王雪寧 朱新迎 成群
摘要:對(duì)泡菜老壇水中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定,獲得3株乳酸菌,確定為短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。以條斑紫菜(Porphyra yezoensis)為原料,以4種不同配比的上述乳酸菌對(duì)條斑紫菜進(jìn)行直投式發(fā)酵,探討發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液部分理化因子的變化規(guī)律。結(jié)果顯示,4種發(fā)酵液的pH下降趨勢(shì)相似,從開(kāi)始的4.51下降到2.90;1∶1∶2(體積比)混合乳酸菌發(fā)酵液的產(chǎn)酸能力最強(qiáng),發(fā)酵終點(diǎn)總酸含量為13.75 g/L,為發(fā)酵開(kāi)始的6倍;1∶1∶2混合乳酸菌發(fā)酵液的總糖含量由開(kāi)始的29.95 g/L下降為發(fā)酵終點(diǎn)的18.97 g/L;1∶1∶2混合乳酸菌發(fā)酵液亞硝酸鹽含量的峰值最小,為3.75 mg/kg;1∶1∶1混合乳酸菌發(fā)酵液氨基酸含量較高,最大值為58.16 μmol/mL;蛋白質(zhì)含量下降幅度最大的是1∶1∶3混合乳酸菌發(fā)酵液。
關(guān)鍵詞:乳酸菌;分離鑒定;條斑紫菜(Porphyra yezoensis);發(fā)酵;理化因子
中圖分類(lèi)號(hào):S188 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A
文章編號(hào):0439-8114(2020)10-0139-06
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.10.033 ? ? ? ? ? 開(kāi)放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識(shí)碼(OSID):
Abstract: Three strains of lactobacillus were isolated and identified from fermented liquid of pickle after isolation and identification. They were identified as Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus casei. Then these lactic acid bacteria were used to directly ferment Pyropia yezoensis with four different ratios, and some physical and chemical changes in the fermentation process was discussed. The results showed that all four kind of mixed lactobacillus fermentation broth had similar pH decline trends, from 4.51 to 2.90; 1∶1∶2 (V∶V∶V) mixed lactobacillus fermentation broth had the strongest acid production capacity, and at the end point of fermentation, the total acid content was 13.75 g/L, which was 6 times of the beginning; the total sugar content of 1∶1∶2 mixed lactobacillus fermentation broth was from the initial 29.95 g/L to 18.97 g/L at the fermentation end point; the minimum peak of nitrite content of 1∶1∶2 mixed lactobacillus fermentation broth was 3.75 mg/kg; the higher amino acid content occurred in 1∶1∶1 mixed lactobacillus fermentation broth, with the maximum value of 58.16 μmol/mL; the 1∶1∶3 mixed lactobacillus fermentation broth had the largest decrease of protein content.
