龍血素B對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和遷移的影響

張文瑞　許春姣　郭怡婷　孫煜梅

[摘要]目的：觀察龍血素B（Loureirin B，LB）對(duì)體外培養(yǎng)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（Immortalized human keratinocytes，HaCaT）增殖和遷移的影響，探究LB是否促進(jìn)創(chuàng)面愈合再上皮化過程。方法：噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)不同濃度LB對(duì)體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞增殖的影響，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分析LB對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果：5、10、25、50μg/ml LB呈劑量依賴性抑制HaCaT細(xì)胞增殖（P<0.05），10、25μg/ml LB呈劑量依賴性抑制劃痕愈合及HaCaT細(xì)胞遷移（P<0.01）。結(jié)論：LB具有顯著抑制HaCaT細(xì)胞增殖和遷移的作用，提示LB可能抑制創(chuàng)面愈合再上皮化過程。

[關(guān)鍵詞]龍血素B;角質(zhì)形成細(xì)胞;細(xì)胞增殖;創(chuàng)面愈合;再上皮化

[中圖分類號(hào)]Q343.6? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2020）08-0031-03

The Effects of Loureirin B on Proliferation and Migration of HaCaT Cells

ZHANG Wen-rui，XU Chun-jiao，GUO Yi-ting，SUN Yu-mei

（Central of Stomatology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410008，Hunan，China）

Abstract： Objective? To observe the effects of Loureirin B （LB） on proliferation and migration of human immortalized human keratinocytes （HaCaT） in vitro， and explore whether LB can promote the re-epithelialization process of wound healing. Methods? The effects of different concentrations of LB on proliferation of HaCaT cells were evaluated by MTT assay， and the effects on migration of HaCaT cells were analyzed by scratch wound assays. Results? 5， 10， 25， 50μg/ml LB inhibited proliferation of HaCaT cells in a dose-dependent manner （P<0.05）. 10， 25μg/ml LB suppressed scratch closure and migration of HaCaT cells in a dose-dependent manner （P<0.01）. Conclusion? LB can significantly inhibit proliferation and migration of HaCaT cells， suggesting that LB may have an inhibitory effect on the re-epithelialization process of wound healing.

Key words： Loureirin B; keratinocytes; cell proliferation; wound healing; re-epithelialization

龍血竭（Dragons blood，DB）為龍血樹屬植物樹干受損傷后，在微生物侵染和或自然氧化作用下產(chǎn)生的含脂木材經(jīng)乙醇提取得到的樹脂，是血竭的國(guó)產(chǎn)替代品[1-2]。龍血竭具有活血化瘀、止血、降糖降脂、抗菌、增強(qiáng)免疫、促進(jìn)表皮修復(fù)、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等藥理作用，臨床上用于治療冠心病、消化性潰瘍、軟組織損傷、放射性皮炎、燒傷、壓瘡等[3]。創(chuàng)面愈合基本過程有三期[4]：①炎癥期;②增生期：包括再上皮化、血管再生、纖維組織增生和傷口收縮;③改建期。大量研究表明龍血竭促進(jìn)創(chuàng)面愈合[5-7]，但研究中多使用其簡(jiǎn)單提取物或成方制劑，涉及其內(nèi)在有效成分的研究不多，具體促進(jìn)創(chuàng)面愈合的活性成分尚未明確。龍血素B（Loureirin B，LB）是龍血竭中含量較為豐富的二氫查耳酮類化合物，具有抗氧化[8]、活血[9]、抗炎[10]、鎮(zhèn)痛[11]等作用，本研究通過觀察LB對(duì)體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞增殖及遷移的影響，探究LB是否促進(jìn)創(chuàng)面愈合再上皮化過程。

1? 材料和方法

1.1 細(xì)胞：人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT），由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院皮膚科實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 藥品與試劑：龍血素B（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111558-201407）;胎牛血清（BI，以色列）;高糖DMEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素、PBS（HyClone，美國(guó)）;胰酶-EDTA消化液（Gibco，美國(guó)）;MTT、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma，美國(guó)）。

