• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    ??????湘南臍橙柑橘黃龍病的PCR檢測(cè)及內(nèi)生細(xì)菌的分離

    2020-09-02 07:30:09雷平黃彬彬黃軍畢世宇郭照輝劉清術(shù)唐瀅
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年7期
    關(guān)鍵詞:湘南臍橙

    雷平 黃彬彬 黃軍 畢世宇 郭照輝 劉清術(shù) 唐瀅

    摘 要:為確保湘南臍橙產(chǎn)業(yè)發(fā)展安全,嚴(yán)格防控柑橘黃龍病,從湘南地區(qū)幾個(gè)臍橙種植園采集柑橘黃龍病疑似病株樣品和健康植株樣品,利用文獻(xiàn)報(bào)道的柑橘黃龍病PCR檢測(cè)常用引物對(duì)樣品進(jìn)行分子檢測(cè),并從病株組織中分離內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果表明:在柑橘黃龍病的常規(guī)PCR檢測(cè)中,湘南臍橙總核酸對(duì)P400引物的靈敏度最高,是湘南地區(qū)臍橙中柑橘黃龍病害常規(guī)PCR檢測(cè)的最佳引物,其次為P535引物,而OI和16S這2對(duì)引物的靈敏度較低;對(duì)臍橙中柑橘黃龍病病株組織內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定發(fā)現(xiàn),柑橘中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌主要?dú)w類為7個(gè)屬,分別為短桿菌屬(Curtobacterium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、異常球菌屬(Deinococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus);其中,LB和1/10LB培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)菌屬為短桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和芽孢桿菌屬;而臍橙樹(shù)葉汁培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)菌屬為短桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和微桿菌屬。

    關(guān)鍵詞:臍橙;柑橘黃龍病;PCR檢測(cè);內(nèi)生細(xì)菌;湘南

    中圖分類號(hào):S432.42文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1006-060X(2020)07-0001-04

    Abstract: In order to ensure the industry security of navel orange (Citrus sinensis Osb. var. brasliliensis Tanaka) in South Hunan and keep strict prevention or control of citrus Huanglongbing (HLB), the diseased and healthy samples were collected from 4 navel orange ochards of Yizhang County, Chenzhou City, Hunan Province for the PCR detection of citrus HLB pathogen and the isolation of endogenous? bacteria. 4 kinds of PCR primers were used. In the routine PCR detection of citrus HLB, total nucleic acid of citrus HLB pathogen in the navel orange leaves has the highest sensitivity to primer P400 which is the optimal for PCR detection of citrus HLB for southern Hunan navel orange, followed by primer P535, while OI and 16S primers have lower sensitivity. Curtobacterium, Sphingomonas, Deinococcus, Pseudomonas, Methylobacterium, Microbacterium and Bacillus are seven species of culturable endogenous bacteria isolated from diseased samples. Curtobacterium, Sphingomonas and Bacillus are the dominant genera isolated with LB and 1/10LB, while Curtobacterium, Sphingomonas and Microbacterium are the dominant genera isolated with navel orange leaf juice + agar.

    Key words: navel orange (Citrus sinensis Osb. var. brasliliensis Tanaka); citrus Huanglongbing (HLB); PCR detection; endogenous? bacteria; South Hunan

    湘南地處我國(guó)三大柑橘產(chǎn)業(yè)帶(贛南—湘南—桂北),具有獨(dú)特的氣候、資源、區(qū)位、交通和人才優(yōu)勢(shì)。湘南臍橙種植面積已遠(yuǎn)超1.8萬(wàn)hm2(該面積為《宜章縣產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2002—2010)》和《宜章縣產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2012—2017)》中規(guī)劃的臍橙發(fā)展面積),成為了當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè),特別是郴州的“宜章臍橙”已注冊(cè)成地理商標(biāo),具有較大的發(fā)展前景[1]。但隨著氣候的變暖,湘南臍橙受到了從華南地區(qū)向北擴(kuò)散的柑橘黃龍病的影響,部分果園頻繁出現(xiàn)果樹(shù)葉片斑駁黃化,甚至果樹(shù)枯死和毀園的現(xiàn)象。因此,加強(qiáng)臍橙的檢疫與防治工作,對(duì)于湘南臍橙產(chǎn)業(yè)乃至湘南和湖南柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著重大的現(xiàn)實(shí)意義。