Key words: lactobacillus; isolation and identification; Porphyra yezoensis; fermentation; physical and chemical factors
條斑紫菜(Porphyra yezoensis)屬紅藻綱紅毛草科,是最常見(jiàn)的一種食用海藻,富含蛋白質(zhì)及氨基酸,還含有鈣、鐵、磷等微量元素,具有特殊的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),既可食用也可藥用[1-3]。因?yàn)樽喜司哂泻芎玫臓I(yíng)養(yǎng)價(jià)值,所以常在食品加工業(yè)中作為一類(lèi)重要的原材料。紫菜產(chǎn)業(yè)是國(guó)內(nèi)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)之一,其中連云港市作為全國(guó)紫菜的兩大生產(chǎn)基地之一,產(chǎn)量占全國(guó)的60%以上,養(yǎng)殖業(yè)迅速擴(kuò)大,紫菜產(chǎn)量劇增,但紫菜的深加工產(chǎn)品比較單一,沒(méi)有達(dá)到很好的經(jīng)濟(jì)效益[4]。目前,對(duì)于紫菜的研究方向大多集中在紫菜醬及紫菜功能成分的提取等方面[5,6]。
乳酸菌指一類(lèi)具有兼性厭氧的、不產(chǎn)芽孢的,可利用糖類(lèi)化合物進(jìn)行反應(yīng),生成乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的總稱(chēng)。乳酸菌具有豐富的生物多樣性,被廣泛應(yīng)用在食品行業(yè)、醫(yī)藥保健行業(yè)等領(lǐng)域。泡菜是指隔絕空氣后在低濃度鹽水腌制條件下,其本身帶有微生物或人工添加乳酸菌作為發(fā)酵劑,發(fā)酵蔬菜產(chǎn)生大量乳酸的一類(lèi)傳統(tǒng)蔬菜發(fā)酵類(lèi)食品。發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的乳酸等風(fēng)味物質(zhì),除了改善食品的風(fēng)味、提高蔬菜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外,還可以抑制其他腐敗菌的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)[7]。乳酸菌還有助于改善人體腸道菌群,提高消化能力,減輕便秘,降低膽固醇[8]。
本研究從泡菜老壇水中分離乳酸菌, 利用16S rRNA分子生物學(xué)檢測(cè)的方法對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。以分離鑒定的乳酸菌形成不同配比,將其作為發(fā)酵劑,對(duì)紫菜進(jìn)行直投式發(fā)酵,探討不同配比乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)條斑紫菜混合發(fā)酵過(guò)程中理化因子的變化,以期為紫菜加工業(yè)提供理論依據(jù)并提高紫菜相關(guān)產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。
1 ?材料與方法
1.1 ?材料與試劑
泡菜老壇水、條斑紫菜:市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi);總氨基酸(A026-1-1)、總蛋白質(zhì)(A045-2)、亞硝酸鹽(A038)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所;其他化學(xué)試劑均為分析純。
改良乳酸菌培養(yǎng)基:酵母膏7.5 g,蛋白胨7.5 g,葡萄糖10 g,KH2PO4 ?2 g,番茄汁100 mL,吐溫80 0.5 mL,去離子水900 mL,調(diào)pH 7.0(固體培養(yǎng)基添加瓊脂10 g/L),121 ℃滅菌15 min。MRS培養(yǎng)基:葡萄糖20 g ,蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母膏5 g,檸檬酸三銨5 g,磷酸氫二鉀2 g,三水乙酸鈉5 g,吐溫80 1 mL(瓊脂15~17 g),去離子水1 000 mL。
兩種培養(yǎng)基調(diào)pH為 6.5,0.07 MPa(115 ℃)滅菌20 min備用。
1.2 ?儀器與設(shè)備
ReadMax 1900 Plus光吸收型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(上海閃譜科技有限公司);T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);SevenEasy實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)]。
1.3 ?方法
1.3.1 ?乳酸菌分離鑒定 ?取 100 μL老壇水和900 μL無(wú)菌水到1.5 mL離心管中振蕩混勻作為10-1稀釋液,以10倍稀釋法對(duì)其進(jìn)行梯度稀釋到10-6。吸取100 μL 10-4、10-5和10-6稀釋液涂布至滅菌的改良固體培養(yǎng)基上,每個(gè)梯度3個(gè)平板,在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h,然后挑取具有典型乳酸菌菌落特征的菌株進(jìn)行平板劃線(xiàn)分離純化。將分離純化后的單菌落接種到5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h。收集菌液送上海派森諾生物科技公司進(jìn)行菌種鑒定。
