空間微生物發(fā)酵反應(yīng)器設(shè)計及工藝優(yōu)化研究

葉健文，逯耀鋒，黃悟哲，吳赴清，陳國強*

（1.清華大學(xué)生命科學(xué)院，北京100084；2.中國載人航天工程辦公室，北京100034）

1 引言

開展長周期、遠(yuǎn)距離、多乘員的載人深空探測和地外星球駐留是未來載人航天發(fā)展的必然方向。但由于空間飛行中以及星球表面均缺乏人類生存必需的物質(zhì)資源供給，因此需要探索如何利用生物技術(shù)改造生物體，使其可在空間環(huán)境下實現(xiàn)廢棄物轉(zhuǎn)化［1-2］、星球資源原位利用、必需物質(zhì)生產(chǎn)、星球環(huán)境地球化［3］等任務(wù)。

近年來，隨著合成生物學(xué)等技術(shù)的迅速發(fā)展，研究人員可將微生物作為細(xì)胞工廠，通過工程化手段對其進(jìn)行改造［4-5］，改造后的微生物可高效轉(zhuǎn)化利用多種物質(zhì)或可生產(chǎn)出具有不同性質(zhì)的生物材料［6-7］。因此，研究在空間環(huán)境下利用改造后的微生物進(jìn)行無滅菌開放的高密度培養(yǎng)，如工程改造的嗜鹽單胞菌TD在三段式補料開放發(fā)酵中干重超80 g/L［8］，從而轉(zhuǎn)化載人航天任務(wù)中不斷產(chǎn)生的生活廢棄物［9-10］，或利用地外星球的特有資源，實現(xiàn)材料等物質(zhì)資源的生物合成，例如在太空合成生物基可降解材料、生物質(zhì)能源等，已經(jīng)成為具有戰(zhàn)略意義的研究方向之一。但是，由于載人航天飛行任務(wù)的特殊性，受限于上行資源條件約束，開展此類研究的實驗裝置必須實現(xiàn)輕量化；考慮到飛行乘組操作要求，此類實驗設(shè)計還必須簡便、易操作；鑒于空間環(huán)境中可利用資源的匱乏，在工藝流程中必須考慮資源更加高效地循環(huán)利用。現(xiàn)階段，由于存在設(shè)備組裝裝載復(fù)雜、發(fā)酵生產(chǎn)工藝可操作難度大、資源循環(huán)利用困難等問題，限制了利用高速生長的微生物轉(zhuǎn)化月球上廢棄物為生物塑料的可行性嘗試。

綜上，本文設(shè)計一種輕量化、便捷組裝的發(fā)酵罐，并基于下一代工業(yè)生物技術(shù)平臺［11-12］提出利用該發(fā)酵罐實現(xiàn)無滅菌、可循環(huán)發(fā)酵的工藝設(shè)計。通過利用嗜鹽單胞菌在輕量化發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行無滅菌、可循環(huán)的發(fā)酵實驗，旨在解決現(xiàn)有發(fā)酵設(shè)施質(zhì)量大、操作復(fù)雜、資源利用率低的問題，從而生產(chǎn)可生物降解的聚羥基脂肪酸酯材料，為解決載人航天任務(wù)中可利用物質(zhì)資源匱乏問題提供新的研究思路。

2 發(fā)酵罐的優(yōu)化設(shè)計

嗜鹽單胞菌Halon onas bluephagenesis TD01［13］（以下簡稱TD）由于對生長環(huán)境具有較好的生長魯棒性以及對不同極端環(huán)境具有較強的抗逆性和耐受性，已被用于開發(fā)下一代工業(yè)生物技術(shù)底盤菌［14］。以TD為研究對象，可采用無滅菌的連續(xù)開放發(fā)酵工藝，從而降低對能源和水資源的消耗，實現(xiàn)多種聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate，PHA）、蛋白質(zhì)和5-氨基酮戊酸（5-Aminolevulinic Acid，ALA）等化學(xué)品的低成本生產(chǎn)［15-16］。