1.3 儀器：超凈工作臺(tái)（上海力申科學(xué)儀器公司，中國(guó)，型號(hào)：HFsafe-1200TE）;二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，美國(guó)，型號(hào)：371）;倒置顯微鏡（Leica，德國(guó)，型號(hào)：DMIL-LED）;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)，型號(hào)：Epoch）;離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)，型號(hào)：5702 R）;微孔板振蕩器（Thermo Fisher，美國(guó)，型號(hào)：4625-1CEM）;電子天平（METTLER TOLEDO，中國(guó)，型號(hào)：EL204）。

1.4 方法

1.4.1 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)：將凍存狀態(tài)的HaCaT細(xì)胞于37℃下快速?gòu)?fù)蘇后，接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞接近長(zhǎng)滿單層后胰酶消化并傳代。

1.4.2 LB母液制備：將20mg LB溶解于800μl DMSO，制備成濃度為25mg/ml的母液，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 MTT細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，經(jīng)消化、重懸、計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml，每孔100μl細(xì)胞懸液接種于96孔板，空白調(diào)零組加不含細(xì)胞的培養(yǎng)液100μl，邊緣孔100μl PBS填充。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h貼壁后取出，棄去培養(yǎng)液，分別加含不同濃度LB（2.5、5、10、25、50μg/ml）10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，平行5孔，陰性對(duì)照組加入含0.2% DMSO的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48h后棄上清液，PBS洗1次，每孔加入MTT（5mg/ml）與含10%胎牛血清DMEM按1：10體積配置的培養(yǎng)液100μl，37℃下繼續(xù)孵育4h，1ml注射器小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入100μl DMSO，室溫振蕩10min以使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀上在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度值（OD值）。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

相對(duì)細(xì)胞活力計(jì)算公式：

1.4.4 觀察細(xì)胞形態(tài)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，以2.5×105個(gè)/孔接種于6孔板中。37℃孵育24h后，更換培養(yǎng)液為含0.1% DMSO或25μg/ml LB的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，倒置顯微鏡100×、200×、400×放大倍數(shù)下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.4.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，提前用記號(hào)筆在6孔板背后約每隔1cm劃1條直線，橫穿過孔，每孔劃3條線，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，取出6孔板，用10μl槍頭垂直標(biāo)記線筆直劃下，貼壁緩慢加入PBS洗3次，去除漂浮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組加入含10μg/ml、25μg/ml LB的1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，對(duì)照組加入含0.1% DMSO的1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0h、24h倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的愈合程度，以每條標(biāo)記線的上下緣與劃痕交叉點(diǎn)作為觀察點(diǎn)，即每孔6個(gè)觀察點(diǎn)，拍照記錄。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕面積。

劃痕愈合率計(jì)算公式：

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用（x?±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 LB對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活力的影響：如圖1所示，與0.2% DMSO對(duì)照組相比，LB作用HaCaT細(xì)胞48h，在濃度為5μg/ml（P<0.05），10、25、50μg/ml（P<0.01）時(shí)細(xì)胞增殖活力被顯著抑制，并呈劑量依賴性。本次預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用濃度低于2.5μg/ml梯度濃度LB處理HaCaT細(xì)胞亦未見促增殖作用。

注：與0.2% DMSO對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2 LB對(duì)HaCaT細(xì)胞形態(tài)的影響：如圖2顯示，0.2% DMSO對(duì)照組細(xì)胞密度大，貼壁能力強(qiáng)，僅少量細(xì)胞變圓，25μg/ml LB組細(xì)胞密度相對(duì)減小，較多細(xì)胞體積縮小變圓，與周圍的細(xì)胞連接消失，貼壁性變差，折光性增強(qiáng)。

2.3 LB對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移的影響：如圖3顯示，與0.1% DMSO對(duì)照組相比，10μg/ml、25μg/ml LB作用HaCaT細(xì)胞24h，劃痕愈合被顯著抑制（P<0.01），并呈劑量依賴性。