1.3.2 ?條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵 ?選取經(jīng)鑒定后的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)進(jìn)行不同比例的紫菜乳酸菌混合發(fā)酵,設(shè)計(jì)的比例為1∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶3(OD550 nm調(diào)成一致條件下的體積比)以及干酪乳桿菌單菌發(fā)酵。準(zhǔn)備12個(gè)玻璃發(fā)酵瓶,每個(gè)發(fā)酵瓶中稱(chēng)取10 g左右的干紫菜,無(wú)菌水200 mL,食鹽添加量1 g,葡萄糖6 g,置于高壓滅菌鍋(105 ℃、20 min)滅菌后,在超凈臺(tái)中完成菌液的接種,菌種接種量為5%,密封后放入25 ℃生化培養(yǎng)箱中發(fā)酵,設(shè)置3個(gè)平行。每天對(duì)紫菜發(fā)酵液進(jìn)行理化指標(biāo)的檢測(cè),連續(xù)7 d,取樣需無(wú)菌操作。
1.3.3 ?理化指標(biāo)檢測(cè) ?pH測(cè)定用pH計(jì);總酸的檢測(cè)采用GB/T 12456―2008食品總酸檢測(cè)方法[9];發(fā)酵液的亞硝酸鹽、氨基酸、蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)均按試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作;總糖含量的測(cè)定采用蒽酮比色法[10]。
2 ?結(jié)果與分析
2.1 ?乳酸菌分離鑒定
按“1.3.1”的方法獲得3株乳酸菌,命名為HYR-1、HYR-4、HYR-9,經(jīng)初步鑒定HYR-1為短乳桿菌、HYR-4為植物乳桿菌、HYR-9為干酪乳桿菌。圖1顯示的是3株菌16S rRNA經(jīng)序列比對(duì)后采用MEGA6軟件鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
2.2 ?條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵液pH的變化
條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵液pH的變化與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系如圖2所示,發(fā)酵液的起始pH均在4.50左右,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸菌混合發(fā)酵過(guò)程中pH整體呈下降趨勢(shì),在發(fā)酵1~2 d,pH下降速度很快,之后速度減緩,在發(fā)酵至5 d時(shí),4種不同配比發(fā)酵液pH基本穩(wěn)定且維持在2.90~3.05,不同配比的條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵液在pH的變化上沒(méi)有明顯區(qū)別,表明乳酸菌發(fā)酵紫菜在發(fā)酵5 d時(shí)就已經(jīng)達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn),大大縮短了發(fā)酵周期。這與成群等[11]研究乳酸菌制劑發(fā)酵泡菜過(guò)程中pH的變化趨勢(shì)一致。
2.3 ?條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵液總酸含量的變化
由圖3可知,4種不同比例乳酸菌混合發(fā)酵條斑紫菜過(guò)程中總酸含量的整體變化趨勢(shì)相似,紫菜發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的總酸含量逐漸增加。發(fā)酵2 d總酸含量增長(zhǎng)速度最快,之后增長(zhǎng)速度減緩,到發(fā)酵5 d時(shí)總酸含量變化趨于平緩,從發(fā)酵開(kāi)始總酸含量為2.30~3.52 g/L,到發(fā)酵終點(diǎn)總酸含量為12.96~13.75 g/L,1∶1∶2條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵液產(chǎn)酸能力最強(qiáng),發(fā)酵7 d總酸含量為13.75 g/L,為發(fā)酵開(kāi)始時(shí)的6倍。單菌發(fā)酵開(kāi)始總酸含量最高,到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)總酸含量反而最低,含量為12.96 g/L。表明乳酸菌混合發(fā)酵比單菌發(fā)酵的產(chǎn)酸能力略強(qiáng)。
2.4 ?條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵液總糖含量的變化
