基于AHLs介導的革蘭氏陰性菌群體感應調控及淬滅機制研究進展

崔天琦 白鳳翎 勵建榮

（渤海大學食品科學與工程學院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧錦州 121013）

群體感應（quorum sensing，QS）是細菌以細胞密度依賴性方式協(xié)調基因表達和生理行為的系統(tǒng)[1]。它由自體誘導物（autoinducers，AI）介導，被動地與周圍環(huán)境中的細菌細胞進行有效信息交換[2]，信號分子的積累與細菌數(shù)量成正比。 當信號分子濃度達到閾值時， 同源受體結合信號分子并觸發(fā)信號轉導，導致其在生物膜形成、生物發(fā)光、質粒接合轉移以及毒力因子等QS 表型表達[3]。 目前，在已鑒定的細菌多種信號分子中， 革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的N-酰基高絲氨酸內酯類 （N-acylated homoserine lactones，AHLs）信號分子介導的QS 現(xiàn)象在海洋生態(tài)環(huán)境的細菌中最為常見。 群體感應淬滅（quorum quenching，QQ）是指通過抑制AHLs合成，降解AHLs 以及阻斷AHLs-LuxR 相互作用3 種方式干擾和破壞自身誘導的QS， 進而抑制介導細菌行為的基因表達。 由于細菌可通過感知信號分子濃度的波動監(jiān)測細胞密度的變化確定是否激活某些與QS 啟動和調控相關的基因， 因此AHLs 類信號分子在革蘭氏陰性菌QS 調控和QQ中起著關鍵作用。

本文綜述AHLs 類信號分子在革蘭氏陰性菌的QS 調控和QQ 過程中作用機制的研究進展，為研究革蘭氏陰性菌群體感應的調控和淬滅機制提供參考。

1 革蘭氏陰性菌QS 系統(tǒng)及調控機制

絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌QS 系統(tǒng)主要由AHLs、AHLs 合酶（LuxI 蛋白）和AHLs 受體（LuxR族蛋白）3 類成分組成[4-5]。如圖1 所示，在AHLs 調控的細菌QS 系統(tǒng)中，AHLs 由細胞內的AHLs 合成酶基因（如luxI）以低細胞密度合成并分布在細胞中。 當AHLs 和細胞濃度很低時，AHLs 無法結合AHLs 受體， 不能引起AHLs 合成酶基因轉錄，QS 表型無法表達。 隨著AHLs 在環(huán)境中逐步累積[6]，當達到高細胞密度時，AHLs 以細胞密度依賴性方式生長。 當AHLs 隨細胞密度達到濃度閾值時，AHLs 結合其受體并激活轉錄因子（LuxR），活化的AHLs-LuxR 蛋白復合物通常與QS 的DNA（基因的啟動子區(qū)）鄰近同源二聚化并結合，激活由QS 系統(tǒng)控制的靶基因的轉錄，觸發(fā)QS 系統(tǒng)調控的基因表達[1]。

圖1 革蘭氏陰性細菌AHLs 介導QS 調控基因表達示意圖Fig.1 Schematic representation of QS-regulated genes in AHLs of gram-negative bacteria

1.1 革蘭氏陰性菌AHLs

1.1.1 AHLs 結構 AHLs 是一類中性脂質小分子，不同種類的細菌合成的AHLs 結構不同，其最基本的結構是由具有酰基鏈的高絲氨酸內酯環(huán)（homoserine lactone，HSL）組成（圖2）[7]。 不同來源的AHLs 側鏈的大小、取代基及飽和度不同，?；鶄孺湹拈L度通常在C4到C18之間。 大多數(shù)含有偶數(shù)個碳原子，以兩個碳單位（C4，C6，C8等）逐增，碳3 位置處可以結合不同的取代基， 如-H、-OH、=O或-OXO 等， 常見革蘭氏陰性菌AHLs 包括：C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、3-oxo-C8-HSL，3-oxo-C12-HSL 和3-OH-C10-HSL 等。不同細菌AHLs 的種類不同， ?；鶄孺湹娘柡投纫泊嬖诓町怺8]。 AHLs 中HSL 是親水基團，而其側鏈具有疏水性， 因此可在水環(huán)境中保持穩(wěn)定的兩親性分子狀態(tài)。