注：與0.1% DMSO對(duì)照組相比，**P<0.01

3? 討論

血竭又名“麒麟竭”，來源于棕櫚科植物麒麟竭（Daemonorops draco BI.），由該植物果實(shí)滲出的樹脂經(jīng)加工制成，多產(chǎn)于印度尼西亞，也稱為進(jìn)口血竭。血竭成分復(fù)雜，血竭素（Dracorhodin）是其主要有效成分。而國(guó)產(chǎn)血竭為百合科龍血樹屬劍葉龍血樹（Dracaena cochinchinensis）的含脂木材經(jīng)乙醇提取得到的樹脂，包括產(chǎn)于廣西、云南、海南的龍血竭，其主要活性成分為龍血素A、龍血素B等。血竭、龍血竭來源不同，主要活性成分不同，龍血竭尚不能完全代替血竭[12-13]。此外Dragons blood還可來源于巴豆屬（Croton spp.）植物及紫檀屬（Pterocarpus spp.）植物[14]。

研究表明血竭、龍血竭均可促進(jìn)創(chuàng)面愈合。而本研究發(fā)現(xiàn)LB具有顯著抑制HaCaT細(xì)胞增殖和遷移的作用，提示LB可能抑制創(chuàng)面愈合的再上皮化過程，與預(yù)期結(jié)果相反。李丹等[15]發(fā)現(xiàn)血竭乙酸乙酯提取物具有顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖作用，提示血竭可能具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合中再上皮化的作用。血竭素高氯酸鹽可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及傷口愈合[16]，而國(guó)產(chǎn)龍血竭不含進(jìn)口血竭所含有的血竭素[17]。于浩飛等[6]發(fā)現(xiàn)龍血竭軟膏促進(jìn)大鼠創(chuàng)傷愈合，且龍血素A、B含量較高的軟膏效果更明顯，猜測(cè)龍血竭多酚性成分可能與龍血竭愈創(chuàng)活性有關(guān)。多酚類化合物可能在傷口表面上形成保護(hù)層，其物理屏障及抗菌抗炎作用可防止感染，也可能通過與蛋白質(zhì)結(jié)合而凝結(jié)并堵塞傷口，間接促進(jìn)創(chuàng)面愈合[14，18]。龍血竭中化學(xué)成分復(fù)雜，酚類化合物是其主要生物活性成分，根據(jù)結(jié)構(gòu)主要分為：①二氫查耳酮類，有龍血素A，B，C，D和劍葉龍血素A等;②查耳酮類;③黃烷類;④黃酮類和二氫黃酮類;⑤色原酮類;⑥聚合黃酮類;⑦其他酚類，如白藜蘆醇、紫檀茋。此外還有多種萜類、甾體及甾體皂苷類成分[19]。龍血竭促進(jìn)創(chuàng)面愈合的成分及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

研究表明LB通過TGF-β通路抑制瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積[20-21]，LB通過Wnt/β-catenin通路抑制肝星狀細(xì)胞增殖[22]，LB抑制脂肪細(xì)胞增殖并使細(xì)胞增殖周期阻滯在G2期[23]，提示LB可能對(duì)多種細(xì)胞有抑制增殖作用。其機(jī)制可能與LB通過激活A(yù)kt/GSK3β通路來增加微管穩(wěn)定性[24]，抑制有絲分裂過程有關(guān)。觀察到LB作用HaCaT細(xì)胞后出現(xiàn)細(xì)胞變圓、細(xì)胞連接消失等凋亡早期形態(tài)改變，LB是否促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡仍需進(jìn)一步研究。

LB抑制血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）活性[9]，是其活血化瘀的重要機(jī)制。而PAI-1在上皮細(xì)胞遷移和傷口愈合中發(fā)揮重要作用[25-27]，抑制PAI-1活性會(huì)抑制上皮細(xì)胞遷移和傷口愈合[28]。因此，LB可能通過抑制PAI-1活性抑制HaCaT細(xì)胞遷移并影響傷口愈合再上皮化過程，但LB是否抑制創(chuàng)面愈合仍需進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，LB具有顯著抑制HaCaT細(xì)胞增殖和遷移的作用，提示LB可能抑制創(chuàng)面愈合再上皮化過程，龍血竭促進(jìn)創(chuàng)面愈合的成分及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。此外，對(duì)龍血竭有效成分的分離與研究仍需進(jìn)一步深入，探明各成分及其作用機(jī)制，細(xì)化中藥成分及用途，其應(yīng)用前景將更廣闊。

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[收稿日期]2019-12-30

本文引用格式：張文瑞，許春姣，郭怡婷，等.龍血素B對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和遷移的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2020，29（8）：31-34.