缺氧預處理的脂肪間充質(zhì)干細胞對小鼠硬皮病模型的治療作用

吳 曉，李宇飛，金佳慧，沈亮亮，Bhavana Rajbanshi，趙敬軍

(1.同濟大學醫(yī)學院，上海 200092；2.同濟大學附屬同濟醫(yī)院皮膚科，上海 200065)

硬皮病是一種以皮膚和內(nèi)臟器官纖維化為主要改變的慢性自身免疫性疾病，其進展的過程主要為小血管受損，導致免疫細胞浸潤，進而發(fā)展為結(jié)締組織功能異常，大量膠原沉積于病變區(qū)[1]。目前硬皮病的發(fā)病機制有多種學說[2]，如1993年Murrell首次提出硬皮病可能與組織內(nèi)氧化應激水平改變有關，后續(xù)大量研究也支持這一猜想[3]。脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose tissue-derived stromal cells, ADSCs)在硬皮病小鼠模型中被證明能夠逆轉(zhuǎn)硬皮病的進展,其機制研究主要集中在對皮損區(qū)的免疫調(diào)節(jié)以及旁分泌抗纖維化的細胞因子[4-5]，而對于調(diào)節(jié)氧化應激水平研究較少。在有關干細胞移植的治療研究中，有實驗結(jié)果證實干細胞經(jīng)缺氧預處理后能夠增加其對疾病的治療效果[6]。故本文對ADSCs和缺氧預處理的ADSCs(hypoxia-pretreated ADSCs, hpADSCs)治療硬皮病小鼠的皮膚纖維化的逆轉(zhuǎn)效果和對氧化應激水平的影響進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 動物和材料

SPF級4～6周齡雌性C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養(yǎng)于同濟大學滬北實驗動物中心；博來霉素(bleomycin, BLM)購自美國Sigma公司；Western印跡法相關試劑購自碧云天生物技術公司；兔抗鼠TGF-β多克隆抗體、兔抗鼠α-SMA多克隆抗體購自美國Abcam公司；H-E染色試劑盒、Masson染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；羥脯氨酸試劑盒、H2O2試劑盒購自南京建成生物工程研究所；膠原酶Ⅰ、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、100U/mL青鏈霉素均購自美國Thermo Fisher公司；CD34、CD44、CD73、CD90、CD105流式抗體均購自美國BD公司。

1.2 硬皮病小鼠模型的構(gòu)建

將實驗小鼠按隨機表法分為4組，分別為空白對照組、BLM模型組、ADSCs治療組、hpADSCs治療組，每組6只。處理前剃除小鼠背部毛發(fā)，空白對照組每只小鼠注射100μL PBS，其余3組每只小鼠皮下注射100μL博來霉素PBS溶液(1mg/mL)，每日1次，連續(xù)28d。

1.3 ADSCs的分離鑒定培養(yǎng)

將小鼠斷頸處死，在無菌條件下取雙側(cè)腹股溝脂肪組織并置于0.1%的 Ⅰ 型膠原酶溶液中。在37℃，120r/min搖床消化1h后離心(離心半徑18cm，1000r/min，5min)，棄上清液，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基并接種于培養(yǎng)皿中，48h后更換培養(yǎng)基。待貼壁細胞生長至70%～80%融合度時進行傳代培養(yǎng)。取第3代ADSCs在顯微鏡下拍照，流式細胞術鑒定細胞表面標志物CD34、CD44、CD73、CD90、CD105。

1.4 預缺氧處理ADSCs和ADSCs/hpADSCs移植實驗

取第4代ADSCs，一半置于37℃含1%O2、5%CO2、94%N2的細胞培養(yǎng)箱中進行缺氧預處理2d，同時另一半細胞置于37℃含5%CO2、21%O2、74%N2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)2d后消化重懸2種細胞，并調(diào)整細胞密度均為2×107個/mL。ADSCs治療組及hpADSCs治療組小鼠每只分別注射100μL ADSCs或hpADSCs懸液?？瞻讓φ战M和BLM模型組同時注射等體積的PBS溶液。