圖2 革蘭氏陰性菌AHLs 的化學結構式Fig.2 Chemical structure of Gram-negative bacteria AHLs

1.1.2 革蘭氏陰性菌AHLs 的合成 目前已經(jīng)確定100 多種變形桿菌能夠產(chǎn)生AHLs。在海洋生態(tài)環(huán)境中棲息的嗜水氣單胞菌 （Aeromonas hydrophila），殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida），魯氏耶爾森氏菌（Yersinia ruckeri），鰻弧菌（Vibrio anguillarum），哈維氏弧菌（V. harveyi），創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus），遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）和海洋屈撓桿菌（Tenacibaculum maritimum）均分泌形成AHLs。在革蘭氏陰性菌體內，主要由LuxI、LuxM 和HdtS 蛋白家族3 類合酶在細胞內合成其AHLs[9]。

圖3 革蘭氏陰性菌AHLs 合成反應示意圖Fig.3 Schematic representation of the synthesis reaction of Gram-negative bacteria AHLs

1）LuxI 酶 首先在費氏弧菌 （Vibrio fischeri）的lux 操縱子中發(fā)現(xiàn)LuxI 酶， 大多數(shù)已知AHLs 合酶是LuxI 蛋白家族的成員[10]。 對于LuxI酶和TraI 酶的體外研究發(fā)現(xiàn)， 初級?；湽w是酰基-ACP（Acyl-acyl carrier protein，acyl-ACP），其內酯環(huán)來源于腺苷酰-L-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine，SAM）側鏈，LuxI 合酶可利用此兩種底物合成AHLs。 AHLs 合成反應機理主要包括?；蛢弱セ瘍刹襟E（圖3）[11]：先是SAM 與LuxI 酶結合，SAM 的胺基對?；驶迹╝cyl-ACP）進行親核式攻擊形成丁?；?SAM （Butyryl-SAM）；然后與acyl-ACP 結合引發(fā)N-?；∟-acylation）反應后使SAM 內酯化。 同時，在形成5’-甲硫腺苷（5’-methylthioadenosine，5’-MTA）之前釋放全部的ACP。

2）LuxM 酶只有幾種γ變形桿菌具有LuxM 家族酶[7]。 在哈維氏弧菌中，luxM 被鑒定為其形成LuxM 酶的一個基因，是形成特定AHLs 必需的酶。 在費氏弧菌等相關弧菌中，AinS 酶和VanM 酶產(chǎn)生AHLs[12]，它們均具有與luxM 相似的基因序列。 除了利用酰基輔酶A （acyl-coenzyme A，acyl-CoA）之外，AinS 酶和VanM 酶對AHLs 合成的底物的要求也與LuxI 家族合酶類似。

3）HdtS 酶 HdtS 酶最初在熒光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens）F113 中被鑒定出來，它產(chǎn) 生C6-HSL、N-（3-OH-7-cis-tetradecenoyl）-HSL 和C10-HSL 類信號分子。 HdtS 屬于溶血磷脂酸-?；D移酶家族成員[13]， 可利用acyl-ACP 和acyl-CoA 兩者作為底物?；纬扇苎字醄14]，而HdtS 催化AHLs 合成的酶促反應機制還沒有明確。此外，AHLs 生產(chǎn)所需HdtS 酶的特征還不確定，而在細菌體中不存在產(chǎn)生AHLs 的同系物。 該類細菌酶家族似乎具有兩個功能，即：溶血磷脂酸的?；虯HLs 的合成。