    自20世紀(jì)初柑橘黃龍病首次在我國(guó)發(fā)現(xiàn)以來(lái),先后在廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等地區(qū)發(fā)生,且為害較為嚴(yán)重。雖然云南、貴州、浙江、四川、湖南等地也有發(fā)現(xiàn),但屬零星分布,主要是苗木運(yùn)輸所致,加強(qiáng)苗木監(jiān)控即可有效遏制病情發(fā)生。然而,由于近年來(lái)全球氣溫持續(xù)變暖,柑橘木虱活動(dòng)范圍不斷北擴(kuò),柑橘黃龍病的發(fā)生有逐漸向北擴(kuò)散的趨勢(shì),湘南地區(qū)由于臨近廣東、廣西等柑橘黃龍病高發(fā)區(qū),故首當(dāng)其沖地遭受柑橘黃龍病的為害。Gao等[2]的血清學(xué)試驗(yàn)和Bastianel等[3]基于OMP基因的酶切分型試驗(yàn)都表明柑橘黃龍病病原亞洲種具有較大的分化。董俊[4]的研究表明,華南地區(qū)的柑橘黃龍病病原存在著多種亞種的分化,并且其遺傳分化的規(guī)律主要取決于地域的分布和寄主植物品種的差異。雖然近年來(lái)有一些針對(duì)湖南地區(qū)的柑橘黃龍病的分子檢測(cè)研究[5-6],但是關(guān)于湘南柑橘,特別是湘南臍橙柑橘黃龍病PCR檢測(cè)引物及病原伴生菌的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,筆者通過(guò)常規(guī)技術(shù)以多組柑橘黃龍病PCR檢測(cè)引物對(duì)湘南臍橙主產(chǎn)區(qū)——宜章的臍橙黃龍病株進(jìn)行檢測(cè)鑒定,以期篩選出對(duì)湘南臍橙具有高特異性、高靈敏度的柑橘黃龍病PCR檢測(cè)引物,并從陽(yáng)性病株中分離出一些柑橘黃龍病病原的伴生菌,為湘南地區(qū)臍橙柑橘黃龍病的診斷及防控提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 采 樣

    臍橙枝葉樣品采自湖南省郴州市宜章縣4個(gè)不同的臍橙種植園(圖 1)。采樣植株為 6~10年生臍橙,主要采集1~3年生葉片,圖1中1~3號(hào)均為柑橘黃龍病株陽(yáng)性樣品且病害程度遞增,4號(hào)樣品為柑橘黃龍病株陰性樣品。所有樣品均由宜章縣農(nóng)業(yè)局植保站提供。采樣時(shí)間為2018年6月上旬,樣品采摘后帶回室內(nèi)4℃保存,3 d內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)和分離培養(yǎng)。

    1.2 臍橙柑橘黃龍病的PCR檢測(cè)

    參考高玉霞等[7]的方法提取植物葉片總核酸,略作調(diào)整?;静襟E:葉片清洗干凈并涼干后,切取葉片0.5 g,置于干凈的研缽中,用液氮快速研磨成粉末狀;收集到1.5 mL無(wú)菌離心管中,加入500 μL TES緩沖液(0.1 mol/L Tris-HCl,pH值8.0;2 mmol/EDTA,pH值8.0;2% SDS)漩渦混勻;加入500 μL酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1的混合液;漩渦5 min混勻;室溫12 000 r/min離心5 min,吸取上清液用1 mL無(wú)水乙醇和100 μL的NaAc混勻,-20℃ 5 min沉淀;室溫12 000 r/min離心3 min去掉上清液,然后用500 μL 75%乙醇清洗2次;室溫12 000 r/min離心3 min,沉淀在常溫下風(fēng)干,加入100 μL無(wú)菌水溶解,即為總核酸樣品,-20℃保存。

    PCR引物:根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,選取16S引物對(duì)[7]、P400引物對(duì)[8]、P535引物對(duì)[9]、OI引物對(duì)[10]進(jìn)行臍橙柑橘黃龍病檢測(cè),引物序列見(jiàn)表1,由湖南擎科生物有限公司合成。

    PCR檢測(cè)體系:2×PCR Mix buffer 25 μL,10 μmol/L引物各2 μL,模板1 μL,添加雙蒸H2O至50 μL。所有試劑均為寶生物工程(大連)有限公司TAKARA系列產(chǎn)品。

