孕期納米銀暴露對(duì)子代雌性成年小鼠乳腺干細(xì)胞分化的影響

江 浩，趙 凡，喻家鍵，王紅珠，孫曉偉，高 慧

（溫州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，浙江 溫州 325035）

納米顆粒，又稱超細(xì)粒子，其粒徑介于1～100nm之間，具有宏觀材料不具有的許多優(yōu)異特性，如表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和量子隧穿效應(yīng)等［1］。隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米產(chǎn)品逐漸進(jìn)入人們的日常生活。納米銀顆粒（silver nanoparticles，Ag-NP）直徑一般在25～50 nm之間，由于它的低毒性、高抗菌性和廣泛的抗菌譜，已發(fā)展成為使用最廣泛的無機(jī)抗菌材料［2］。研究發(fā)現(xiàn)，Ag-NP具有多方面的毒性效應(yīng)，如細(xì)胞毒性［3-4］、遺傳毒性［5］和神經(jīng)系統(tǒng)毒性［6-7］等，而且它的毒性大小還與粒徑和劑量相關(guān)。IVASK等［8］通過研究不同粒徑的Ag-NP對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的殺傷作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ag-NP徑越小，越容易穿過屏障，它的毒性也就越強(qiáng)。體內(nèi)生殖毒性實(shí)驗(yàn)表明，BALB/C小鼠在暴露于Ag-NP時(shí)，Ag-NP可通過胎盤屏障或母乳而傳遞給后代，并可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩［9］。因此，研究Ag-NP的毒性效應(yīng)及其作用機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

在動(dòng)物和人類的生命過程中，干細(xì)胞保留了復(fù)制和分化成組織中所有類型細(xì)胞的潛能［10］，該過程主要由組織特異性干細(xì)胞的對(duì)稱或非對(duì)稱分裂形成。乳腺干細(xì)胞是一類成體干細(xì)胞，它對(duì)于雌性哺乳動(dòng)物在青春期、妊娠期、泌乳期和衰退期中乳腺的生長(zhǎng)發(fā)育和泌乳等過程發(fā)揮著重要的作用。學(xué)者們通過不同的特異標(biāo)記對(duì)小鼠不同乳腺上皮細(xì)胞群進(jìn)行分選，并通過移植得到了具有再生能力的特異細(xì)胞群。直到2006年，研究發(fā)現(xiàn)單個(gè)乳腺干細(xì)胞可形成完整的再生乳腺，并由此證實(shí)了乳腺干細(xì)胞的存在［11］。隨著對(duì)乳腺干細(xì)胞研究的不斷深入，現(xiàn)已可通過CD24，CD29和CD49f等表面抗體成功分離得到小鼠的乳腺干細(xì)胞。嚙齒類動(dòng)物乳腺發(fā)育和活動(dòng)過程中有2種主要的上皮細(xì)胞：含有乳腺干細(xì)胞的基底細(xì)胞和含有乳腺祖細(xì)胞的管腔細(xì)胞［12-13］。研究發(fā)現(xiàn)，包括乳腺癌干細(xì)胞在內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞可能源于自我更新機(jī)制出現(xiàn)異常變化的正常干細(xì)胞，干細(xì)胞隨著化學(xué)毒物暴露增加而易累積基因突變，且其又能自我更新，因而被許多學(xué)者認(rèn)為其可能是乳腺癌的原發(fā)細(xì)胞［14-16］。Ag-NP暴露于細(xì)胞，也可被某些細(xì)胞膜受體識(shí)別，如N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR），經(jīng)過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞中，最終進(jìn)入線粒體等細(xì)胞器中，破壞它們的正常功能，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［17］。其次，氧化應(yīng)激也是Ag-NP產(chǎn)生毒性效應(yīng)的一個(gè)重要誘因。Ag-NP可直接刺激細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），也可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，間接誘導(dǎo)生成ROS，而ROS水平的增加可引起線粒體內(nèi)膜的損傷，最終導(dǎo)致遺傳毒性和細(xì)胞毒性［18-19］。有研究發(fā)現(xiàn)，Ag-NP產(chǎn)生的細(xì)胞毒性與其釋放的銀離子有重要的關(guān)系，但Ag-NP本身也會(huì)對(duì)這種毒性效應(yīng)具有協(xié)同作用［20］。目前Ag-NP對(duì)乳腺干細(xì)胞的影響尚未有研究報(bào)道。本研究通過孕期Ag-NP暴露研究其對(duì)乳腺干細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)，探討Ag-NP增加乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

