān)媒⒌拈g接ELISA方法檢測(cè)，以能檢測(cè)出陽(yáng)性的最大血清稀釋度作為樣品的最低檢出量。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：用同一批次純化的VP3蛋白包被酶標(biāo)板，應(yīng)用建立的間接ELISA條件對(duì)3份不同的陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品做5個(gè)平行孔，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。板間重復(fù)性試驗(yàn):用同一批次純化的VP3蛋白但不同時(shí)間包被的酶標(biāo)板，應(yīng)用建立的間接ELISA方法對(duì)3份不同陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品做5個(gè)平行孔，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：計(jì)算同一份血清變異系數(shù)CV%，以檢驗(yàn)板內(nèi)和板間檢測(cè)樣品的重復(fù)性。

2.7 間接ELISA與雙抗原夾心ELISA符合率試驗(yàn) 取40份免疫鴨血清分別用建立的間接ELISA方法和商品化的雙抗原夾心ELISA試劑盒進(jìn)行抗體檢測(cè)，比較兩者診斷的敏感性(即陽(yáng)性檢出率)、特異性(2種檢測(cè)方法陰性率的比值)、符合率(2種檢測(cè)方法陰性和陽(yáng)性符合份數(shù)之和與總份數(shù)的比值)[8]。

3 結(jié)果

3.1 VP3重組蛋白的純化 3型DHAV的VP3蛋白的純化結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，切膠純化后獲得了與預(yù)期大小一致的78 kD的VP3重組表達(dá)蛋白，經(jīng)蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定濃度為319 μg/mL。

圖1 純化VP3蛋白的SDS-PAGE結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE results of purified VP3 proteinM： 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量； 1： 純化的VP3蛋白M： Protein standards； 1： Purified VP3 protein

3.2 包被抗原和抗體最佳工作濃度測(cè)定結(jié)果 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，VP3蛋白包被濃度為0.159 5 μg/mL，血清稀釋1∶200倍時(shí)，陽(yáng)性血清OD450值(P)為1.144，陰性血清OD450值(N)為0.355，P/N值最大。因此選擇最佳抗原包被濃度為0.159 5 μg/mL，血清稀釋度為1∶200。

表1 包被抗原和抗體最佳工作濃度測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of determination of optimal working concentration of coated antigen and antibody

3.3 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度測(cè)定 酶標(biāo)二抗各稀釋倍數(shù)結(jié)果如表2所示，當(dāng)酶標(biāo)二抗稀釋至1∶500時(shí)，P/N比值最大，確定其最佳工作濃度為0.2 μg/mL。

表2 最佳酶標(biāo)抗體工作濃度的確定Table 2 Determination of the optimal working concentration of enzyme-labeled antibody

3.5 特異性試驗(yàn) 按照建立的間接ELISA方法進(jìn)行特異性交叉試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示VP3蛋白能夠與1型DHAV、3型DHAV以及1+3型DHAV陽(yáng)性血清表現(xiàn)為陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明該方法可同時(shí)檢測(cè)1型與3型DHAV血清抗體。與鴨瘟病毒、鴨流感病毒和鴨黃病毒的陽(yáng)性血清沒(méi)有交叉反應(yīng)，說(shuō)明該方法的特異性良好。

表3 未免疫鴨血清的DHAV抗體檢測(cè)結(jié)果Table 3 DHAV antibody test results in unimmunized duck serum

表4 交叉反應(yīng)性檢測(cè)結(jié)果Table 4 Cross-reactivity test results

3.6 敏感性試驗(yàn) 檢測(cè)結(jié)果顯示5份血清1∶800稀釋的OD450值均大于臨界值0.405，間接ELISA方法的靈敏度為1∶800(表5)。

表5 間接ELISA方法敏感性檢測(cè)Table 5 Indirect ELISA method sensitivity detection

3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按照建立的間接ELISA方法檢測(cè)3份血清，板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表6所示，板內(nèi)變異系數(shù)在4.95%～6.57%，均小于10%；板間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表7所示，板間變異系數(shù)在5.73%～8.30%，均小于10%。說(shuō)明建立的ELISA方法具有較好的板內(nèi)重復(fù)性和板間重復(fù)性。