1.2 革蘭氏陰性菌QS 調控機制

最早發(fā)現(xiàn)QS 系統(tǒng)調控機制的革蘭氏陰性菌是海洋中產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象的費氏弧菌。 當調控生物發(fā)光基因的密度達到閾值時， 會誘導費氏弧菌發(fā)光基因的表達而產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象[15]。 費氏弧菌的QS調控蛋白包括LuxI 和LuxR， 其中LuxI 為自誘導物合酶，LuxR 蛋白為細胞內自誘導物感受因子。同時，LuxR 也是DNA 結合轉錄激活元件。 編碼自誘導物合成酶的luxI 基因位于luxICDABE 操縱子的片段上，調控3-oxo-C6-HSL 信號分子的合成[16]。當LuxR 與3-oxo-C6-HSL 結合后被激活，LuxR 編碼一個轉錄子與上游luxICDABE 操縱子結合刺激熒光激酶系統(tǒng)必要組分的轉錄，合成蛋白LuxI[17]?，F(xiàn)已證實絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌QS 系統(tǒng)均與費氏弧菌的LuxI/R 型QS 的雙組分系統(tǒng)類似，因此，費氏弧菌的LuxI/R 雙組分系統(tǒng)已被視為革蘭氏陰性菌QS 的模式系統(tǒng)。

近年來，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）QS 系統(tǒng)的調控機制也逐漸被人們所認識[18]。該系統(tǒng)是由多層次群體感應鏈控制， 現(xiàn)已確定兩組LuxI/R 同系物信號系統(tǒng)分別為LasI/LasR 和RhlI/RhlR[19]。LasI 和RhlI 是自誘導分子合成酶，它們分別產(chǎn)生3-oxo-C12-HSL 和C4-HSL 兩類AHLs信號分子[20]，而LasR 和RhlR 為轉錄激活劑。 這兩個群體感應系統(tǒng)在銅綠假單胞菌毒力因子的高效表達、堿性蛋白酶、彈性蛋白酶、綠膿菌素等的產(chǎn)生中發(fā)揮聯(lián)合作用[21]。 目前，銅綠假單胞菌QS 系統(tǒng)多層次群體感應鏈中的第3 組自誘導物還需進一步鑒定[22]。

除費氏弧菌和銅綠假單胞菌之外， 其它革蘭氏陰性菌產(chǎn)生AHLs 或具有LuxR/I 同系物的分布情況見表1。 兩種常見病原體嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）和殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）的調節(jié)蛋白分別為AhyI/R 和AsaI/R[23]。 AhyI 和AsaI主要合成C4-HSL 和C6-HSL 信號分子。 鰻弧菌（V. anguillarum）中表達LuxI/R 的同系物VanI/R，VanI 催化3-oxo-C12-HSL 信號分子的合成[21]。

綜上， 革蘭氏陰性菌的群體感應調控機制十分復雜。不同革蘭氏陰性菌，群體感應調控機制具有一定的差異， 同一革蘭氏陰性菌也可能存在多個QS 調控體系。

表1 常見革蘭氏陰性菌QS 調節(jié)系統(tǒng)Table 1 QS Regulation system of common gram-negative bacteria

2 基于AHLs 革蘭氏陰性菌QS 的淬滅作用

AHLs 類信號分子對革蘭氏陰性菌QS 系統(tǒng)的調控具有十分重要的作用， 通過干擾或破壞AHLs 的合成可以達到淬滅革蘭氏陰性菌QS 系統(tǒng)的目標[31]。 研究表明AHLs 合成酶（I）、AHLs 信號及AHLs 受體蛋白（R）構成了LuxI/R 型QS 系統(tǒng)中3 個明顯靶點，若QS 系統(tǒng)的其中一個靶點受到外部干預或破壞， 都可能破壞菌體的分子信息傳導，使QS 調節(jié)的目標基因不能表達（圖4）。 而在銅綠假單胞菌等一些細菌中QS 系統(tǒng)淬滅作用機制更為復雜。革蘭氏陰性菌QS 的淬滅作用是通過干擾和破壞AHLs 介導的QS 系統(tǒng)，使受試細菌表型基因不能表達， 進而實現(xiàn)抑制革蘭氏陰性菌QS 的目標。