    16S引物PCR擴(kuò)增程序:94℃ 5 min→94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,循環(huán)30 次→72℃10 min→4℃保存。P400引物PCR擴(kuò)增程序:94℃5 min→94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s,循環(huán)30次→72℃ 10 min→4℃保存。P535引物PCR擴(kuò)增程序:94℃ 5 min→94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,循環(huán)32次→72℃ 10 min→4℃保存。OI引物PCR擴(kuò)增程序:94℃?5 min→94℃ 30 s,61℃ 1 min,72℃ 1.5 min,循環(huán)32次→72℃ 10 min→4℃保存。

    1.3 臍橙柑橘黃龍病株內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定

    內(nèi)生菌的分離參考王真真等[11]的方法,進(jìn)行細(xì)微的調(diào)整。將采摘的1~3號(hào)臍橙樣品的葉片和枝條剪下用清水洗凈泥沙,置于超凈工作臺(tái)中吹干;放入磷酸氫二鈉溶液中超聲1 min進(jìn)一步去除表面雜質(zhì),從中取出植物組織依次用無(wú)水乙醇、4%次氯酸鈉、硫代硫酸鈉進(jìn)行表面消毒,消毒后用大量無(wú)菌水清洗以去殘留的消毒劑;取最后一步清洗液涂布LB平板檢測(cè)表面消毒是否徹底,將消毒徹底的植物組織置于超凈工作臺(tái)中吹干;然后將樣品研磨成漿液,分別取1、10、100 μL汁液涂布LB、1/10 LB固體培養(yǎng)基和臍橙葉汁培養(yǎng)基平板,每種培養(yǎng)基涂布5個(gè)平板,30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~7 d,挑取單菌落至LB平板劃線,獲得純培養(yǎng)物。

    3種培養(yǎng)基制備方法如下。(1)LB固體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉浸膏10 g、氯化鈉3 g、瓊脂粉20 g,蒸餾水1 000 mL,pH值6.5±0.5。(2)1/10LB液體培養(yǎng)基:用蒸餾水將LB培養(yǎng)基稀釋10倍后,調(diào)節(jié)pH值6.5±0.5。(3)臍橙葉汁培養(yǎng)基:將100 g新鮮健康臍橙葉洗凈、剪碎,加入500 mL超純水后用榨汁機(jī)榨汁,葉汁高速離心后上清經(jīng)過(guò)0.22 μm過(guò)濾器進(jìn)行除菌,將200 mL過(guò)濾葉汁加入等體積滅菌后的2倍水瓊脂培養(yǎng)基中(瓊脂 40 g,蒸餾水1 000 mL,pH值6.5±0.5),混合均勻后傾倒平板。

    菌株的鑒定利用 CTAB 法提取菌株純培養(yǎng)的基因組DNA,進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增引物、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照王芳[12]的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物送至湖南擎科生物測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 Blast 比對(duì)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 湘南臍橙采用不同引物進(jìn)行柑橘黃龍病PCR檢測(cè)的結(jié)果

    2.1.1 樣品總核酸提取質(zhì)量 如圖2所示,4個(gè)樣品的總核酸提取較為成功,目的條帶亮度較高,符合后續(xù)PCR檢測(cè)要求。

    2.1.2 不同引物擴(kuò)增結(jié)果 如圖3所示,2號(hào)樣品和3號(hào)樣品采用P535和P400引物均擴(kuò)增出柑橘黃龍病基因條帶,1號(hào)樣品只有P400引物擴(kuò)增出了條帶,而16S和OI這2對(duì)引物在4個(gè)樣品中均未擴(kuò)增出條帶;從擴(kuò)增出的條帶亮度來(lái)看,P400引物擴(kuò)增出的條帶較為清晰,且目的條帶的亮度與病害發(fā)病程度呈正相關(guān)性。因此,可以認(rèn)為在柑橘黃龍病的常規(guī)PCR檢測(cè)中,湘南臍橙總核酸對(duì)P400引物的靈敏度最高,其次為P535引物,而OI和 16S這2對(duì)引物的靈敏度較低。

