油酸或α-亞麻酸對葡萄酒酵母發(fā)酵活力和香氣的影響

劉沛通 段長青 燕國梁*

（1 葡萄與葡萄酒研究中心 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083 2 農(nóng)業(yè)部葡萄酒加工重點實驗室 北京100083）

不飽和脂肪酸是釀酒酵母生長代謝的必需營養(yǎng)物質(zhì)， 對酵母繁殖及葡萄酒發(fā)酵香氣物質(zhì)的產(chǎn)生具有重要影響[1-2]。 葡萄汁是釀酒酵母利用不飽和脂肪酸的主要來源，其中油酸、亞油酸和α-亞麻酸是葡萄汁中的主要不飽和脂肪酸， 其濃度和種類變化直接影響酵母的生長及發(fā)酵性能[3-6]。 葡萄汁中的不飽和脂肪酸被酵母迅速吸收整合入細胞膜中，改善酵母細胞膜的流動性和完整性，提高酵母的抗逆性， 促進酵母與環(huán)境基質(zhì)中的物質(zhì)交換，影響酵母生長繁殖[7-9]。細胞膜功能的改善影響膜轉(zhuǎn)運基因的表達， 添加不飽和脂肪酸可上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運基因，增加胞內(nèi)氨基酸的積累；氨基酸是高級醇類化合物的重要前體物質(zhì)， 其含量的變化直接影響高級醇及其乙酸酯類物質(zhì)的生成[6]。 同時，部分不飽和脂肪酸進入酵母細胞內(nèi)部，通過調(diào)節(jié)香氣前體物質(zhì)以及相關(guān)基因表達來影響香氣化合物（包括中鏈脂肪酸及其乙酯）的生成[3，10-11]。 高級醇、 酸類和酯類物質(zhì)濃度的變化共同影響葡萄酒的感官品質(zhì)。

近年來， 大量研究關(guān)注葡萄汁中不飽和脂肪酸的濃度及種類的變化對葡萄酒發(fā)酵及香氣的作用。 Pinu 等[12]報道增加亞油酸的濃度抑制了硫化物的產(chǎn)生。 Casu 等[2]研究表明添加亞油酸促進高級醇的合成，降低乙酸酯類物質(zhì)的含量，影響葡萄酒的風(fēng)味和口感。 復(fù)合添加油酸、亞油酸和α-亞麻酸也會促進酵母生長代謝， 提高葡萄酒中高級醇和乙酯類物質(zhì)的含量， 調(diào)控葡萄酒香氣品質(zhì)[1]。目前的研究主要集中在復(fù)合脂類或亞油酸含量變化對酵母發(fā)酵的影響，而油酸和α-亞麻酸濃度變化對酵母發(fā)酵性能及香氣物質(zhì)濃度的影響仍需探明。 葡萄汁中油酸和α-亞麻酸的含量分別占不飽和脂肪酸總量的10%和13%左右， 僅次于葡萄汁中的亞油酸含量[1]。 油酸和α-亞麻酸的濃度受栽培處理和釀造工藝的影響顯著， 如葡萄果實的曝光處理可使油酸和α-亞麻酸含量由微量分別增加至117 mg/L 和132 mg/L[1]，而浸漬工藝可將葡萄汁中的油酸和α-亞麻酸濃度分別增加1 至2倍[13]。從實際生產(chǎn)的角度，研究油酸和α-亞麻酸的濃度變化對酵母生長代謝和葡萄酒香氣的影響是很有必要的。 本試驗以“赤霞珠”葡萄汁為發(fā)酵基質(zhì)，參考文獻[6]，分別添加3 個濃度的油酸或α-亞麻酸，比較不同濃度下油酸或α-亞麻酸對酵母生長、主要代謝產(chǎn)物以及香氣物質(zhì)生成的影響，旨在進一步提高葡萄酒的感官品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器、設(shè)備