2.1 抑制AHLs 合成

LuxI 酶利用acyl-ACP 和SAM 催化AHLs 合成[32]。 SAM 是AHLs 合成的必要和獨特的中間體，抑制AHLs 合成的研究主要集中在SAM 的各種類似物的使用上。 此外，還發(fā)現(xiàn)嘌呤核苷酸、高絲氨酸內酯衍生物和某些大環(huán)內酯類抗生素的同系物和類似物可抑制AHLs 合成[33]。

2.2 降解AHLs 分子

圖4 革蘭氏陰性菌的QQFig.4 QQ of Gram-negative bacteria

AHLs 信號分子的降解會破壞細菌的正常通訊途徑。 目前為止已知有3 種降解方式， 包括化學、代謝和酶降解。 化學降解主要是指堿性pH 值導致內酯環(huán)打開，并導致AHLs 信號的活性喪失。然而，內酯環(huán)可以重新環(huán)化，并且AHLs 信號的活性在酸性pH 值下可以逆轉。 對一些細菌如假單胞菌菌株PAI-A 和爭論貪噬菌等進行代謝AHLs信號生長能力的研究。 AHLs 信號包括AHLs 內酯酶、AHL 酰基轉移酶和氧化還原酶在內的QQ 酶完全降解或失活。

2.3 LuxR 型蛋白

目前，有關QS 抑制作用的研究大多數(shù)集中在阻斷AHLs-LuxR 的相互作用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)能夠競爭或干擾天然AHLs 信號和LuxR 型受體結合的拮抗劑[34]。 研究證明從自然界篩選具有拮抗作用的AHLs 類似物，可阻礙AHLs 與LuxR 的受體結合[35]，也可通過化學手段修飾AHLs 的?；鶄孺溞纬葾HLs 類抑制劑，主要是針對AHLs 高絲氨酸內酯環(huán)上的幾個取代基進行修飾，形成能夠結合LuxR的化合物。

3 AHLs 分子的酶解機制

對AHLs 的降解不僅是QQ 的重要目標，也是緩解細菌形成生物膜的有害作用，降低QS 毒力因子以及開發(fā)QSI 的有效策略。 目前， 降解或淬滅AHLs 分子共有AHLs 內酯酶（AHLs-lactonases）、AHLs ?；D移酶（AHLs-acylases）和氧化還原酶（oxidoreductases）3 類酶（圖5）[36]。表2 至表4 列出具有降解或淬滅QS 作用的微生物、動物組織和土壤宏基因組中QQ 酶的類型及信號分子種類，其中大多數(shù)QQ 酶在相應的細菌和真菌細胞中得到表征。

AHLs 內酯酶以水解和可逆兩種方式切割HSL 的酯鍵形成同源的?；呓z氨酸（AHS）衍生物[37]。 目前，已鑒定大多數(shù)AHLs 內酯酶都來源于細菌，如芽孢桿菌屬240B1，酸門桿菌屬[38]。

AHLs ?；D移酶以不可逆的方式破壞高絲氨酸內酯和酰基鏈之間的酰胺鍵， 并釋放游離的高絲氨酸內酯和相應的脂肪酸[39]。 降解產(chǎn)物失去信號分子傳導活性，從而達到淬滅QS 的作用。 目前，已從銅綠假單胞菌和魚腥藻屬PCC7120[40]等細菌中獲得廣譜性AHLs-?；D移酶。

氧化-還原酶以氧化或還原兩種方式催化?；鶄孺?，使AHLs 信號的結構被修飾而不被降解。AHLs 分子結構的變化影響本身的特異性和識別性功能，從而導致細菌QS 表型的紊亂[41]。 迄今為止， 僅有紅串紅球菌W2 和巨大芽胞桿菌等少數(shù)細菌產(chǎn)生氧化-還原酶[33]。

