河北省妊娠流產(chǎn)奶牛及腹瀉犢牛牛病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查

陳穎彬 , 張明勇，李 林 , 武二斌，馬亞賓，常麗云 , 關(guān)一凡 , 王建永 , 秦建華 , 趙月蘭

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001 ； 2.懷來縣畜牧水產(chǎn)局，河北 懷來 075400 ； 3.張家口市畜牧技術(shù)推廣站，河北 張家口 075000 ； 4.河北省畜牧良種工作站，河北 石家莊 050061)

牛病毒性腹瀉/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起的一種極為復(fù)雜、呈多種臨床類型的疾病[1-2]。其特征是消化道黏膜糜爛、壞死、胃腸炎和腹瀉。該病呈世界性分布，且在國內(nèi)某些地區(qū)存在BVDV嚴(yán)重感染[3-5]。各年齡的牛均易感，但犢牛更易感，可引起腹瀉、急性死亡，妊娠母畜感染可引起流產(chǎn)、免疫耐受、持續(xù)性感染和免疫抑制。BVDV不僅感染牛，也能感染綿羊、山羊、豬、鹿和其他反芻動(dòng)物[6-8]，已成為當(dāng)前嚴(yán)重危害我國養(yǎng)殖業(yè)的傳染病之一。為了解河北省及周邊地區(qū)奶牛群中該病感染情況，對(duì)其部分奶牛場進(jìn)行了本病的感染情況調(diào)查，為更好控制BVDV感染和本病的流行提供參考。

1 材料

1.1 樣品 從河北省保定市、石家莊市、廊坊市、衡水市、張家口市、滄州市、天津北辰和北京大興8個(gè)地區(qū)奶牛場，采集有流產(chǎn)癥狀的妊娠牛血清，共計(jì)164份，進(jìn)行BVDV抗體檢測(cè)，采集腹瀉犢牛糞樣，共計(jì)79份，進(jìn)行BVDV抗原檢測(cè)。

1.2 主要試劑 牛病毒性腹瀉-黏膜病 ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒，購自上海篤馬生物技術(shù)有限公司；病毒DNA提取試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL-2 000 DNA Marker、DL-1 500 DNA Marker、2×PCR Mix，購自TIANGEN公司；PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit, 購自TaKaRa公司；BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株OregonC24V，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所; MDBK細(xì)胞，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，于含10%犢牛血清的DMEM營養(yǎng)液中培養(yǎng)，用作BVDV陰性對(duì)照。

1.3 主要儀器 凝膠成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀，購自美國Bio-Rad公司；電子分析天平，購自上海上平儀器公司；臺(tái)式離心機(jī)，購自上海安亭科學(xué)儀器廠；瓊脂糖水平電泳槽，購自杭州博日科技有限公司； CO2培養(yǎng)箱，購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；PCR儀，購自寧波新芝生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 不同地區(qū)流產(chǎn)妊娠奶牛血清BVDV抗體檢測(cè) 共采集有流產(chǎn)癥狀的妊娠牛血清164份，用牛病毒性腹瀉-黏膜病ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行BVDV抗體檢測(cè)。每次檢測(cè)設(shè)有2個(gè)陰性對(duì)照孔和2個(gè)陽性對(duì)照孔。將ELISA試劑盒放于室溫內(nèi)平衡20 min，若部分試劑有結(jié)晶現(xiàn)象則將試劑放于37 ℃溫育至完全溶解即可使用，血清抗體檢測(cè)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

臨界值計(jì)算：將陰性對(duì)照孔的平均值加0.15，所得的數(shù)即為臨界值。

結(jié)果判定：當(dāng)所測(cè)的樣本OD值小于臨界值時(shí)，樣本判定為陰性；當(dāng)所測(cè)的樣本OD值大于臨界值時(shí)，樣本判定為陽性。

2.2 不同地區(qū)腹瀉奶牛糞樣BVDV抗原基因檢測(cè) 采集的腹瀉奶牛糞樣共計(jì)79份，用PCR方法進(jìn)行BVDV抗原E2基因片段的檢測(cè)。