1.5 皮損區(qū)羥脯氨酸和H2O2檢測

取小鼠部分皮損組織，依據(jù)試劑盒說明書的要求，對皮損區(qū)羥脯氨酸、H2O2含量進行檢測。

1.6 Western印跡法

取小鼠皮損組織并加入RIPA裂解液，使用組織研磨儀研磨使其充分裂解后提取蛋白液。使用BCA法測定蛋白液中的總蛋白濃度。加入適當體積的5×蛋白上樣緩沖液后在金屬干浴儀中加熱100℃ 10min。每孔上樣20μg總蛋白，通過SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜和封閉后，加入適當體積的TGF-β(1∶1000)和α-SMA(1∶500)抗體過夜。孵育結(jié)束后加入相應的二抗(1∶5000)室溫下反應1h，隨后進行ECL化學發(fā)光反應。

1.7 H-E、Masson及免疫組化染色

小鼠皮膚組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，進行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片。切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，TBST(含0.1% Tween20的Tris-HCl緩沖鹽溶液)沖洗3次。用于H-E、Masson染色的切片根據(jù)試劑盒說明書的要求進行染色。用于進行免疫組化染色的切片放入微波爐進行熱修復，自然冷卻至室溫后用3% H2O2孵育10min，5%山羊血清封閉10min，用TBST沖洗3次后分別滴加兔抗鼠TGF-β單克隆抗體(1∶50)、兔抗鼠α-SMA單克隆抗體(1∶100)，4℃過夜。次日TBST沖洗3遍后，分別加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔二抗(1∶500)在室溫下孵育2h。TBST沖洗3次后用二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs的形態(tài)觀察與鑒定

ADSCs接種2d后開始明顯的貼壁生長，第3代ADSCs細胞呈梭形或成纖維細胞狀，細胞核清晰可見，見圖1A。缺氧培養(yǎng)2d后，hpADSCs形態(tài)無明顯改變，見圖1B。流式鑒定ADSCs特征性表面分子：CD34(-)、CD44(+)、CD73(+)、CD90(+)、CD105(+)，見圖2。

圖1 ADSCs、hpADSCs形態(tài)學特征(×40)

圖2 ADSCs表面分子表達情況

2.2 BLM誘導的小鼠硬皮病模型的病理改變及ADSCs/hpADSCs治療后變化

如圖3所示，H-E染色可見空白對照組真皮層膠原纖維分布結(jié)構(gòu)正常，脂肪層明顯。而BLM模型組真皮層膠原明顯增多，脂肪層消失，并伴有明顯的炎性細胞浸潤。ADSCs移植治療后真皮層厚度無明顯變化，但相對BLM模型組排列疏松，脂肪層明顯增厚。hpADSCs治療組的真皮層膠原增生情況明顯改善，脂肪層明顯增厚。Masson染色可見空白對照組皮膚結(jié)構(gòu)正常，膠原排列有序。BLM模型組真皮明顯增厚，膠原增生聚集且排列紊亂，見 圖4。經(jīng)ADSCs和hpADSCs治療后，真皮變薄，膠原減少，與空白對照組類似。圖5表明未處理的ADSCs治療雖然在一定程度上降低了真皮厚度，但是與BLM模型組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。hpADSCs能夠更好地降低皮損部位的膠原厚度，與BLM模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖3 皮損區(qū)樣本H-E染色(×100)

圖4 皮損區(qū)樣本Masson染色(×100)

圖5 各組樣本皮損區(qū)真皮厚度

2.3 ADSCs/hpADSCs對硬皮病的膠原合成水平的影響

羥脯氨酸是膠原的主要成分之一且為膠原特有的氨基酸，其他蛋白中幾乎不含有羥脯氨酸，故可以通過羥脯氨酸的量來間接評估膠原的含量。經(jīng)BLM處理后皮膚組織內(nèi)的羥脯氨酸表達水平明顯變高，經(jīng)ADSCs/hpADSCs治療后皮損部位的羥脯氨酸水平均明顯下調(diào)，與BLM模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。hpADSCs治療后樣本的羥脯氨酸水平略低于ADSCs治療組，但是差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖6。