    2.2 湘南臍橙中柑橘黃龍病株內(nèi)生細(xì)菌的分離結(jié)果

    試驗(yàn)結(jié)果顯示,從1~3號(hào)湘南臍橙樣品中分離挑選出180株細(xì)菌,通過(guò)16S rDNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)這些菌株分別屬于短桿菌屬(Curtobacterium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、異常球菌屬(Deinococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、甲基桿菌屬(Methylobac-terium)、微桿菌屬(Microbacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus);其中,LB,1/10LB和臍橙葉汁培養(yǎng)基中分別挑取60株,LB培養(yǎng)基中有短桿菌屬15株 、鞘氨醇單胞菌屬13株、芽孢桿菌屬13株為優(yōu)勢(shì)菌屬;1/10 LB培養(yǎng)基中有短桿菌屬12株 、鞘氨醇單胞菌屬10株、芽孢桿菌屬8株為優(yōu)勢(shì)菌屬;而在臍橙樹(shù)葉汁培養(yǎng)基中有短桿菌屬11株、鞘氨醇單胞菌屬8株、微桿菌屬7株為優(yōu)勢(shì)菌屬;分離鑒定部分結(jié)果見(jiàn)表2。

    3 結(jié)論與討論

    柑橘黃龍病是一類專性寄生在蕓香科植物韌皮部的植物病害,研究表明,柑橘黃龍病病菌會(huì)引起篩孔堵塞,導(dǎo)致植物篩管運(yùn)輸糖類、養(yǎng)分等可溶性有機(jī)物的功能喪失,最終導(dǎo)致植物葉片缺素、黃化、斑駁甚至枯萎死亡[13]。當(dāng)前對(duì)于柑橘黃龍病既無(wú)特效治療藥物也無(wú)抗性品種,這使得該病對(duì)柑橘生產(chǎn)造成毀滅性打擊,號(hào)稱“柑橘癌癥”,一旦發(fā)病就無(wú)可救藥,只能做出“砍一株保一園,砍一園保一片,砍一片保一業(yè)”的下策[14-15]。而目前,湘南地區(qū)的臍橙產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢(shì)頭正旺盛,特別是“宜章臍橙”因其獨(dú)特的氣候、土壤等優(yōu)勢(shì)已成功申報(bào)地理證明商標(biāo)。但隨著氣候變暖,柑橘木虱的北擴(kuò),使得當(dāng)?shù)卦S多果園出現(xiàn)了果樹(shù)葉片黃化,果實(shí)青化、畸形及植株枯死的現(xiàn)象。因此,尋求一組高特異性、高靈敏度、高穩(wěn)定性的柑橘黃龍病PCR檢測(cè)引物,幫助種植戶在生產(chǎn)中及時(shí)、快捷地確診湘南地區(qū)臍橙的柑橘黃龍病病害顯得尤為重要,對(duì)湘南地區(qū)臍橙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也具有重要意義。此外,借助植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)普遍存在這一自然特性以及其與植物親和的天然優(yōu)勢(shì),利用內(nèi)生菌來(lái)防治植物病害現(xiàn)已成為了一種綠色、高效的植物病害防治措施[16]。因此,研究從湘南地區(qū)幾個(gè)臍橙種植園采集柑橘黃龍病疑似病株樣品和健康植株樣品,利用柑橘黃龍病PCR檢測(cè)常用引物對(duì)樣品進(jìn)行分子檢測(cè),并從病株組織中分離內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分析鑒定,為湘南地區(qū)臍橙的柑橘黃龍病害檢測(cè)與防控提供一定的參考。

    試驗(yàn)結(jié)果表明,P400引物是湘南地區(qū)臍橙中柑橘黃龍病害常規(guī)PCR檢測(cè)的最佳引物;對(duì)臍橙中柑橘黃龍病病株組織內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定發(fā)現(xiàn),柑橘中內(nèi)生細(xì)菌主要?dú)w類為7個(gè)屬,分別為短桿菌屬(Curtobacterium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、異常球菌屬(Deinococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus);其中,LB和1/10LB培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)菌屬為短桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和芽孢桿菌屬;而臍橙樹(shù)葉汁培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)菌屬為短桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和微桿菌屬。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 葉娟娟. 湘南臍橙綠色栽培管理模式研究淺析[EB/OL]. https://www.xzbu.com/4/view-4480726.htm,2013.

    [2] Gao S,Garnier M,Bové J M. Production of monoclonal antibodies recognizing most Asian strains of the greening BLO by in vitro immunization with an antigenic protein purified from the BLO[A]. Moreno P,da Graca J V,Timmer L W,et al. Proceedings of the 12th Conference IOCV[C]. California:Riverside,1993,244-249.