葡萄汁：使用2014年采收于河北昌黎的“赤霞珠”（Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon）葡萄果實，除梗、破碎后出汁，其還原糖239 g/L，可滴定酸（以酒石酸計）5.9 g/L，pH 3.3，油酸0.13 mg/L，亞麻酸0.12 mg/L。

菌株： 商業(yè)釀酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae var. bayanus）EC1118， 法國Lallemand公司。

試驗儀器：Agilent 1200 series HPLC 系統(tǒng)，美國Agilent 公司；Agilent 7890N/5975B MS 型 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；離子交換色譜柱HPX-87H Aminex ion-exchange column（300 mm×7.8 mm）， 美國Bio-Rad Laboratories；毛細管色譜柱HP-INNOWAX 60 m × 0.25 mm ×0.25 μm，美國J & W Scientific 公司；示差折光檢測器 （RID，refractive index detector，G1362A），美國Agilent 公司； 二極管陣列檢測器（DAD，photodiode array detector，G1315D），美國Agilent 公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS fiber 萃取柱， 美國Supelco 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵條件 發(fā)酵前分別向葡萄汁中添加3個質(zhì)量濃度（12，60，120 mg/L）的油酸或α-亞麻酸， 編號分別為OA-12，OA-60，OA-120，ALA-12，ALA-60，ALA-120。 在500 mL 錐形瓶中發(fā)酵，每瓶裝入350 mL 葡萄汁，商業(yè)酵母活化后接入葡萄汁中，液封發(fā)酵栓，密封瓶口，25 ℃下靜置發(fā)酵。所有處理設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

發(fā)酵早期每12 h 測定1 次酵母細胞生長情況（OD600nm）和還原糖濃度，進入穩(wěn)定期后每24 h測定1 次， 監(jiān)測酵母的生長發(fā)酵情況。 發(fā)酵結(jié)束后，低溫（4 ℃）離心（8 000 r/min，10 min）后棄菌體，上清液于-20 ℃下凍藏，用于代謝產(chǎn)物的測定。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的測定 葡萄糖、果糖、甘油、乙醇和有機酸（乙酸、蘋果酸、檸檬酸和乳酸）的測定參考Liu 等[14]的方法。5 mmol/L H2SO4溶液為流動相，以流速0.6 mL/min 等度洗脫。葡萄糖、果糖、甘油和乙醇的測定用示差折光檢測器， 柱溫45 ℃，進樣量20 μL。 有機酸的測定使用二極管陣列檢測器， 檢測波長214 nm， 柱溫60 ℃， 進樣量10 μL。

揮發(fā)性香氣物質(zhì)的檢測參考Lan 等[15]的方法，使用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）進行。將5 mL 樣品加入15 mL 樣品瓶中，加入1 g NaCl、10 μL 內(nèi)標(biāo)（4-甲基-2-戊醇）后迅速用帶有隔墊的瓶蓋擰緊密封， 使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS fiber 在40 °C 恒溫條件下180 r/min 萃 取30 min 后， 用Agilent 7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。 使用HP-INNOWAX 60 m × 0.25 mm × 0.25 μm 毛細管色譜柱，柱溫50 ℃保持1 min，之后以3°C/min 的速率升至220 ℃保持5 min。 載氣為高純氦氣 （純度99.999%），流速1.0 mL/min。 電子轟擊電離源（EI）方式，離子源能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍30～350 m/z。 所有檢測均做3 次技術(shù)重復(fù)。

使用質(zhì)譜全離子掃描（Scan）圖譜，根據(jù)本實驗室建立的相同檢測條件下各化合物的保留時間、保留指數(shù)和質(zhì)譜信息進行定性分析。使用各化合物在模擬酒溶液（2 g/L 葡萄糖、12%酒精度和7 g/L 酒石酸的水溶液）中的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

1.2.3 統(tǒng)計分析和作圖 使用SPSS 20.0 單因素方差分析（ANOVA）對處理間各代謝產(chǎn)物含量差異顯著性進行分析， 采用Duncan 檢驗兩兩比較，顯著性水平P＜0.05。 圖形采用Origin 9.0 繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 油酸或α-亞麻酸對酵母生長和發(fā)酵速率的影響