表6 板內(nèi)變異系數(shù)的測(cè)定Table 6 Determination of the coefficient of variation in the plate

表7 板間變異系數(shù)的測(cè)定Table 7 Determination of coefficient of variation between plates

3.8 間接ELISA與雙抗原夾心ELISA符合率試驗(yàn) 用商品化的雙抗原夾心ELISA試劑盒與本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法同時(shí)檢測(cè)40份臨床免疫鴨血清，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知，商品化的雙抗原夾心ELISA試劑盒與本試驗(yàn)建立的間接ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率分別為65%(26/40)和62.5%(25/40)。有1份雙抗原夾心ELISA檢測(cè)陰性血清，間接ELISA檢測(cè)呈陽(yáng)性；有2份雙抗原夾心ELISA檢測(cè)陽(yáng)性血清，間接ELISA檢測(cè)呈陰性。以雙抗原夾心ELISA為參考，間接ELISA的診斷敏感性和診斷特異性分別為92.3%(24/26)和92.9%(13/14)。所以本試驗(yàn)建立的間接ELISA與雙抗原夾心ELISA的符合率為92.5%。

表8 間接ELISA與雙抗原夾心ELISA的符合率Table 8 Consistency of indirect ELISA and dual antigen sandwich ELISA

4 討論

全病毒包含該病毒的所有抗原位點(diǎn)，而表達(dá)蛋白僅包含部分抗原位點(diǎn)[9]，因此在建立間接ELISA方法時(shí)將全病毒作為包被抗原比包被蛋白效果要好。對(duì)鴨肝炎病毒來(lái)說(shuō)，由于病毒粒子太小，很難達(dá)到理想的純化效果，因而常規(guī)的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)不適于DHAV的抗體檢測(cè)，ELISA方法靈敏度較高，但同樣存在包被抗原制備困難的問(wèn)題，所以迫切需要尋找能夠代替全病毒的抗原。重組蛋白因其容易表達(dá)和純化，并具有良好免疫反應(yīng)的特點(diǎn)成為一種最佳選擇。目前，以重組蛋白作為包被抗原的ELISA方法已得到廣泛應(yīng)用[10-11]，但報(bào)道的方法基本是用1型DHAV的VP3蛋白[12-13]，未見(jiàn)有將3型DHAV的VP3蛋白用于建立間接ELISA檢測(cè)鴨甲肝病毒抗體的報(bào)道。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)表達(dá)的VP3蛋白能同時(shí)跟1型和3型DHAV陽(yáng)性血清反應(yīng)，說(shuō)明本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法能同時(shí)檢測(cè)1型和3型DHAV抗體。

理論上講，間接ELISA可出現(xiàn)陽(yáng)性和陰性2種結(jié)果，但實(shí)際檢測(cè)中會(huì)有少量樣本檢測(cè)值位于陰、陽(yáng)性的分界處，難于準(zhǔn)確判斷。科學(xué)合理的判定臨界值對(duì)保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。本試驗(yàn)應(yīng)用40份健康鴨陰性血清進(jìn)行了檢測(cè)與分析，得出陰、陽(yáng)性血清的臨界值為0.405。因血清來(lái)源和數(shù)量有限不能夠代表全部健康鴨的血象特征，因此本試驗(yàn)設(shè)定的臨界值還需要在今后大量的應(yīng)用中進(jìn)一步完善。根據(jù)建立的ELISA方法及最佳反應(yīng)條件，確定該方法的特異性，結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法可用于鴨肝炎病毒抗體水平的檢測(cè)。

本試驗(yàn)以3型DHAV的VP3表達(dá)蛋白作為包被抗原建立的檢測(cè)鴨甲肝病毒抗體的間接ELISA方法具有較好的特異性、敏感性和重復(fù)性。與商品化的雙抗原夾心ELISA方法的符合率為92.5%。