圖6 ADSCs及hpADSCs治療對皮損部位膠原的影響

2.4 ADSCs/hpADSCs對皮損部位氧化應激水平的影響

組織內(nèi)H2O2濃度能夠反映組織內(nèi)的氧化應激水平。檢測了4組樣本中的H2O2水平，發(fā)現(xiàn)BLM能夠明顯上調(diào)組織內(nèi)的H2O2水平(圖7)，這與本團隊之前發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象一致[7]。在干細胞治療后皮膚內(nèi)的H2O2減少，這提示了干細胞移植治療能夠下調(diào)硬皮病內(nèi)氧化應激水平，并且與ADSCs相比，hpADSCs的抗氧化應激能力相對更佳。

圖7 ADSCs及hpADSCs治療對皮損部位H2O2水平的影響

2.5 hpADSCs對皮損部位TGF-β和α-SMA表達的影響

首先通過Western印跡法驗證組織內(nèi)TGF-β和α-SMA的水平。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過ADSCs/hpADSCs治療后皮膚內(nèi)TGF-β的水平均有一定的下降。α-SMA僅在hpADSCs組有一定的下調(diào)，見圖8。為了進一步觀察α-SMA和TGF-β在組織內(nèi)的分布和表達情況，對小鼠石蠟切片進行了免疫組化染色。α-SMA表達于胞質(zhì)中，陽性細胞散在分布于真皮層。BLM處理的小鼠真皮層α-SMA陽性細胞數(shù)明顯增多。經(jīng)ADSCs治療后的小鼠真皮內(nèi)α-SMA陽性細胞數(shù)變化不大，而hpADSCs組的α-SMA陽性細胞數(shù)明顯減少，見圖9。與空白對照組相比，BLM處理后的小鼠真皮層內(nèi)TGF-β大量表達，且毛囊處的TGF-β增高顯著。ADSCs治療后真皮層中毛囊組織中TGF-β輕度下調(diào)，但是整體變化不大。hpADSCs治療后顯著降低皮膚中的TGF-β的水平，見圖10。

圖8 Western印跡法分析TGF-β和α-SMA在小鼠皮膚中的表達情況

圖9 皮損組織樣本中α-SMA的表達情況(×100)

圖10 皮損組織樣本中TGF-β的表達情況(×100)

3 討 論

硬皮病是一種以血管病變，免疫異常激活及膠原異常沉積為特點的自身免疫性疾病。血管內(nèi)皮損傷在硬皮病的進展中是最早發(fā)生的[8]。血管內(nèi)皮具有復雜的生物學功能，如組織血小板和白細胞的黏附，控制血管收縮擴張，抑制細胞外基質(zhì)的沉積以及控制炎癥反應。內(nèi)皮損傷后會導致局部生理狀態(tài)異常，其中異常之一就是活性氧的產(chǎn)生[3]?；钚匝躅?reactive oxygen species, ROS)包括超氧陰離子(O2·)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(OH·)、一氧化氮(·NO)、過氧亞硝基(ONOO-)和次氯酸(HOCl)。硬皮病患者體內(nèi)ROS的水平與正常人群相比有一定程度的升高。ROS誘導硬皮病的機制主要包括誘導促炎和促纖維化的細胞因子如血小板源性生長因子、TGF-β表達，刺激成纖維細胞的增殖和激活，以及膠原合成，最終導致皮損區(qū)膠原異常沉積[9-10]。并且動物實驗也驗證了ROS能夠誘導出與硬皮病類似的皮損特點[11]。因此，ROS在硬皮病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

BLM誘導的皮膚纖維化模型被廣泛用于硬皮病動物實驗研究。本研究中，小鼠經(jīng)BLM皮下注射4周后檢測發(fā)現(xiàn)注射區(qū)的膠原、H2O2、α-SMA、TGF-β明顯升高，與硬皮病患者的皮膚特點一致，證明BLM誘導的小鼠硬皮病模型可以較好地模擬硬皮病患者的皮膚特點，并且可用于硬皮病氧化應激相關的研究。