傳統(tǒng)的實驗室小試規(guī)模發(fā)酵罐主要由4部分組成：主控制器、發(fā)酵罐體、空氣壓縮機和冷水機（圖1），其中主控制器和發(fā)酵罐體是核心組成部分。主控制器負(fù)責(zé)發(fā)酵過程的溫度、pH、溶氧、攪拌槳轉(zhuǎn)速、補料等條件的反饋控制；空氣壓縮機和冷水機根據(jù)實際發(fā)酵需求進(jìn)行配套使用；發(fā)酵罐體主要給微生物生長提供穩(wěn)定均一的傳質(zhì)和傳熱條件。小試規(guī)模的發(fā)酵罐體一般由不銹鋼支架和玻璃罐體組成，易碎且質(zhì)量較大。傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝需要保證微生物無雜菌的生長環(huán)境，通常需要經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌后使用，操作過程較為復(fù)雜，且需要額外配備蒸汽滅菌鍋。受玻璃罐體易碎、不銹鋼罐體質(zhì)量大等不利因素制約，載人航天飛行任務(wù)中無法利用傳統(tǒng)發(fā)酵罐和發(fā)酵工藝進(jìn)行材料生產(chǎn)。

可以選擇塑料材料作為發(fā)酵罐體的制作材料，用于開展后續(xù)在軌實驗的地面驗證工作。在眾多塑料選材中，亞克力塑料以其耐腐蝕、高透明度、高強度和易加工等特性被應(yīng)用在很多領(lǐng)域，如水族館、觀光幕墻等。本文采用亞克力塑料制作發(fā)酵罐體、上下封頭攪拌系統(tǒng)以及各封頭接口和導(dǎo)管等配件。發(fā)酵罐的上封頭和罐體之間用定位銷加螺紋接口進(jìn)行固定，其他接口固定方式均采用螺紋結(jié)構(gòu)，以方便快速拆裝。初步設(shè)計的小試規(guī)模發(fā)酵罐體總體積為10 L，制造雛形如圖2所示。發(fā)酵罐控制器可以維持原有設(shè)計，包括補料、溫控、pH控制、進(jìn)氣系統(tǒng)等［17-18］，該設(shè)計相對傳統(tǒng)不銹鋼發(fā)酵罐或玻璃發(fā)酵罐減重60%以上，拆卸或組裝更簡易，且在后續(xù)優(yōu)化過程中可以針對工藝進(jìn)行功能模塊的調(diào)整，以減少主控制器的體積，降低組裝復(fù)雜性。

由于嗜鹽菌TD可以允許無滅菌開放發(fā)酵，因此發(fā)酵準(zhǔn)備前培養(yǎng)基一級發(fā)酵罐體不需要經(jīng)過復(fù)雜的高溫蒸汽滅菌操作。此外，發(fā)酵過程中沒有對接種時的無菌操作和空壓機供氣的過濾除菌有嚴(yán)格要求。

圖2 10 L塑料發(fā)酵罐Fig.2 10 L plastic bioreactor

3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

下一代工業(yè)生物技術(shù)是基于嗜鹽單胞菌開發(fā)的，以海水作為發(fā)酵用水的無滅菌開放工業(yè)發(fā)酵技術(shù)，集合了高效的基因改造技術(shù)和嗜鹽微生物的底盤優(yōu)勢。該工藝以在空間環(huán)境下利用微生物發(fā)酵合成生物基可降解材料，并以高效循環(huán)利用發(fā)酵用水為目的，擬通過開發(fā)并優(yōu)化工藝設(shè)計，以提高微生物發(fā)酵的可行性、操作便捷性以及微生物合成目標(biāo)產(chǎn)物的發(fā)酵產(chǎn)率。