如圖1 所示，從對數(shù)中期開始，添加不飽和脂肪酸（油酸或α-亞麻酸）顯著提高酵母的細胞量，其中12 mg/L 油酸（OA-12）和α-亞麻酸添加組（ALA-12）中酵母的最大OD 值分別為7.69 和7.83，均顯著高于對照組（7.09）。 同時，油酸或α-亞麻酸可顯著促進葡萄汁中還原糖的消耗， 提高酵母的發(fā)酵速率，12 mg/L α-亞麻酸添加組（ALA-12）的還原糖消耗速率最大（1.80 g/L/h），顯著高于對照組（1.68 g/L/h）。

2.2 油酸或α-亞麻酸對發(fā)酵主產(chǎn)物的影響

酒精發(fā)酵結(jié)束后，酒中殘?zhí)橇?、甘油、乙醇和乙酸、蘋果酸、檸檬酸和乳酸的含量如表1 所示。與對照組相比，添加油酸或α-亞麻酸后，殘?zhí)菨舛入S不飽和脂肪酸濃度的增加呈先降低后增加的趨勢，其中添加12 mg/L α-亞麻酸（ALA-12）顯著降低葡萄酒中的殘?zhí)菨舛取?添加不飽和脂肪酸可以促進糖的消耗，然而不飽和脂肪酸濃度過高時，其對酵母生長代謝的促進作用減弱（圖1），導(dǎo)致酵母的糖利用率降低，殘?zhí)菨舛仍黾印Ｆ咸丫浦械囊掖己侩S油酸和α-亞麻酸濃度的增加而升高。與對照相比，添加油酸和α-亞麻酸各組葡萄酒中的甘油含量有所增加， 增強葡萄酒的圓潤感[16]。所有處理葡萄酒中的乙酸含量均在0.2～0.7 g/L 范圍， 含量適中的乙酸可為葡萄酒帶來愉悅的香氣[11]。 與對照相比，添加油酸和α-亞麻酸組葡萄酒中蘋果酸的含量有所降低， 檸檬酸和乳酸含量并無顯著差異。

圖1 不同濃度油酸（a）或α-亞麻酸（b）對酵母生長和還原糖消耗的影響Fig.1 Effects of different concentrations of oleic acid （a）or α-linolenic acid （b）on yeast growth and sugar consumption

表1 添加不同質(zhì)量濃度油酸或α-亞麻酸對酒精發(fā)酵結(jié)束葡萄酒成分的影響Table 1 Effects of adding different concentrations of oleic acid or α-linolenic acid on the profile of final wines

2.3 油酸或α-亞麻酸對葡萄酒香氣的影響

酒精發(fā)酵結(jié)束后，從葡萄酒中共檢測到21 種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，包括7 種醇類、4 種乙酸酯類、5種乙酯類、4 種酸類物質(zhì)以及1 種含硫化合物。 其中，異丁醇、異戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯等14 種物質(zhì)在酒中含量超過其感覺閾值， 其香氣值（Odour Active Value，OAV）大于1（表2）。