Ag-NP（純度99.5%，直徑＜100 nm）、蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）、B-27、肝素、胰島素、氫化可的松、慶大霉素、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（美國(guó)Sigma公司）；氯化銨溶液、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）、DNAse I、小鼠上皮細(xì)胞富集試劑盒、Dispase、大鼠抗小鼠CD24-PE M1/69單克隆抗體、Mammocult基礎(chǔ)培養(yǎng)基和Mammocult Proliferation supplement（加拿大 Stem Cell公司）；大鼠抗小鼠CD49f-PE/Cy7 CoH3多克隆抗體（美國(guó)Biolegend公司）；Streptavidin-APC（美國(guó)Invitrogen公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；小鼠抗小鼠環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2，Cox-2）單克隆抗體、小鼠抗小鼠信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白5（signal transducer and activator of transcription 5，Stat5）單克隆抗體和小鼠抗小鼠K8單克隆抗體（美國(guó)Santa公司）；兔抗小鼠K14單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體（中國(guó)碧云天公司）；山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor?488）抗體和山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor?555）抗體（美國(guó)Abcam公司）。其余試劑均為分析純。

動(dòng)物麻醉系統(tǒng)（美國(guó)Microflex公司）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），KQ5200E型超聲波清洗器（昆山超聲儀有限公司）。

1.2 動(dòng)物

10周齡FVB-GFP小鼠購(gòu)買于美國(guó)的Jackson實(shí)驗(yàn)室，在動(dòng)物房繁殖。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)則飼養(yǎng)。飼養(yǎng)過程中使用的聚丙烯材質(zhì)的飼養(yǎng)籠及玻璃飲水瓶，飼料符合美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)（American Institute of Nutrition）標(biāo)準(zhǔn)，籠具、飲用水和飼料中均不含Ag-NP，可排除外界環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。

1.3 小鼠分組和染毒

10只10周齡雌性小鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分成2組，每組5只。將每2只雌鼠與1只雄鼠進(jìn)行合籠，在看到雌鼠陰道栓的當(dāng)天記作孕0天（pregnancy 0，P0）。將Ag-NP加到超純水中，40 kHz超聲15 min，使之混懸（Ag-NP表征圖見圖1）。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在孕期敏感窗口期于P12正常對(duì)照組ig給予超純水，Ag-NP組ig給予Ag-NP混懸液5 mg·kg-1［21-24］連續(xù)7 d。子代小鼠19日齡時(shí)雌雄分籠，飼養(yǎng)條件均按1.2進(jìn)行，待子代小鼠3月齡時(shí)進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

Fig.1 Transmission electronic micrograph of silver nano particles（Ag-NPs）.

1.4 子宮、乳腺和肝組織的收集和處理

子代小鼠3月齡時(shí)，頸椎脫臼處死，記錄體質(zhì)量。取小鼠子宮和肝，稱重并拍照。取小鼠右側(cè)2個(gè)乳腺置于消化液中，制備單細(xì)胞懸液，用于流式分選；分選后得到的乳腺干細(xì)胞用于2D集落形成實(shí)驗(yàn)；收集2D集落形成實(shí)驗(yàn)中的集落，用于免疫熒光染色和Giemsa染色；左側(cè)腹股溝處乳腺用于洋紅-硫酸鋁鉀乳腺整體染色；左側(cè)胸腺處乳腺置于4%甲醛溶液中固定，用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.5 子宮長(zhǎng)度和直徑的檢測(cè)

取1.4制備的小鼠子宮自然擺放在手術(shù)墊上，用游標(biāo)卡尺測(cè)量記錄小鼠子宮的長(zhǎng)度和直徑。

1.6 洋紅-硫酸鋁鉀染色觀察乳腺導(dǎo)管形態(tài)

取小鼠1.4制備的腹股溝乳腺，固定液中固定10 h后分別經(jīng)70%乙醇、50%乙醇和雙蒸水浸泡后，加洋紅-硫酸鋁鉀染液染色過夜，第2天去除染液后，經(jīng)70%乙醇、95%乙醇和無水乙醇脫水后加二甲苯浸泡1 h進(jìn)行透明化處理。鏡下拍照觀察乳腺形態(tài)。Image J軟件定量淋巴結(jié)面積。