基于嗜鹽菌TD及其衍生的基因工程改造菌株，目前已開發(fā)了較穩(wěn)定小試規(guī)模發(fā)酵工藝以及中試規(guī)模放大發(fā)酵的工藝，并利用葡萄糖或γ-丁內(nèi)酯作為碳源生產(chǎn)聚-3-羥基丁酸酯（P3HB）和聚-3-羥基丁酸-4-羥基丁酸酯（P3HB4HB）共聚物，其發(fā)酵總生物量均能達(dá)到80 g/L，且PHA質(zhì)量百分比基本實現(xiàn)60%～70%［8］，如表1所示。雖然目前該工藝已經(jīng)實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化的中試放大驗證，如經(jīng)濟(jì)性（成本計算）、穩(wěn)定性（批次穩(wěn)定性）和可放大規(guī)模（千噸或萬噸級）等相關(guān)驗證，但是發(fā)酵最終生物量和PHA產(chǎn)量仍有可突破空間。因此，在進(jìn)行塑料發(fā)酵罐設(shè)計的同時，對該發(fā)酵工藝進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化。

在細(xì)菌的高密度培養(yǎng)過程中，主要分為3個時間期，依次為適應(yīng)期、對數(shù)生長期和平臺期。一般而言，對數(shù)生長期是細(xì)菌進(jìn)入指數(shù)分裂的快速生長期，需要供應(yīng)相應(yīng)的溶氧及營養(yǎng)物，以適應(yīng)該時期細(xì)菌生長所需的物質(zhì)來源。在前期開發(fā)的三段式補料發(fā)酵工藝中（表2）［8］，補料I作為對數(shù)生長期主要的氮供應(yīng)來源，補料II和補料III開始限制氮源供應(yīng)，同時提供穩(wěn)定的碳源用以合成PHA，從而實現(xiàn)細(xì)菌生長和PHA積累的解偶聯(lián)。

表1 用于塑料發(fā)酵罐高密度發(fā)酵的菌種［8］Table 1 Strains for high cell density cultivation in p lastic bioreactor［8］

表2 嗜鹽菌三段式補料發(fā)酵培養(yǎng)組份［8］Table 2 Formula of three-phase feeding solution for Halomonas cultivation［8］

然而細(xì)菌的對數(shù)生長隨著菌體密度的增大是一個動態(tài)變化過程，尤其是在菌體密度相對較低的對數(shù)前期，其生長速度較快，接近指數(shù)生長趨勢，對氮源的消耗量較大；而在對數(shù)期中后期，因菌體密度增大，溶氧供應(yīng)受限及群體效應(yīng)影響，其生長速度開始逐漸減緩，其對氮源的利用逐漸減弱。因此，本文將補料I拆分成補料I和補料I'來分配不同的碳源和氮源比例，以適應(yīng)2種不同的生長需求，其中補料I中的氮源比重較多，補料I'中的氮源比重較小。同時，在這2段補料中引入玉米漿粉來部分替代尿素作為氮源，因為玉米漿粉中除了含有大量有機氮源利于生長外，還有較豐富的生長因子可以促進(jìn)細(xì)菌的生長。補料配方更改如表3所示。

表3 嗜鹽菌四段式補料發(fā)酵培養(yǎng)組份Table 3 Formula of four-phase feeding solution for Halomonas cultivation in this study

基于以上發(fā)酵補料的優(yōu)化設(shè)計，本文首先用TD40菌株在常規(guī)小試規(guī)模發(fā)酵罐中對以上四段式發(fā)酵補料策略進(jìn)行驗證分析。結(jié)果表明：四段補料發(fā)酵的干重對比三段式補料發(fā)酵工藝［19］在總生物量上提高了12%，達(dá)到91 g/L，而PHA含量超75%，聚合物中4HB的摩爾比例均超10%，各項參數(shù)及性能達(dá)到該材料的下游加工需求，具體如圖3所示。因此，本文的發(fā)酵工藝優(yōu)化策略得以驗證，并值得在塑料罐中進(jìn)行復(fù)制實驗驗證。