    [3] Bastianel C,Garnier-Semancik M,Renaudin J,et al. Diversity of “candidatus liberibacter asiaticus” based on the omp gene sequence[J]. Applied and Environmental Microbiology,2005,71(11):6473-6478.

    [4] 董 俊. 湖南省柑橘黃龍病調(diào)查及病菌遺傳多樣性分析[D]. 長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

    [5] 唐婭媛. 湖南省柑橘黃龍病病原PCR檢測(cè)及病害分布情況調(diào)查[D]. 長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

    [6] 王 紅,張秋明,王春梅. 湘南地區(qū)柑橘黃龍病的PCR檢測(cè)[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,33(2):164-166.

    [7] 高玉霞,盧占軍,鐘八蓮,等. 柑橘黃龍病常規(guī)PCR檢測(cè)4對(duì)引物的特異性和靈敏度[J]. 中國(guó)南方果樹(shù),2014,43(1):5-8.

    [8] 丁 芳,王國(guó)平,易干軍,等. 不同引物對(duì)檢測(cè)柑橘黃龍病菌靈敏度比較[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào),2007,34(4):364-368.

    [9] 孔維文,鄧曉玲,梁志慧,等. 柑橘黃龍病病原DNA片段的克隆及序列分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào),2000,30(1):71-75.

    [10] Hocquellet A,Toorawa P,Bové J M,et al. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon[J]. Molecular & Cellular Probes,1999,13(5):373-379.

    [11] 王真真,徐 婷,袁珊珊,等. 水稻內(nèi)生放線菌OsiRt-1的分離鑒定及對(duì)稻瘟病的防治作用[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2016,43(5):1009-1018.

    [12] 王 芳. 柑橘黃龍病兩種植物寄主內(nèi)生細(xì)菌的分離及分析[D]. 重慶:重慶大學(xué),2014.

    [13] Da G J,Douhan G W,Halbert S E,et al. Huanglongbing:An overview of a complex pathosystem ravaging the world's citrus[J]. 植物學(xué)報(bào)(英文版),2016,58(4):373-387.

    [14] 范國(guó)成,劉 波,吳如健,等. 中國(guó)柑橘黃龍病研究30年[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,24(2):183-190.

    [15] 鄧明學(xué). 柑橘黃龍病綜合防治的理論與實(shí)踐[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2006,22(6):307-310.

    [16] Tang J Z,Ding Y X,Nan J,et al. Transcriptome sequencing and ITRAQ reveal the detoxification mechanism of Bacillus GJ1,a potential biocontrol agent for Huanglongbing[J]. PLoS One,2018,13(8):e0200427.

    (責(zé)任編輯:成 平)