2.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù) GenBank 公布的 BVDV的OregonC24V毒株基因組序列(登錄號(hào)AF091605)，利用 Primer 5軟件設(shè)計(jì)特異性引物 p1/p2，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。目的片段大小為781 bp，引物序列如下：上游引物 p1：5′-CCATGGAAAACATATAACACAGTGG-3′;下游引物 p2：5′-TAAGCATATGCTCCAAACCACGT-3′。

2.2.2 病毒基因組RNA的提取 取被檢糞樣1 g，加生理鹽水4 mL，反復(fù)凍融2次，8 000 r/min離心5 min，取上清，用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取病毒基因組RNA, 具體操作步驟按說明書進(jìn)行。

2.2.3 病毒基因的 RT-PCR 擴(kuò)增 以提取的基因組RNA為模板，用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按試劑盒說明書進(jìn)行。

以cDNA為模板，用p1/p2引物進(jìn)行BVDVE2基因片段的PCR擴(kuò)增，采用20 μL反應(yīng)體系，10×ExTaqBuffer 2 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 2 μL，ExTaq(5 U/μL) 0.1 μL，上下游引物各 1 μL， 模板 2 μL，ddH2O 11.9 μL。PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火 1 min， 72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。

取5 μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增出781 bp目的片段為陽性，否則為陰性。同時(shí)，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)毒株OregonC24V作陽性對(duì)照，正常MDBK細(xì)胞作陰性對(duì)照。

3 結(jié)果

3.1 不同地區(qū)流產(chǎn)妊娠奶牛血清BVDV抗體檢測(cè) 對(duì)8個(gè)地區(qū)奶牛場采集的164份血清進(jìn)行BVDV 抗體ELISA檢測(cè)，結(jié)果見表1。BVDV 抗體平均檢出率為46.95%，其中，保定地區(qū)BVDV 抗體檢出率最低為4.0%，其次是滄州地區(qū)，陽性檢出率為20%，天津北辰地區(qū)接近平均值，廊坊和衡水地區(qū)BVDV抗體檢出率最高，均為100%，北京大興陽性率也高達(dá)80%。

3.2 不同地區(qū)腹瀉犢牛糞樣BVDV抗原E2基因檢測(cè) 將犢牛腹瀉糞樣進(jìn)行 BVDVE2基因PCR擴(kuò)增，部分檢樣擴(kuò)增出大小約為781 bp特異性片段，與預(yù)期目的片段大小相符(見圖1)。由圖1可知，5份被檢樣品為陽性結(jié)果，2份被檢樣品為陰性結(jié)果。

79份被檢糞樣E2基因PCR檢測(cè)結(jié)果見表2，由表2可知，BVDVE2 基因陽性檢出率平均為40.5%，廊坊地區(qū)E2基因陽性率最高為100%，其次是石家莊和衡水地區(qū)，陽性檢出率為44.4%～50%，滄州、北京大興和天津北辰地區(qū)則低于平均值，保定地區(qū)E2基因陽性檢出率最低為10%。

表1 流產(chǎn)妊娠奶牛血清BVDV抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果Table 1 Results of BVDV antibody in serum samples examined by sandwich ELISA in aborted bovine

圖1 部分糞樣BVDV E2基因 PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR amplification of BVDV E2 gene in the some feces samplesM1: DL-1 500 Marker; M2: DL-2 000 Marker; 1: OregonC24V 陽性對(duì)照; 2～4:被檢樣品; 5: MDBK陰性對(duì)照; 6～9: 被檢樣品M1: DL-1 500 Marker; M2: DL-2 000 Marker; 1: OregonC24V positive control; 2～4: Feces samples; 5: MDBK cell negative control; 6～9: Feces samples

4 討論

表2 犢牛腹瀉糞便樣品中BVDV抗原E2基因檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of BVDV E2 gene of fecal samples examined by PCR