1.7 HE染色觀察乳腺導(dǎo)管增生

取1.4制備的左側(cè)胸腺乳腺石蠟切片4 μm厚。70℃烤片機(jī)上烤片15 min后二甲苯脫蠟，經(jīng)無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇和雙蒸水浸泡后蘇木精染色5 min，1%鹽酸乙醇分化10 s后置雙蒸水中終止分化。切片經(jīng)80%乙醇、95%乙醇處理后伊紅染色30 s，無水乙醇脫水后，二甲苯透明化處理，樹脂封片。鏡下觀察計(jì)數(shù)增生的乳腺導(dǎo)管。導(dǎo)管增生比例（%）=增生導(dǎo)管數(shù)/總導(dǎo)管數(shù)×100%。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠乳腺的干細(xì)胞亞群

取1.4制備的右側(cè)乳腺組織置消化液中，在37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中消化15 h后，依次用氯化銨、胰蛋白酶EDTA、中性蛋白酶和DnaseⅠ進(jìn)行處理，40 μm濾網(wǎng)過濾得到單細(xì)胞懸液。500×g離心5 min后加入HBSS，細(xì)胞重懸后先加生物素標(biāo)記的小鼠上皮細(xì)胞富集試劑盒（小鼠乳腺細(xì)胞）cocktail，冰上靜置15 min后清洗，離心重懸，分別加不同熒光素標(biāo)記的CD24-PE、鏈霉親和素、CD49f-PE/Cy7抗體，避光孵育15 min后離心，細(xì)胞重懸于細(xì)胞培養(yǎng)基中。流式細(xì)胞儀設(shè)置相應(yīng)的分選門分選收集細(xì)胞，采本實(shí)驗(yàn)室建立的乳腺干細(xì)胞定量方法［12］進(jìn)行定量分析乳腺重建單元（mammary repopulation unit，MRU）百分比、基底細(xì)胞和管腔細(xì)胞的比值（luminal to basal，L/B）、集落形成細(xì)胞（colony forming cell，CFC）百分比和管腔干細(xì)胞（luminal progenitor，LP）頻率。

1.9 集落形成實(shí)驗(yàn)和免疫熒光染色檢測(cè)乳腺管腔干細(xì)胞亞群集落百分比

12孔板提前培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（NIH-3T3），2 d后，棄培養(yǎng)液。向12孔板中加CFC培養(yǎng)基（Mammocult基礎(chǔ)培養(yǎng)基再加10%Mammocult proliferation supplement、2%B-27、5%FBS、bFGF 20 μg·L-1、EGF 20 μg·L-1、肝素 10 mg·L-1、胰島素10 mg·L-1、氫化可的松1 mg·L-1和慶大霉素50 mg·L-1），取1.8制備的小鼠乳腺管腔干細(xì)胞每孔加1000個(gè)分選出的管腔細(xì)胞，24 h后換成MM培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。9 d后，去培養(yǎng)基，冰甲醇固定，然后用0.3%PBST破膜，PBS洗滌。用10%血清封閉后，4℃一抗（K8 1∶200，K14 1∶500）孵育過夜。第2天，去一抗，加相應(yīng)二抗（1∶1000）孵育，最后去二抗，加DAPI和抗熒光淬滅劑，在熒光顯微鏡下分別計(jì)數(shù)K8+K14+，K8+K14-和K8-K14-3種管腔干細(xì)胞亞群集落并拍照。

1.10 Giemsa染色計(jì)數(shù)總集落數(shù)

取1.9制備的集落，棄集落培養(yǎng)液后加PBS輕輕清洗2次，然后即加適量冰甲醇固定，15 min后吸去冰甲醇用PBS清洗2次，然后加Giemsa染液染色30 min。PBS洗去多余的染液晾干后顯微鏡下計(jì)數(shù)集落數(shù)（細(xì)胞≥50個(gè)為1個(gè)集落）。

1.11 免疫組織化學(xué)檢測(cè)乳腺導(dǎo)管Cox-2和Stat5蛋白表達(dá)

取1.4制備的小鼠左側(cè)乳腺組織石蠟包埋后，4 μm切片。組織切片二甲苯脫蠟，浸到梯度乙醇中進(jìn)行水合，然后置提前預(yù)熱的抗原修復(fù)液中（Cox-2檸檬酸鈉pH6.0，Stat5 Tris/EDTA pH9.0）抗原修復(fù)15 min后，置封閉內(nèi)源性過氧化物酶中。取出進(jìn)行細(xì)胞透膜，然后10%二抗種屬來源血清封閉和一抗（Cox-2 1∶400，Sata5 1∶200）孵育。4℃過夜后，去一抗，二抗（山羊抗小鼠1∶100）孵育1 h后，避光染DAB。觀察到棕色后，進(jìn)行蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，最后封片保存。顯微鏡下拍照，使用Image-Pro Plus軟件檢測(cè)染色導(dǎo)管的積分吸光度值（integrated absorbance，IA），表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。IA=總吸光度值/染色總面積。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 孕期納米銀暴露對(duì)子代成年雌性小鼠體質(zhì)量、存活率、子宮直徑和長(zhǎng)度的影響