3.1 AHLs 內酯酶

目前， 在多種生物體的不同蛋白質家族中發(fā)現(xiàn)對AHLs 信號分子具有降解活性的內酯酶，酶解AHLs 分子內酯鍵后轉化形成相應的N-酰基高絲氨酸， 酶促降解類似于pH 值依賴性內酯溶解，它可在酸性介質中逆轉（圖5a）。 第1 個被鑒定的AiiA 酶是來源于芽孢桿菌屬菌株240B1 由aiiA 基因編碼的AHLs 內酯酶[12]。 在紅串紅球菌W2 中鑒定了不同種類的AHLs 內酯酶，從種皮微桿菌StLB037 和蒼白桿菌屬T63 中分離的AIIM和AidH，也被鑒定為AHLs 內酯酶[42]。來自海洋假交替單胞菌1A01261 產(chǎn)生的AHLs 內酯酶QsdH被鑒定，該酶是一種具有預測位于周質延伸的N-末端催化GDSL 水解酶結構域和C-末端RND 型外排泵結構域作用的內膜蛋白[51]。 從根瘤菌屬NGR234 分離得到的胞外內酯酶DlhR 具有保守的GSD（L）序列和二烯內酯水解酶結構域，具有幾種其它的QQ 酶， 其中至少一種屬于金屬內酰胺酶家族的AHLs 內酯酶（QsdR1）[53]。 目前，已確定的大多數(shù)細菌來源AHLs 內酯酶，如表2 所示。

AiiA 型內酯酶在條件致病菌銅綠假單胞菌中的表達阻止了由QS 控制的生理生化行為，包括降低了3-O-C12-HSL 含量， 阻止了C4-HSL 積累，減少了細胞外毒力因子產(chǎn)生以及群集運動性[47]。AiiA 內酯酶在伯克氏菌中的表達降低了AHLs 濃度并改變群集和泳動運動[52]，aiiA 基因重組到植物中能夠預防由胡蘿卜軟腐歐文氏菌引起的軟腐病。 在銅綠假單胞菌PAO1 中表達的幾種其它類型QQ 酶影響泳動性和生物膜形成[51-53]。 在植物病原體果膠桿菌中幾種AHLs 內酯酶基因的異源表達降低了本身AHLs 水平， 降低了細胞外果膠分解酶的水平并減弱該病原體在馬鈴薯或其它植物中的致病作用[58]。

這些結果表明，通過水解AHL 內酯酶的方法淬滅AHLs 信號，是干擾細菌感染的可行策略。

3.2 AHLs ?；D移酶

在芽孢桿菌屬240B1 中發(fā)現(xiàn)AiiA 內酯酶后不久， 又發(fā)現(xiàn)菌株爭論貪噬菌VAI-C 可以AHLs作為能源和氮源誘導形成一種AHLs 酰基轉移酶， 該酶不可逆地水解AHLs 酰胺鍵后形成HSL和相應的脂肪酸（圖5b）。爭論貪噬菌VAI-C 可以降解不同長度酰基側鏈（從C4到C12）的各種飽和AHLs 和3-oxo-C8-HSL。 脂肪酸可作為碳源和能源支持VAI-C 的生長，而HSL 只作為氮源。 后續(xù)研究在銅綠假單胞菌、青枯菌[61]、叢毛單胞菌屬[67]、丁香假單胞菌[65]、希瓦氏菌屬[60]、蒼白桿菌屬[64]、紅串紅球菌W2[39]和鏈霉菌M664[62]（表3）等細菌中也鑒定了AHLs ?；D移酶[70]。布魯氏菌是一種能夠產(chǎn)生長鏈AHLs 的導致人畜共患病的病原體，在體外或巨噬細胞感染期間可以產(chǎn)生具有控制內在AHLs 自誘導劑的AHLs 酰基轉移酶（AibP），降解AHLs 后影響其致病作用[63]。在銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)和表征了另一種AHLs ?；D移酶PvdQ，它與AiiD ?；D移酶具有很高的同源性，只降解長鏈AHLs。

表2 降解或淬滅QS 的AHLs 內酯酶Table 2 AHLs-lactones that degrade or quench QS

大多數(shù)AHLs ?；D移酶表現(xiàn)出對長鏈AHLs 降解的偏好。 然而，來自魚腥藻屬PCC7120的AiiC 酶可水解不同長度的AHLs[30]。表型分析顯示PvdQ 在體外可作為一種QQ 劑， 添加PvdQ 到銅綠假單胞菌PAO1 培養(yǎng)物中可抑制3-oxo-C12-HSL 的積累、喹諾酮信號（Pseudomonas quinolone signal，PQS）合成以及彈性蛋白酶和綠膿菌素等毒力因子的表達。 AHLs ?；傅腝Q 活性在各種QS 系統(tǒng)中得到證實， 這些酶可以用于控制AHLs介導的革蘭氏陰性菌的致病作用。