圖3 基于TD40菌株的四段補料發(fā)酵工藝在常規(guī)發(fā)酵罐的優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Fermentation study of TD40 strain based on four-phase feeding solution in traditional bioreactor

在完成發(fā)酵工藝優(yōu)化后，將四段補料的發(fā)酵工藝復(fù)制到新設(shè)計制造的塑料發(fā)酵罐中進(jìn)行實驗。塑料發(fā)酵罐中仍保持開放無滅菌的發(fā)酵方式，經(jīng)過48 h的發(fā)酵，總生物量達(dá)到86 g/L，PHA含量達(dá)到71%，4HB比例也能達(dá)到10%的摩爾比標(biāo)準(zhǔn)，如圖4所示。新設(shè)計的塑料發(fā)酵罐不僅可以實現(xiàn)同等效果的嗜鹽菌TD發(fā)酵，而且經(jīng)過批次的發(fā)酵實驗發(fā)現(xiàn)該發(fā)酵罐并未出現(xiàn)變形、開裂等力學(xué)性能退變。所以，以塑料作為發(fā)酵罐的制造材料可以達(dá)到預(yù)期的輕量化、組裝簡易等設(shè)計要求。

圖4 基于TD40菌株的四段補料發(fā)酵工藝在塑料發(fā)酵罐中的發(fā)酵結(jié)果Fig.4 Ferm entation study of TD40 strain based on four-phase feeding solution in p lastic bioreactor

基于TD40菌株驗證了四段補料發(fā)酵工藝以及塑料發(fā)酵罐的設(shè)計后，針對不同的嗜鹽菌工程改造菌株進(jìn)行橫向驗證實驗。分別針對P3HB的高產(chǎn)菌TDU［20］和P3HB4HB的高產(chǎn)菌TDH4［21］在塑料發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵實驗，結(jié)果如圖5所示。在52 h的發(fā)酵實驗中，TDH4菌株的發(fā)酵總生物量高達(dá)100 g/L，PHA含量達(dá)到86%，4HB摩爾比例達(dá)到8.5%。而TDU菌株的發(fā)酵總生物量也高達(dá)83.5 g/L，PHA含量達(dá)到79.3%。實驗證明四段式發(fā)酵工藝和塑料發(fā)酵罐對不同的工程改造菌均有較好的適用性。

圖5 其他工程菌對于四段發(fā)酵工藝的發(fā)酵結(jié)果Fig.5 Fermentation study of other engineered Halomonas based on four-phase feeding solution

根據(jù)Ling等［22］的研究，乙酸的添加有利于PHA在嗜鹽菌TD中的積累，本文在此基礎(chǔ)上在補料中添加乙酸鈉對發(fā)酵工藝進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化?；谝宜徕c添加（添加6 g/L乙酸鈉）優(yōu)化策略及配方見表3。優(yōu)化后的工藝在塑料發(fā)酵罐測試中，經(jīng)過52 h的發(fā)酵，TDH4菌株的發(fā)酵總生物量高達(dá)107.8 g/L，PHA含量達(dá)到74.4%，4HB摩爾比例達(dá)到8.3%；而TDU菌株的發(fā)酵總生物量也高達(dá)102.6 g/L，PHA含量達(dá)到69.3%。這是目前嗜鹽菌TD在小試規(guī)模發(fā)酵罐中能達(dá)到的最高發(fā)酵水平［8］。因此，乙酸鈉對于細(xì)菌的發(fā)酵生長起到正向的作用。

圖6 乙酸鈉添加對于四段發(fā)酵工藝的優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Sodium acetate addition for fermentation optim ization based on four-phase feeding solution

4 廢水發(fā)酵優(yōu)化循環(huán)測試

開展了發(fā)酵廢水循環(huán)利用的測試，擬將一次發(fā)酵后的發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，將分離后的發(fā)酵液上清經(jīng)簡單熱處理后重新返回到發(fā)酵罐中進(jìn)行二次循環(huán)發(fā)酵，以實現(xiàn)發(fā)酵液最大限度的重復(fù)利用，具體流程如圖7所示。在發(fā)酵廢水循環(huán)測試中，仍選用已經(jīng)實現(xiàn)工業(yè)化中試生產(chǎn)的TD40菌株進(jìn)行驗證分析，發(fā)酵工藝是基于優(yōu)化后的四段補料發(fā)酵工藝。