    猜你喜歡
    湘南臍橙
    臍橙連上物聯(lián)網(wǎng) 掃碼便知“前世今生”
    走過(guò)湘南
    湘南學(xué)聯(lián)綻放永不凋謝的初心之花
    湘南起義朱德“智取宜章”是否赴宴考辨
    贛南臍橙整形修剪技術(shù)
    贛南早臍橙在幾種中間砧木上高接換種的表現(xiàn)
    奉節(jié)臍橙
    臍橙豐產(chǎn)栽培技術(shù)
    謝湘南的詩(shī)
    詩(shī)潮(2014年7期)2014-02-28 14:11:24
    南昌將建臍橙保鮮庫(kù)
    保鮮與加工(2010年1期)2010-12-04 05:12:12
    一本色道久久久久久精品综合| 久久99一区二区三区| a级毛片在线看网站| 精品人妻1区二区| 精品高清国产在线一区| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲视频免费观看视频| 激情在线观看视频在线高清 | 久久狼人影院| 真人做人爱边吃奶动态| 精品一区二区三区四区五区乱码| 男女免费视频国产| 午夜福利欧美成人| 美女国产高潮福利片在线看| 高清在线国产一区| 热99re8久久精品国产| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 女性被躁到高潮视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 成人手机av| 在线天堂中文资源库| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 午夜福利在线观看吧| 国产精品免费一区二区三区在线 | 天堂动漫精品| 午夜精品国产一区二区电影| 精品久久久精品久久久| 国产激情久久老熟女| a级毛片在线看网站| 18禁国产床啪视频网站| 免费在线观看影片大全网站| 午夜免费鲁丝| 国产极品粉嫩免费观看在线| videosex国产| 国产高清videossex| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲第一av免费看| 在线观看66精品国产| 美女福利国产在线| 高清av免费在线| 老鸭窝网址在线观看| 国产不卡av网站在线观看| 不卡一级毛片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲久久久国产精品| 国产亚洲av高清不卡| 91麻豆av在线| 国产av精品麻豆| 美女午夜性视频免费| 黄片播放在线免费| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 99精品欧美一区二区三区四区| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲三区欧美一区| 男男h啪啪无遮挡| 这个男人来自地球电影免费观看| 蜜桃在线观看..| 下体分泌物呈黄色| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产成人精品无人区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 色老头精品视频在线观看| 少妇的丰满在线观看| 免费观看人在逋| av在线播放免费不卡| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 交换朋友夫妻互换小说| 国产av一区二区精品久久| 亚洲精品国产区一区二| √禁漫天堂资源中文www| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产一卡二卡三卡精品| 黄色视频在线播放观看不卡| 搡老乐熟女国产| 中文欧美无线码| 他把我摸到了高潮在线观看 | 久久亚洲精品不卡| 热re99久久精品国产66热6| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久久久国内视频| 日本黄色日本黄色录像| 日韩中文字幕欧美一区二区| 99久久精品国产亚洲精品| 久久中文字幕一级| 欧美黑人精品巨大| 九色亚洲精品在线播放| 国产高清国产精品国产三级| 无人区码免费观看不卡 | 最新美女视频免费是黄的| 国产一区二区在线观看av| 男女边摸边吃奶| 久久精品人人爽人人爽视色| tube8黄色片| 动漫黄色视频在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 麻豆av在线久日| 国产三级黄色录像| 一区福利在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 桃红色精品国产亚洲av| 69av精品久久久久久 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产成人精品无人区| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 18禁观看日本| 成人国产一区最新在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 视频区图区小说| 国产欧美日韩一区二区三| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 午夜免费鲁丝| 亚洲人成电影免费在线| 大香蕉久久网| 成人国产一区最新在线观看| 一本综合久久免费| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久国产精品大桥未久av| 久久久久久人人人人人| 欧美久久黑人一区二区| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲七黄色美女视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 色在线成人网| 国产欧美日韩一区二区三区在线| a级毛片黄视频| 国产1区2区3区精品| 中国美女看黄片| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产精品电影一区二区三区 | 亚洲精品乱久久久久久| 久久中文看片网| 99久久99久久久精品蜜桃| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美成人午夜精品| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久热这里只有精品99| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久久久久久久久久久大奶| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 桃花免费在线播放| 久久久国产精品麻豆| 久久av网站| tube8黄色片| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美亚洲日本最大视频资源| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产在线精品亚洲第一网站| 两人在一起打扑克的视频| av福利片在线| 中国美女看黄片| 高清毛片免费观看视频网站 | 高清毛片免费观看视频网站 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| av福利片在线| 欧美黄色淫秽网站| 成人国语在线视频| 老司机午夜福利在线观看视频 | 免费在线观看日本一区| 国产99久久九九免费精品| 亚洲精品久久午夜乱码| 青青草视频在线视频观看| 黄色怎么调成土黄色| 午夜免费鲁丝| 精品高清国产在线一区| 无限看片的www在线观看| 欧美性长视频在线观看| 亚洲色图av天堂| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 91九色精品人成在线观看| 一本大道久久a久久精品| 日日爽夜夜爽网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日本五十路高清| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产av又大| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产在线观看jvid| 国产成人系列免费观看| 精品亚洲成国产av| av线在线观看网站| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 欧美日韩av久久| 成年版毛片免费区| 男人舔女人的私密视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产三级黄色录像| 