犬瘟熱病毒受體SLAM TaqMan熒光定量PCR方法的建立

王介淞，林佳旭，王鑫磊，黃 娟

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 山東省獸藥診斷試劑工程技術(shù)研究中心，山東 青島 266109)

犬瘟熱 (Canine distemper，CD) 是由副黏病毒科(Paramyxoviridae) 麻疹病毒屬(Morbillivirus) 的犬瘟熱病毒(Canine distemper virus, CDV) 感染引起的多種動(dòng)物共患傳染病[1]。其中犬科、鼬科、貓科等動(dòng)物是犬瘟熱的易感宿主，感染后死亡率為 30%～80%[2]。近年來(lái)，隨著我國(guó)毛皮市場(chǎng)日益壯大，水貂、狐貍和貉的養(yǎng)殖行業(yè)蒸蒸日上，密度的擴(kuò)大加上飼養(yǎng)條件的不規(guī)范，使得犬瘟熱在養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

病毒研究的熱點(diǎn)之一為病毒受體的研究，受體在病毒感染細(xì)胞過(guò)程中起很重要旳作用[4-6]。細(xì)胞表面受體決定了病毒的組織嗜性和感染宿主范圍，因此，CDV的跨種間傳播現(xiàn)象與其感染宿主的細(xì)胞受體的表達(dá)有著密切關(guān)系[7]。犬瘟熱病毒的表面糖蛋白(血凝素蛋白、融合蛋白)與受體相互識(shí)別、吸附，導(dǎo)致CDV侵染宿主細(xì)胞[8-9]。信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子(Signaling lymphocyte activation molecule, SLAM，又稱CD150)是犬瘟熱病毒的主要受體，在犬瘟熱病毒侵染宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[10]。研究CDV感染不同階段SLAM的動(dòng)態(tài)分布，有助于我們進(jìn)一步闡明CDV的致病機(jī)制。但是，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道SLAM熒光定量PCR(Flurogenic quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)檢測(cè)方法。

本試驗(yàn)采用TaqMan探針技術(shù)建立了檢測(cè)水貂淋巴細(xì)胞SLAM基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，為下一步研究CDV感染動(dòng)物不同階段SLAM的動(dòng)態(tài)分布提供有效的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及質(zhì)粒 犬瘟熱病毒、克隆了水貂SLAM基因的重組質(zhì)粒pMD18-T-SLAM均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 PremixExTaqTM(Probe qPCR)、 PremixExTaqPrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒、RNAiso plus裂解液，均購(gòu)自TaKaRa公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。主要儀器有Light Cycler 96 SW PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 60日齡的健康水貂，來(lái)自青島某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的水貂SLAM基因核酸序列(FJ626692)，利用Primer5設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物。SLAM基因的引物序列為：F：5′-TCCAGAGGCATAAGTAAG-3′;R:5′-TCCAGATGAAAGGTATAGC-3′；探針序列為：5′-(FAM)CGTCCTTGTCACCAGAGCAGA(Eclipse)-3′。引物和探針由TaKaRa公司合成，熒光標(biāo)記選擇FAM作為報(bào)告發(fā)光基團(tuán)，NFQ為淬滅基團(tuán)，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為158 bp。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)?？截悢?shù)的計(jì)算 以pMD18-T-SLAM質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定未稀釋標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的OD260值及OD280值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的質(zhì)量濃度(ng/μL)和拷貝數(shù)。對(duì)其依次進(jìn)行10-2、10-3、10-4、…、10-12倍梯度稀釋，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3SLAMTaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化

1.2.3.1 引物和探針濃度的優(yōu)化 以10-2倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，引物和探針經(jīng)過(guò)稀釋配比成5、10、15、20、25、30 μmol/L的濃度，用矩陣法來(lái)篩選構(gòu)建的SLAM基因熒光定量PCR最佳的引物和探針的使用量。

1.2.3.2 循環(huán)條件的優(yōu)化 為了獲得較好的熒光增幅和擴(kuò)增效率，對(duì)TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR循環(huán)次數(shù)進(jìn)行篩選；退火溫度選擇從55 ℃逐漸遞增到60 ℃，篩選出最佳的反應(yīng)條件。

1.2.3.3 熒光定量PCR產(chǎn)物電泳 以優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR，產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，拍照記錄結(jié)果。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 以10-2、10-3、10-4、…、10-7倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品做模板，用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR，循環(huán)閾值作為縱坐標(biāo)，質(zhì)?？截悢?shù)的常用對(duì)數(shù)(lgC)作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出其標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程，并計(jì)算出R值。

1.2.5 敏感性試驗(yàn) 以10倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用相應(yīng)的引物、探針及優(yōu)化后的條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，并以雙蒸水代替模板作為陰性對(duì)照，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.7 TaqMan熒光定量PCR方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè) 取水貂場(chǎng)60日齡的健康水貂外周血分離淋巴細(xì)胞，鋪96孔板，并用200 TCID50CDV感染，分別在感染前(0 h)和感染后12 h提取CDV感染組和細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用構(gòu)建好的TaqMan熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)并記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1SLAMTaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化 經(jīng)過(guò)優(yōu)化，PCR反應(yīng)總體系為25 μL，其中PremixExTaqTM(Probe qPCR)12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，探針1 μL，質(zhì)粒模板2 μL，補(bǔ)雙蒸水至25 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s， 55 ℃退火10 s，72 ℃收集熒光20 s，40個(gè)循環(huán)。此條件能獲得良好的擴(kuò)增曲線(圖1)，PCR產(chǎn)物呈現(xiàn)單一條帶，大小符合預(yù)期(158 bp)(圖2)。