圖2A～2D可見，孕期暴露Ag-NP后，子代小鼠的子宮形態(tài)未發(fā)生明顯變化。與正常對(duì)照組相比，Ag-NP染毒組子代小鼠存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（如圖2E），子代小鼠體質(zhì)量為（25.7±2.5）g，明顯高于正常對(duì)照組（18.3±2.7）g（P＜0.01）（圖2F）。

2.2 孕期暴露納米銀對(duì)子代成年雌性小鼠乳腺淋巴結(jié)面積和乳腺導(dǎo)管增生的影響

洋紅-硫酸鋁鉀染色結(jié)果顯示（圖3A～3C），正常對(duì)照組子代小鼠乳腺導(dǎo)管具有清晰的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)分支結(jié)構(gòu)（圖3A），Ag-NP染毒組子代小鼠乳腺導(dǎo)管的分支結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生異常，導(dǎo)管明顯變細(xì)，而且發(fā)生了顯著的紊亂（圖3B）；乳腺組織中含有淋巴結(jié)；淋巴結(jié)面積定量結(jié)果顯示，Ag-NP染毒組子代成年雌性小鼠乳腺淋巴結(jié)面積與正常對(duì)照組無顯著差異〔（150 026±111 397）μm2vs（1381 621±168 670）μm2，n=5，P=0.24〕。HE染色結(jié)果顯示（圖3D～3F），正常對(duì)照組子代小鼠腺導(dǎo)管具有清晰的雙層細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖3D），Ag-NP染毒組子代小鼠乳腺細(xì)胞層數(shù)變多，導(dǎo)管發(fā)生增生（圖3E）；Ag-NP染毒組子代小鼠乳腺導(dǎo)管增生比例顯著高于正常對(duì)照組〔（54.6±2.8）%vs（35.1±8.6）%，n=5，P＜0.01〕（圖3F）。

Fig.2 Effect of Ag-NPs exposure during pregnancy on uterus diameter and uterus length，survival rate and body mass of offspring female adult mice.Mice at at the 12thday of pregnancy were given ig Ag-NPs suspension 5 mg·kg-1for 7 d，and female offspring mice were chosen for index detection.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

Fig.3 Effect of Ag-NPs exposure during pregnancy on lymph node area（A-C）and mammary ductal hyperplasia（D-F）of offspring female adult mice by magenta aluminum potassium sulfate staining and HE staining，respectively.See Fig.2 for the mouse treatment.Yellow arrow represents the lymph node，red arrow the proliferating duct，and black arrow the normal duct.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with normal control group.

2.3 孕期納米銀暴露對(duì)子代成年雌性小鼠乳腺管腔干細(xì)胞亞群的影響

流式分選結(jié)果顯示（圖4A～4F），與正常對(duì)照組相比，Ag-NP染毒組子代成年雌性小鼠的MRU和CFC百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，L/B比值無改變。Ag-NP染毒組子代成年雌性小鼠LP為（1.1±0.2）%，顯著低于正常對(duì)照組（2.7±0.7）%（P＜0.01）。

2.4 孕期納米銀暴露對(duì)子代成年雌性小鼠乳腺管腔干細(xì)胞亞群集落百分比和總集落數(shù)的影響

Fig.4 Effect of Ag-NPs exposure during pregnancy on composition of mammary lumina stem cells of offspring female adult mice by flow cytometry.See Fig.2 for the mouse treatment.MRU：mammary repopulation unit；L/B：luminal to basal；CFC：colong forming cell；LP：luminal progenitor.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

Fig.5 Effect of Ag-NPs exposure during pregnancy on luminal stem cell subcolony and total colony of offspring female adult mice by immunofluorescence（A，C）and Giemsa staining（B，D）.See Fig.2 for the mouse treatment.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