亚洲男人天堂网一区| 久久亚洲精品不卡| 久久久国产欧美日韩av| 免费黄频网站在线观看国产| 午夜精品国产一区二区电影| 妹子高潮喷水视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲精品国产区一区二| 一级黄色大片毛片| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品久久久精品久久久| 91九色精品人成在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| netflix在线观看网站| 欧美精品啪啪一区二区三区| 一级黄色大片毛片| 午夜两性在线视频| 婷婷成人精品国产| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲伊人色综图| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产精品免费一区二区三区在线 | 久久青草综合色| 色尼玛亚洲综合影院| 精品少妇久久久久久888优播| 色视频在线一区二区三区| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲色图综合在线观看| 午夜91福利影院| 成年人午夜在线观看视频| 国产一区二区三区视频了| 日韩欧美国产一区二区入口| av天堂在线播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久热这里只有精品99| 国产在线视频一区二区| 99re6热这里在线精品视频| 国产亚洲av高清不卡| 成人永久免费在线观看视频 | 在线观看www视频免费| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 美女国产高潮福利片在线看| 下体分泌物呈黄色| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 在线观看舔阴道视频| 一区二区三区国产精品乱码| 久久国产精品大桥未久av| 电影成人av| 香蕉国产在线看| 午夜老司机福利片| 一本色道久久久久久精品综合| 久久ye,这里只有精品| 国产成人av激情在线播放| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲免费av在线视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 精品少妇久久久久久888优播| 欧美乱妇无乱码| videosex国产| 男女午夜视频在线观看| 色播在线永久视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 高清毛片免费观看视频网站 | 亚洲国产av新网站| 男女免费视频国产| 美女高潮到喷水免费观看| 丁香六月天网| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 两个人看的免费小视频| 日本一区二区免费在线视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产成人系列免费观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 在线观看免费视频网站a站| 久久中文看片网| 99国产精品免费福利视频| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲av美国av| 嫩草影视91久久| 无遮挡黄片免费观看| 国产免费av片在线观看野外av| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 中文欧美无线码| 美女高潮到喷水免费观看| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品久久久av美女十八| 搡老岳熟女国产| 日韩视频在线欧美| 欧美在线黄色| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美午夜高清在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | a级毛片在线看网站| 欧美激情高清一区二区三区| 精品人妻在线不人妻| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久久久网色| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲熟女毛片儿| 精品国产亚洲在线| 999久久久国产精品视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 在线永久观看黄色视频| 国产91精品成人一区二区三区 | 99在线人妻在线中文字幕 | 午夜日韩欧美国产| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品一区二区三区av网在线观看 | 一级片'在线观看视频| 18在线观看网站| 中国美女看黄片| 亚洲天堂av无毛| 欧美日韩视频精品一区| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产高清激情床上av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 丁香六月天网| 国产高清激情床上av| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 99在线人妻在线中文字幕 | 国产激情久久老熟女| 色尼玛亚洲综合影院| xxxhd国产人妻xxx| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 下体分泌物呈黄色| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久久久久免费高清国产稀缺| 大型黄色视频在线免费观看| 啦啦啦免费观看视频1| 无遮挡黄片免费观看| 国产免费av片在线观看野外av| 女人久久www免费人成看片| 久久国产精品大桥未久av| 69av精品久久久久久 | tocl精华| 中文欧美无线码| 男女下面插进去视频免费观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产精品成人在线| 中文欧美无线码| 日本av免费视频播放| 最黄视频免费看| 99热国产这里只有精品6| 最新在线观看一区二区三区| 最新的欧美精品一区二区| 久久久国产一区二区| netflix在线观看网站| 亚洲色图av天堂| 亚洲专区中文字幕在线| 九色亚洲精品在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美中文综合在线视频| 黄色丝袜av网址大全| 成人影院久久| 久久久久久久久免费视频了| 人人澡人人妻人| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 日本黄色日本黄色录像| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 最近最新免费中文字幕在线| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲国产av新网站| 免费av中文字幕在线| 真人做人爱边吃奶动态| 国产精品久久久久久精品电影小说| 丰满饥渴人妻一区二区三| 五月天丁香电影| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲五月色婷婷综合| 99国产精品一区二区三区| 国产精品熟女久久久久浪| 在线观看66精品国产| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲熟妇熟女久久| 国产av一区二区精品久久| 国产一区二区三区综合在线观看| 日韩欧美免费精品| 免费人妻精品一区二区三区视频| 免费不卡黄色视频| 亚洲国产av新网站| 1024视频免费在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲一区中文字幕在线| 丁香欧美五月| 成人亚洲精品一区在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 韩国精品一区二区三区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产深夜福利视频在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品福利永久在线观看| 99热网站在线观看| 在线观看免费高清a一片| 热99国产精品久久久久久7| 