圖7 基于塑料發(fā)酵罐的發(fā)酵液循環(huán)利用流程Fig.7 Fermented supernatant recycling design based on plastic bioreactor system

首先將首次發(fā)酵后的發(fā)酵液上清進(jìn)行收集，經(jīng)熱處理后返回到塑料發(fā)酵罐中，補充固定的發(fā)酵底料和菌種種子液后進(jìn)行一次循環(huán)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果如圖8所示。經(jīng)48 h發(fā)酵后，發(fā)酵總生物量達(dá)到83 g/L，PHA含量達(dá)到68%，4HB摩爾比例達(dá)到9.7%。

圖8 以TD40菌種為基礎(chǔ)基于塑料罐優(yōu)化工藝的一次發(fā)酵Fig.8 First round fermentation study of TD 40 strain by using optim ized plastic bioreactor technique

經(jīng)同樣的發(fā)酵液分離回收流程，針對發(fā)酵液上清繼續(xù)進(jìn)行二次循環(huán)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果如圖9所示。經(jīng)48 h發(fā)酵后，其發(fā)酵總生物量降低至76 g/L，PHA含量降低到48%，4HB摩爾比例3.6%，雖然發(fā)酵結(jié)果整體出現(xiàn)較明顯的降低，但仍能維持相對較高的PHA產(chǎn)量。另外，發(fā)酵前期的4HB摩爾比例波動的原因可能在于發(fā)酵液上清重復(fù)使用，積累了較多前批次未消耗完的γ-丁內(nèi)酯，導(dǎo)致前期4HB摩爾比波動較大，同時也可能對細(xì)菌生長帶來一定的抑制作用。因此，未來可僅利用葡萄糖生產(chǎn)P3HB或者P34HB的工程菌株，細(xì)菌的發(fā)酵液上清中就消除了γ-丁內(nèi)酯殘留的影響，減少循環(huán)中對菌株生長的抑制，從而增加廢液循環(huán)次數(shù)。

圖9 以TD40菌種為基礎(chǔ)基于圖7發(fā)酵廢水循環(huán)利用的二次發(fā)酵Fig.9 Second round fermentation study of TD 40 strain by using fermented supernatant recycling

5 結(jié)論

1）輕型發(fā)酵罐相較于傳統(tǒng)發(fā)酵罐減重60%以上，拆卸或組裝更簡易，試驗證明其在嗜鹽菌開放無滅菌發(fā)酵工藝的適用性，在批次重復(fù)的耐久性測試和穩(wěn)定性上均無退化現(xiàn)象；

2）四段式補料的發(fā)酵工藝對嗜鹽菌發(fā)酵生產(chǎn)PHA具有促進(jìn)作用，添加乙酸鈉能提高嗜鹽菌發(fā)酵的總生物量，從而獲得更高的PHA產(chǎn)量；

3）發(fā)酵廢水經(jīng)2次循環(huán)利用后仍能夠維持較高的PHA產(chǎn)量，證明優(yōu)化后的工藝可實現(xiàn)發(fā)酵用水的循環(huán)利用。

綜上，基于下一代工業(yè)生物技術(shù)平臺的輕型發(fā)酵罐設(shè)備已完成部分地面驗證，獲取的數(shù)據(jù)滿足實驗設(shè)計要求，為后續(xù)進(jìn)一步開展空間飛行驗證奠定了基礎(chǔ)，其實驗結(jié)果可為未來載人深空探測、建立月球基地乃至實現(xiàn)地外星球長期駐留的物資循環(huán)利用提供新的思路。

致謝：本研究得到了迪必爾生物工程（上海）有限公司的支持，謹(jǐn)致謝意。