油酸和α-亞麻酸的濃度變化對香氣化合物影響顯著。異丁醇、異戊醇和苯乙醇是本研究中檢測出的主要高級醇，添加油酸或α-亞麻酸可提高葡萄酒中高級醇的含量（表2）。 葡萄酒中乙酸乙酯、 乙酸異戊酯和乙酸己酯等乙酸酯類物質(zhì)的含量在添加油酸或α-亞麻酸后也有提高， 其中12 mg/L 的α-亞麻酸（ALA-12）顯著促進這3 種物質(zhì)的合成， 其含量與對照相比分別提高了52.27%，27.16%和31.33%，最終導(dǎo)致乙酸酯類物質(zhì)與對照相比增產(chǎn)49.27%，為葡萄酒帶來果香、花香等愉悅香氣（表2）。 添加油酸或α-亞麻酸促進了酸類物質(zhì)（包括己酸、辛酸、癸酸和異戊酸）的產(chǎn)生，其中12 mg/L α-亞麻酸添加組（ALA-12）葡萄酒中辛酸含量最高，比對照提高31.51%；60 mg/L 油酸（OA-60）添加組葡萄酒中異戊酸含量較對照提高53.01%（表2）。 與酸類物質(zhì)變化相似，添加油酸或α-亞麻酸促進葡萄酒中乙酯類物質(zhì)的生成， 其中12 mg/L α-亞麻酸添加組（ALA-12）中乙酯類物質(zhì)總量較對照提高32.41%（表2）。 3-甲硫基丙醇是檢測出的唯一含硫化合物， 其含量過高時會給葡萄酒帶來脂肪味。 添加油酸顯著增加了葡萄酒中該物質(zhì)含量，然而α-亞麻酸添加組與對照酒樣相比并無顯著性差異（表2）。

以上結(jié)果表明，增加葡萄汁中油酸或α-亞麻酸濃度可顯著改變葡萄酒中香氣物質(zhì)的含量，主要表現(xiàn)為促進葡萄酒中高級醇、 酸類和酯類物質(zhì)的生成，影響葡萄酒的香氣特征。

2.4 油酸或α-亞麻酸發(fā)酵葡萄酒的香氣輪廓

添加不同濃度油酸和α-亞麻酸對葡萄酒香氣特征的影響直接改變葡萄酒的香氣輪廓。 將葡萄酒中OAV 大于1 的14 種物質(zhì)進行香氣系列歸類，參考文獻[17]，根據(jù)各物質(zhì)的香氣特征分為5大類，分別為花香、果香、焦糖味、溶劑味和脂肪味（圖2）。 果香和花香特征在所有葡萄酒中都比較突出，其次為溶劑味、焦糖味和脂肪味。整體來看，與添加油酸相比，添加α-亞麻酸更有利于提升葡萄酒的果香和花香特征， 特別是添加12 mg/L 的α-亞麻酸（ALA-12），可顯著改善葡萄酒的香氣特性。

3 討論

油酸和α-亞麻酸可通過調(diào)節(jié)酵母的生長代謝來影響葡萄酒的香氣。厭氧發(fā)酵時，不飽和脂肪酸為酵母生長提供必需營養(yǎng)物質(zhì)， 葡萄汁中其含量的提高可顯著促進酵母的生長繁殖和發(fā)酵速度[1]。 本研究中，添加油酸或α-亞麻酸可顯著提高酵母的細胞量， 促進葡萄汁中還原糖的消耗（圖1）。 值得注意的是， 添加12 mg/L 的α-亞麻酸（ALA-12）具有較顯著的促進作用（圖1）。 釀酒酵母自身不能合成α-亞麻酸，厭氧發(fā)酵條件下適當(dāng)濃度的α-亞麻酸不僅可以保持酵母細胞膜的完整性，增強酵母的抗逆能力，也可以參與酵母生長代謝，有利于酵母的生長發(fā)酵[6-7，9]。

圖2 添加不同濃度油酸或α-亞麻酸對葡萄酒香氣活性值的影響Fig.2 Effects of adding different concentrations of oleic acid or α-linolenic acid on OAVs of final wines

葡萄汁中的不飽和脂肪酸部分被酵母吸收，參與香氣化合物的代謝。 高級醇是葡萄酒重要的香氣物質(zhì)，主要由釀酒酵母通過Ehrlich 途徑降解氨基酸生成[22]。 本研究中添加油酸或α-亞麻酸促進了高級醇的生成（表2）。 研究表明，不飽和脂肪酸濃度的升高可上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運酶基因GAP1 的表達水平，促進氨基酸向酵母細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，增加高級醇前體物質(zhì)氨基酸的濃度， 從而提高葡萄酒中高級醇的含量[1，23]。OA-12、OA-120 和ALA-120的高級醇含量高于400 mg/L， 給葡萄酒帶來強烈的刺鼻味[11]。 綜上，控制葡萄汁中不飽和脂肪酸的種類， 保持適當(dāng)?shù)牟伙柡椭舅釢舛纫彩呛苡斜匾摹?/p>