集落形成實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)和Giemsa染色結(jié)果顯示（圖5A～5D），Ag-NP染毒組的雙陽性集落（K8+K14+）比例為（78.2±2.2）%，顯著高于正常對(duì)照組（51.1±7.2）%（P＜0.01），而K8+單陽性比例為（9.7±1.6）%，與正常對(duì)照組（23.8±2.9）%相比明顯減少（P＜0.01）（圖5A，C），但總的集落數(shù)無差異（圖5B，D）。

2.5 孕期納米銀暴露對(duì)子代小鼠乳腺導(dǎo)管中Cox-2和Stat5蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示（圖6A～6D），與正常對(duì)照組相比，Ag-NP染毒組子代成年雌性小鼠乳腺導(dǎo)管Cox-2表達(dá)顯著升高〔（0.46±0.02）vs（0.41±0.04），n=5，P＜0.05〕，Stat5表達(dá)亦顯著升高〔（0.52±0.07）vs（0.65±0.04），n=5，P＜0.01〕。

Fig.6 Effect of Ag-NPs exposure during pregnancy on protein expressions of cyclooxygenase-2（Cox-2）and signal transducer and activator of transcription 5（Stat5）of offspring female adult mice by immunohistochemistry.See Fig.2 for the mouse treatment.C and D was the semiquantative result of A and B，respectively.±s，n=5. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，母鼠在P12～P18暴露于Ag-NP后，子代成年雌性小鼠子宮形態(tài)沒有發(fā)生變化。MORISHITA等［23］研究發(fā)現(xiàn)，Ag-NP10 mg·kg-1染毒對(duì)小鼠無明顯毒性；體質(zhì)量為（21.00±2.00）g的昆明小鼠，Ag-NP 25 mg·kg-1給藥7 d，無明顯毒副作用［24］。本研究亦發(fā)現(xiàn)，Ag-NP 5 mg·kg-1染毒，子代小鼠子宮的長(zhǎng)度和直徑無顯著改變，說明此劑量對(duì)子代小鼠的子宮無明顯毒性作用。HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子代小鼠乳腺增生導(dǎo)管的比例明顯增多；乳腺整體染色結(jié)果顯示，小鼠乳腺導(dǎo)管變細(xì)，導(dǎo)管走向紊亂。有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺導(dǎo)管密度、分支結(jié)構(gòu)、主導(dǎo)管寬度和病理學(xué)結(jié)構(gòu)的異常變化是乳腺病變發(fā)展過程中的重要危險(xiǎn)參考因素［26］。

本研究發(fā)現(xiàn)，孕期暴露Ag-NP后，子代成年雌性小鼠的乳腺管腔祖細(xì)胞頻率降低，說明孕期暴露Ag-NP后會(huì)影響子代成年小鼠管腔干細(xì)胞群。有研究報(bào)道，管腔干細(xì)胞的形成與Stat5表達(dá)有關(guān)［27-28］。在集落的形成實(shí)驗(yàn)中，本研究發(fā)現(xiàn)，Ag-NP染毒組集落總數(shù)雖未發(fā)生明顯變化，但它們不同集落的比例發(fā)生了改變。在這些集落中，K8+K14+雙陽性的比例明顯增多，K8+單陽性的比例明顯減少，而且K14+單陽性的比例無變化，說明Ag-NP可影響細(xì)胞的分化能力，可能會(huì)使不同的細(xì)胞群之間發(fā)生轉(zhuǎn)化。本研究中Cox-2和Stat5的表達(dá)在小鼠乳腺組織中均有不同程度升高，而子代小鼠淋巴結(jié)形態(tài)和其面積統(tǒng)計(jì)分析無顯著差異，表明無明顯炎癥反應(yīng)發(fā)生。既往研究發(fā)現(xiàn)，Cox-2過表達(dá)可增加乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖，增加癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞；人乳腺癌腫瘤組織原位免疫染色顯示，Cox-2與癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞標(biāo)志物共定位，支持Cox-2誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞［29］。而Stat5過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致小鼠上皮增生、導(dǎo)管增生和ER+/PR+腺癌發(fā)生，且腫瘤中含有少量的CD44+細(xì)胞，可能為腫瘤干細(xì)胞［30］。RADLER等［31］發(fā)現(xiàn)，Cox-2和Stat5均能通過PI3K/Akt促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)程。

綜上所述，Ag-NP可能通過激活Stat5信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)標(biāo)志物Cox-2表達(dá)增加，從而影響乳腺干細(xì)胞的功能，引起乳腺導(dǎo)管結(jié)構(gòu)改變，增加乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。