牛病毒性腹瀉/黏膜病是威脅牛群健康的重要傳染性疾病之一， 可對(duì)牛群繁殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、產(chǎn)奶量等產(chǎn)生嚴(yán)重影響，進(jìn)而影響我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計(jì)，北京市規(guī)模化養(yǎng)殖場每年由于腹瀉和繁殖障礙淘汰的奶牛占到總淘汰牛的30%以上，其中牛病毒性腹瀉是造成牛群腹瀉和繁殖障礙的一個(gè)重要因素[9]。本次對(duì)不同地區(qū)流產(chǎn)癥狀妊娠奶牛血清BVDV抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，BVDV抗體平均檢出率為46.95%，其中，保定地區(qū)BVDV抗體檢出率最低為4.0%，其次是滄州地區(qū)，陽性檢出率為20%，而廊坊和衡水地區(qū)BVDV 抗體檢出率最高，均為100%，北京大興陽性率也高達(dá)80%，石家莊和天津北辰陽性率接近平均水平。調(diào)查結(jié)果表明，不同地區(qū)流產(chǎn)癥狀妊娠奶牛群中均存在BVDV感染，這也可能是導(dǎo)致妊娠奶牛流產(chǎn)的主要原因之一。

我國不少地區(qū)的牛群不同程度的感染了BVDV，因此各地應(yīng)高度重視本病。據(jù)報(bào)導(dǎo)，2013年內(nèi)蒙古3個(gè)地區(qū)6個(gè)養(yǎng)殖場進(jìn)行BVDV的流行病調(diào)查結(jié)果顯示，其總陽性率為58.35%[10]。2015年新疆部分地區(qū)奶牛場BVDV流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，血清抗體陽性率在90%以上[11]。2016年山東地區(qū)規(guī)模化牛場的BVDV 調(diào)查表明，其血清抗體陽性率達(dá)65%[12]。甘肅省部分地區(qū)牛病毒性腹瀉/黏膜病，陽性率為56.36%[13]。湖南省的2 個(gè)規(guī)模奶牛場從未進(jìn)行過BVDV 疫苗免疫,但BVDV陽性率為92.17%,說明在湖南的規(guī)模奶牛場中BVDV感染已經(jīng)存在[14]。河南15個(gè)縣市牛群的BVDV抗體陽性率平均為22.9%，事實(shí)上實(shí)際的感染率可能更高, 因檢測(cè)血清抗體不能檢出持續(xù)性感染牛[15]。檢查抗體一方面難以作出早期診斷，另一方面由于存在著許多持續(xù)性感染動(dòng)物(免疫耐受)而漏檢，因此也難以查出所有的傳染源。目前，國外對(duì)持續(xù)性感染BVDV的牛多采用從白細(xì)胞中分離病毒的方法，但該方法實(shí)施比較困難，加之病毒分離率低及費(fèi)用昂貴，因而難以用于大批奶牛的檢疫。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)被應(yīng)用于牛病毒性腹瀉-黏膜病的診斷，核酸擴(kuò)增技術(shù)目前已成為應(yīng)用較為廣泛的實(shí)驗(yàn)室診斷方法,該方法特異性強(qiáng)，敏感性高。本試驗(yàn)采用BVDV主要結(jié)構(gòu)蛋白E2基因PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)不同地區(qū)腹瀉奶牛糞樣BVDV抗原E2基因進(jìn)行檢測(cè)，陽性檢出率平均為 40.5%，廊坊地區(qū)陽性率最高為100%，其次是石家莊和衡水地區(qū)，陽性檢出率為44.4%～50%，張家口、滄州、天津北辰、北京大興陽性檢出率低于平均水平，保定地區(qū)陽性檢出率最低為10%。調(diào)查結(jié)果表明，不同地區(qū)被檢奶牛群不同程度的感染了BVDV。本地區(qū)奶牛BVDV感染流行可能與其持續(xù)性感染(PI)有關(guān)，其PI牛體內(nèi)不產(chǎn)生抗體，卻終生帶毒、排毒。持續(xù)性感染是造成BVD-MD擴(kuò)散的重要傳染源，因此檢出和消除PI牛是控制BVD-MD的中心環(huán)節(jié)。