短、中鏈脂肪酸（己酸、辛酸和癸酸）在低濃度時可產(chǎn)生清新的香氣， 當(dāng)其含量超過20 mg/L 時會產(chǎn)生不愉悅的酸腐味[24]。 與對照相比，添加油酸或α-亞麻酸顯著提高了葡萄酒中短、中鏈脂肪酸的濃度（表2），且各組酸類物質(zhì)總量未超過不良濃度范圍，不僅提高了葡萄酒的香氣品質(zhì)，也對葡萄酒的香氣復(fù)雜性有重要貢獻[8，24-25]。

酯類物質(zhì)包括乙酸酯類和乙酯類， 可為葡萄酒提供宜人的果香和花香， 對葡萄酒香氣品質(zhì)有積極貢獻[11]。 添加油酸或α-亞麻酸可提高葡萄酒中乙酸酯類物質(zhì)的含量， 其中以12 mg/L α-亞麻酸（ALA-12）的促進作用最為顯著，為葡萄酒帶來果香、花香等愉悅香氣。 隨著α-亞麻酸濃度的增加，其對乙酸酯類物質(zhì)的促進作用逐漸降低。研究表明， 高濃度的不飽和脂肪酸會抑制乙酸酯合成路徑中的關(guān)鍵基因——乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（ATF1）的表達，降低該酶的活性，從而減少乙酸酯類物質(zhì)的生成[26]。 葡萄汁中不飽和脂肪酸的濃度對葡萄酒中高級醇的產(chǎn)生有重要影響。 乙酯類物質(zhì)是另一類重要的酯類物質(zhì)， 其產(chǎn)生主要受底物中鏈脂酰輔酶A 的影響[27]。與酸類物質(zhì)變化相似，油酸或α-亞麻酸促進葡萄酒中乙酯類物質(zhì)的生成 （表2）。Saerens 等[28]報道，添加不飽和脂肪酸可以抑制乙酰輔酶A 羧化酶AAC1 的活性， 進而釋放該酶的底物——?；o酶A， 導(dǎo)致中鏈脂酰輔酶A 累積，促進中鏈脂肪酸乙酯的合成。 然而，不飽和脂肪酸含量過高時會抑制乙酯類物質(zhì)的生成[29]。 與本研究結(jié)果相對應(yīng)， 乙酯類物質(zhì)的濃度隨油酸和α-亞麻酸含量的升高而降低。添加適量油酸或α-亞麻酸可促進乙酯類物質(zhì)的合成。

發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒香氣輪廓分析表明， 添加12 mg/L α-亞麻酸后， 與對照組和其它處理組相比，葡萄酒的花香和果香特征顯著增強，這主要是由于具有花香、果香的苯乙醇、癸酸乙酯、乙酸乙酯、 己酸乙酯、 乙酸異戊酯含量較高引起的（表2）。 12 mg/L α-亞麻酸的（ALA-12）能夠顯著促進葡萄酒中醇、酯、酸類物質(zhì)的合成，增強葡萄酒花香、果香特征，提高葡萄酒的感官品質(zhì)。

4 結(jié)論

提高葡萄汁中油酸或α-亞麻酸的濃度，可以促進酵母的生長繁殖，提高發(fā)酵能力，增加葡萄酒的甘油含量，并促進葡萄酒中高級醇、酸類和酯類物質(zhì)的生成。 該作用因不飽和脂肪酸種類和濃度不同而變化，其中添加適量（12 mg/L）α-亞麻酸可以顯著增加葡萄酒中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯和癸酸乙酯等酯類物質(zhì)的含量， 產(chǎn)生含量適中的高級醇（＜400 mg/L），最終更加突出葡萄酒中花香和果香的香氣特征，改善葡萄酒的香氣品質(zhì)，提高葡萄酒感官質(zhì)量。