與AHLs 內酯酶相比，AHLs ?；D移酶更易于應用生物技術實現(xiàn)QQ 作用， 因為與內酰胺酶產(chǎn)物N-?；呓z氨酸相反，?；D移酶的反應產(chǎn)物不能自發(fā)再生為功能性QS 信號，且?；D移酶產(chǎn)生的脂肪酸通常易于分解。

3.3 AHLs 氧化-還原酶

氧化-還原酶通過氧化或還原AHLs 的方式中斷細菌QS 系統(tǒng)，而不是水解作用（圖5c）。 最近僅在伯克霍爾德氏菌屬GG4、巨大芽胞桿菌等細菌中發(fā)現(xiàn)了幾種氧化還原酶（表4），來自巨大芽胞桿菌的細胞色素P450 單加氧酶CYP102A1 具有氧化N-脂肪?；被岷椭舅岬幕钚裕邗；?1，ω-2 和ω-3 碳上羥基化催化AHLs 及其內酯分解為N-酰基高絲氨酸類產(chǎn)物。

表3 降解或淬滅QS 的AHLs 酰基轉移酶Table 3 AHLs-acylases that degrade or quench QS

表4 降解或淬滅QS 的氧化-還原酶Table 4 Oxidoreductases that degrade or quench QS

除了形成內酯酶QsdA 和AHLs ?；D移酶之外，紅串紅球菌W2 也具有氧化還原酶，可催化3-O-C（8-14）-HSL 使其還原為相應的3-OH-HSL，導致信號分子失活[32]。 從姜根系分離的伯克霍爾德氏菌GG4 也能夠還原3-oxo-AHLs[31]。從土壤宏基因組文庫中鑒定的另一種新型的氧化-還原酶BpiB09 可以催化3-oxo-C12-HSL 還原成3-OHC12-HSL， 該酶在銅綠假單胞菌中的表達影響QS調節(jié)基因的轉錄，減少綠膿菌素的產(chǎn)生，降低了菌體泳動性和生物膜形成[73]。

通過利用鹵過氧化物酶氧化， 如次溴酸和次氯酸等鹵素化合物形成活性氧分子， 用于殺滅病原微生物。 有學者提出一些海洋巨藻可以通過利用鹵過氧化物酶系統(tǒng)來控制其表面上的生物膜形成， 表明由該類酶產(chǎn)生的鹵素抗微生物劑引起的信號失活可促成天然細菌群落中的生物膜得到控制。

4 小結

細菌群體感應是當前微生物領域研究的熱點之一，AHLs 信號分子是革蘭氏陰性菌信息交流的物質基礎。 通過干擾、破壞和降解AHLs 類分子是阻斷群體感應的主要方式。 本文對革蘭氏陰性菌群體感應具有淬滅作用的酶研究進行綜述。 從近年的研究來看， 一是降解AHLs 分子酶的來源廣泛，包括細菌、真菌和動植物組織；二是酶的種類繁多，不同來源的酶種類不同，大致分為AHLs 內酯酶、AHLs ?；D移酶和氧化還原酶； 三是酶的降解對象和作用機制具有很大差異性。

基于AHLs 的QS 和QQ 的外源性調控作用，對控制QS 所形成的生物膜、毒力因子、生物發(fā)光等現(xiàn)象具有主導作用。 利用外源性AHLs 降解酶的QQ 作用，是控制QS 的一種具有潛在前途的防控策略。相對于添加抗生素等傳統(tǒng)控制手段，生物源性QQ 作用具有生態(tài)環(huán)境友好，綠色、安全、高效等特點。隨著研究的深入，必將為控制致病微生物和腐敗菌的產(chǎn)生具有劃時代的意義。