2.2SLAMTaqMan熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別以10-2～10-7倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR見封三彩版圖3，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。SLAM基因的擴(kuò)增效率為97.8%，R2為0.998 2，表明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，各個(gè)稀釋度相關(guān)性好，誤差較?。谎h(huán)閾值(y)與質(zhì)?？截悢?shù)的常用對(duì)數(shù)(lgC)的關(guān)系式為：y=-2.725 7x+37.212。

圖1 水貂SLAM TaqMan熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.1 TaqMan FQ-PCR curve for mink SLAM gene

圖2 水貂SLAM TaqMan熒光定量PCR產(chǎn)物電泳Fig.2 Electrophoresis of TaqMan FQ-PCR product of mink SLAM geneM:100 bp DNA Laddar Marker； 1:PCR產(chǎn)物； 2:陰性對(duì)照M:100 bp DNA Laddar Marker； 1:PCR product； 2:Negative control

圖4 犬瘟熱病毒受體SLAM TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of FQ-PCR for CDV receptor SLAM detection

2.3SLAMTaqMan 熒光定量PCR方法的敏感性試驗(yàn) 經(jīng)計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品的起始濃度為2.45×109拷貝/μL，以10倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行TaqMan熒光定量PCR,當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為2.45 拷貝/μL時(shí)，才有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，而2.45×10-1拷貝/μL及空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線(見封三彩版圖5)，因?yàn)槟０寮尤肓繛? μL，所以該方法的最低檢出限度為4.9個(gè)拷貝。

2.4SLAMTaqMan 熒光定量PCR方法的重復(fù)性試驗(yàn)

2.4.1 組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn) 以同一稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板，一次性進(jìn)行3個(gè)樣品的重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果Cq值分別是21.89、21.87、21.88(見封三彩版圖6)。

2.4.2 組間重復(fù)試驗(yàn) 以10-2倍、10-3倍、10-4倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)行6次試驗(yàn)，結(jié)果Cq值變異系數(shù)均小于1%(見表1)，表明檢測(cè)方法具有較好的組間重復(fù)性。

2.5SLAMTaqMan熒光定量PCR方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè) 對(duì)體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞在CDV感染前后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法能夠檢測(cè)出外周血淋巴細(xì)胞中的SLAM基因，CDV感染后SLAM基因表達(dá)量較感染前有所上升，細(xì)胞對(duì)照組SLAM基因表達(dá)量基本保持穩(wěn)定趨勢(shì)(見表2)。

3 討論

表1 水貂SLAM基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR組間重復(fù)試驗(yàn)Table 1 Inter group repetition of TaqMan FQ-PCR based on SLAM

表2 SLAM TaqMan熒光定量PCR方法對(duì)體外淋巴細(xì)胞的檢測(cè)Table 2 Detection of SLAM in peripheral blood lymphocyte by TaqMan FQ-PCR assay

SLAM是麻疹病毒屬病毒的共同受體，據(jù)報(bào)道，人麻疹病毒感染機(jī)體后并不會(huì)引起受體SLAM的下調(diào)[11]。為了更好的了解犬瘟熱病毒致病機(jī)制，需要對(duì)其宿主SLAM受體進(jìn)行多方面的研究，包括動(dòng)物在發(fā)病前和發(fā)病后體內(nèi)SLAM受體的表達(dá)情況都需要進(jìn)一步研究。目前檢測(cè)目的基因表達(dá)的常見方法有常規(guī)PCR、免疫組化等[5，12-13]。由于普通PCR只能檢測(cè)樣品中是否含有目的基因，但是不能準(zhǔn)確分析樣品中目的基因含量的多少；免疫組化利用抗原抗體能夠特異性結(jié)合的原理，能夠?qū)δ承┏煞诌M(jìn)行定位，但不能準(zhǔn)確定量[5]。本試驗(yàn)構(gòu)建了相比普通PCR更能準(zhǔn)確分析SLAM受體含量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，利用引物和探針相互作用的原理，能夠特異性檢測(cè)SLAM基因的表達(dá)情況，表達(dá)量的多少根據(jù)儀器的Ct(或Cq)值，代入構(gòu)建好的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式中，在1～2 h以內(nèi)就能完成檢測(cè)，省時(shí)省力。

犬瘟熱病毒受體SLAM熒光定量方法的構(gòu)建，為研究SLAM與犬瘟熱病毒的相互作用，闡明犬瘟熱致病機(jī)制提供了有力的手段。目前已有報(bào)道受體SLAM在感染CDV后的動(dòng)物體內(nèi)的不同組織和器官的分布[5]，但是至今尚未有研究報(bào)道在犬瘟熱病毒感染動(dòng)物后的不同發(fā)病時(shí)期的表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)研究犬瘟熱發(fā)病不同階段SLAM蛋白和CDV N蛋白表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化和聯(lián)系，為犬瘟熱病的臨床觀察和預(yù)后治療提供了新的思路和途徑。本方法的建立也可以為以后研究犬瘟熱病毒與其他受體之間的相互作用提供借鑒。當(dāng)然，雖然FQ-PCR技術(shù)能夠定量分析不同時(shí)期患病動(dòng)物淋巴細(xì)胞上SLAM受體的mRNA轉(zhuǎn)錄情況，但還需與其他方法(如免疫組化結(jié)果)相互佐證，綜合分析SLAM的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)情況。