目前硬皮病尚無安全有效的治療方案。近來動物實驗研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞(mesenchyma stem cells, MSCs)移植能夠降低硬皮病的膠原沉積，延緩硬皮病的進展[12]。ADSCs是MSCs的一種，同樣具有干細胞的生物學特性。目前研究發(fā)現(xiàn)ADSCs對硬皮病的治療機制主要包括抑制成纖維細胞膠原分泌，抑制皮損區(qū)免疫反應及增加血管內(nèi)皮生長因子水平[13-16]。動物實驗表明ADSCs能夠降低心、肝、肺、腎等多種器官的纖維化水平，降低局部炎癥水平，抑制膠原沉積[4]。氧化應激是硬皮病發(fā)病的重要機制之一，本研究中證實了ADSCs對硬皮病小鼠皮膚組織氧化應激水平的影響，發(fā)現(xiàn)注射了ADSCs后皮膚內(nèi)H2O2水平明顯下降，提示ADSCs能夠通過降低氧化應激水平，在其他研究中同樣報道了包括ADSCs在內(nèi)的干細胞能夠降低組織的氧化應激水平[17-18]。經(jīng)ADSCs治療后真皮層略變薄，皮下脂肪層變厚，膠原水平降低，有效地下調(diào)小鼠皮膚局部膠原水平，逆轉(zhuǎn)皮膚病變。

據(jù)文獻報道，在硬皮病患者中TGF-β和α-SMA均顯著上調(diào)[19-20]，TGF-β能夠誘導成纖維細胞激活并促進其膠原合成[21-23]。α-SMA是肌成纖維細胞表達的蛋白，是成纖維細胞激活的標志。本實驗中發(fā)現(xiàn)了BLM模型組中α-SMA陽性細胞數(shù)明顯高于空白對照組，提示博來霉素誘導的硬皮病可能能夠通過TGF-β介導成纖維細胞激活，促進膠原合成。ADSCs和hpADSCs移植治療能夠有效的下調(diào)BLM誘導的硬皮病皮損中的α-SMA、TGF-β的表達，提示這兩種干細胞確實能夠通過干預成纖維細胞的功能來逆轉(zhuǎn)皮膚纖維化。

本研究發(fā)現(xiàn)ADSCs缺氧預處理后可以增強其對硬皮病的治療作用，但其具體機制目前尚不明確。任何細胞的生理特性都與細胞類型、成熟度和環(huán)境有關。根據(jù)文獻報道，在高灌注的器官內(nèi)如肝、心、腎等，氧濃度約4%～14%，而在脂肪這一類缺氧組織中氧濃度甚至不到3%，提示了ADSCs在自然狀態(tài)下是處于相對缺氧狀態(tài)，而在細胞體外培養(yǎng)中ADSCs是處在富氧狀態(tài)(約21%)，這會對ADSCs的干細胞特性造成一定的影響。在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)ADSCs可能增強其擴增、黏附和細胞因子的合成分泌能力，這可能是hpADSCs治療效果更好的原因[24]。有研究分析了缺氧預處理后ADSCs細胞內(nèi)的基因表達的改變，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的基因主要功能富集在基質(zhì)降解、下調(diào)細胞蛋白代謝途徑以及調(diào)節(jié)蛋白水解，下調(diào)基因主要功能富集在炎癥誘導和免疫趨化功能[25]。該文獻數(shù)據(jù)顯示IL-6在缺氧預處理后表達升高5倍。有文獻報道IL-6能夠誘導STAT3的激活，進而活化核因子E2相關因子2并促進其依賴的抗氧化應激因子的表達，下調(diào)ROS及超氧化物的水平[26]。這可能是hpADSCs具有更好治療效果的機制之一。Xu等[27]通過篩查缺氧前后的ADSC外分泌細胞因子的含量變化發(fā)現(xiàn)，IL-10在缺氧處理后的ADSCs上清中含量明顯升高，而IL-10能夠通過恢復細胞抗氧化酶的活性來降低細胞氧化應激水平[28]?？傊?，缺氧誘導后的ADSCs能夠改變ADSCs的基因表達譜，提升ADSCs移植后的抗氧化應激能力。相比對其他的基因編輯方法來提升ADSCs的功能，缺氧預處理ADSCs相對更加容易，對臨床ADSCs移植治療硬皮病等相關疾病有一定的指導意義。