国产日韩欧美视频二区| 国产亚洲精品第一综合不卡| av有码第一页| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 午夜成年电影在线免费观看| 9191精品国产免费久久| 另类精品久久| 午夜福利一区二区在线看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产区一区二久久| 日日夜夜操网爽| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 精品亚洲成国产av| 91精品三级在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 高清av免费在线| 又黄又粗又硬又大视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 91精品三级在线观看| 两性夫妻黄色片| 日本av手机在线免费观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品二区激情视频| 午夜福利在线观看吧| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 黄色 视频免费看| 亚洲国产看品久久| 俄罗斯特黄特色一大片| 美女扒开内裤让男人捅视频| 一本久久精品| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲性夜色夜夜综合| bbb黄色大片| 日本av手机在线免费观看| 一级黄色大片毛片| 黄色视频不卡| 欧美日韩成人在线一区二区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产野战对白在线观看| 麻豆成人av在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 久久久久精品人妻al黑| 麻豆国产av国片精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美国产精品va在线观看不卡| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 麻豆国产av国片精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 麻豆av在线久日| 91麻豆av在线| 99国产极品粉嫩在线观看| avwww免费| 国产福利在线免费观看视频| 首页视频小说图片口味搜索| 久久精品国产综合久久久| 久久久久久久国产电影| 免费观看人在逋| 国产精品成人在线| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 高清欧美精品videossex| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久久久精品人妻al黑| 免费观看av网站的网址| 在线观看免费午夜福利视频| 日本av手机在线免费观看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产精品二区激情视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 狂野欧美激情性xxxx| 高清欧美精品videossex| 搡老岳熟女国产| 黄频高清免费视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 丰满少妇做爰视频| 精品亚洲成国产av| 成人国产一区最新在线观看| 国产一卡二卡三卡精品| 精品久久久久久电影网| 欧美精品亚洲一区二区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | av福利片在线| 亚洲精品av麻豆狂野| av线在线观看网站| 中文字幕人妻丝袜制服| 看免费av毛片| 久久狼人影院| 国产麻豆69| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲全国av大片| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产男女内射视频| 国产免费福利视频在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 少妇精品久久久久久久| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 香蕉丝袜av| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲精品国产区一区二| 久久中文字幕一级| 99热国产这里只有精品6| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 日本欧美视频一区| 久久久久国内视频| 看免费av毛片| 黄色 视频免费看| 一级片免费观看大全| 午夜免费鲁丝| 国产又爽黄色视频| 国产麻豆69| 岛国在线观看网站| 久久久久精品人妻al黑| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 咕卡用的链子| 美女午夜性视频免费| 1024视频免费在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲第一av免费看| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲av美国av| bbb黄色大片| 亚洲色图av天堂| 成年人免费黄色播放视频| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲全国av大片| cao死你这个sao货| 国产1区2区3区精品| 91字幕亚洲| 免费看十八禁软件| 午夜日韩欧美国产| 欧美在线黄色| 在线观看免费午夜福利视频| 超碰成人久久| 日韩三级视频一区二区三区| 操美女的视频在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 性少妇av在线| 久久 成人 亚洲| 丁香欧美五月| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 91九色精品人成在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 日本wwww免费看| 女同久久另类99精品国产91| 黑丝袜美女国产一区| 欧美大码av| 中文字幕制服av| 欧美日本中文国产一区发布| svipshipincom国产片| 三上悠亚av全集在线观看| 免费观看av网站的网址| av国产精品久久久久影院| 亚洲成人国产一区在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 水蜜桃什么品种好| 91成年电影在线观看| 最黄视频免费看| 美女国产高潮福利片在线看| 黄频高清免费视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久狼人影院| 视频在线观看一区二区三区| 日本av手机在线免费观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲天堂av无毛| 国产精品一区二区精品视频观看| 91成年电影在线观看| 一级片'在线观看视频| 久久久久久久国产电影| 男女边摸边吃奶| 久久久久久久久久久久大奶| 夜夜夜夜夜久久久久| 超碰成人久久| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 中文字幕精品免费在线观看视频| 99re6热这里在线精品视频| 狂野欧美激情性xxxx| 999久久久精品免费观看国产| 中文字幕人妻丝袜一区二区| av片东京热男人的天堂| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 视频区欧美日本亚洲| 色尼玛亚洲综合影院| 国产高清视频在线播放一区| 夜夜爽天天搞| 亚洲欧美一区二区三区久久| 午夜福利欧美成人| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲精品av麻豆狂野| 99re在线观看精品视频| 99精品久久久久人妻精品| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 电影成人av| 国产亚洲精品一区二区www | 久久久久国内视频| 成人精品一区二区免费| 国产精品免费一区二区三区在线 | 在线永久观看黄色视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美激情高清一区二区三区| 黄色毛片三级朝国网站| 国产av一区二区精品久久|