利用蒽酮比色法測(cè)得總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=6.379 1x+0.005 8,通過(guò)該方程計(jì)算條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵液中的總糖含量。如圖4所示,4種不同配比條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵液的總糖含量逐漸降低,在發(fā)酵2 d時(shí),總糖含量的降低速度最快,主要由于此時(shí)各類(lèi)乳酸菌生長(zhǎng)繁殖需要大量的碳源,因此利用發(fā)酵液中的糖分(主要為單糖和少量多糖)產(chǎn)生大量的乳酸及其他代謝產(chǎn)物。其中,1∶1∶2條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵液的總糖含量由最開(kāi)始的0.417 3 g/L到發(fā)酵終點(diǎn)0.284 0 g/L,發(fā)酵過(guò)程中消耗可溶性總糖量最大,利用率達(dá)到32.94%。1∶1∶1混合乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中總糖含量在5 d時(shí)有升高的跡象,有可能是此時(shí)乳酸菌生長(zhǎng)速度減緩,條斑紫菜中部分多糖類(lèi)物質(zhì)被分解到發(fā)酵液中的速度大于乳酸菌消耗可溶性總糖的速度[12]。從圖4中還可以發(fā)現(xiàn),單菌發(fā)酵分解可溶性糖類(lèi)的能力比混合乳酸菌發(fā)酵能力弱。
2.5 ?條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵液亞硝酸鹽含量的變化
條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵液的亞硝酸鹽含量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系見(jiàn)圖5。在發(fā)酵初期,4種發(fā)酵液中的亞硝酸鹽含量的變化趨勢(shì)均為先增加達(dá)到峰值之后再降低。4種發(fā)酵液的亞硝酸鹽含量峰值均在2 d時(shí)出現(xiàn),之后逐漸下降,最后在6~7 d時(shí)趨于平穩(wěn),且亞硝酸鹽的含量均低于國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)(20 mg/kg)。亞硝酸鹽含量到達(dá)峰值后下降是由于各類(lèi)乳酸菌大量繁殖后,產(chǎn)生大量乳酸等代謝產(chǎn)物,亞硝酸鹽在酸性條件下不穩(wěn)定,逐漸分解。同時(shí),由于發(fā)酵過(guò)程中的氧氣消耗殆盡,硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽的能力也逐漸降低。3種混合發(fā)酵液亞硝酸鹽含量的峰值分別為3.91、3.75、3.84 mg/kg,而單菌發(fā)酵液的峰值為4.43 mg/kg,這可能由于單菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸含量低于混合發(fā)酵的產(chǎn)酸量,酸解亞硝酸的能力也相對(duì)弱一些。1∶1∶2、1∶1∶3混合發(fā)酵液和單菌發(fā)酵液在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)亞硝酸鹽含量降至最低, 約為0.25 mg/kg,而1∶1∶1混合發(fā)酵液在6 d時(shí)亞硝酸鹽含量有略微升高趨勢(shì),最終為0.86 mg/kg,原因可能是在頻繁取樣過(guò)程中帶入氧氣或雜菌導(dǎo)致[13]。
2.6 ?條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵液總氨基酸含量的變化
條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵液總氨基酸含量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系見(jiàn)圖6。4種不同配比乳酸菌發(fā)酵的發(fā)酵液中的氨基酸含量都是先增加后降低。發(fā)酵前期由于條斑紫菜中的蛋白質(zhì)在乳酸菌的作用下,通過(guò)各種代謝途徑降解為小分子肽和游離的氨基酸,以及條斑紫菜本身的呈味氨基酸不斷溶入發(fā)酵液中,使得發(fā)酵液中的氨基酸含量呈快速增加狀態(tài)。發(fā)酵后期,由于部分氨基酸被乳酸菌利用導(dǎo)致氨基酸含量下降,隨著乳酸菌的代謝活動(dòng)減慢,氨基酸含量也趨于穩(wěn)定。1∶1∶3混合發(fā)酵液在發(fā)酵3 d時(shí)達(dá)到最大值,其他3種發(fā)酵液均在發(fā)酵2 d就達(dá)到最大值。其中,1∶1∶1混合發(fā)酵液發(fā)酵過(guò)程中氨基酸含量較高,最大值為58.16 μmol/mL,其他發(fā)酵液均在51.00 μmol/mL左右。這可能是由于1∶1∶1混合發(fā)酵液中短乳桿菌生長(zhǎng)較好,對(duì)氨基酸含量的升高起積極作用,這與宋佳錕等[14]的試驗(yàn)結(jié)論相似。
2.7 ?條斑紫菜乳酸菌混合發(fā)酵液總蛋白質(zhì)含量的變化
由圖7可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量先呈快速上升趨勢(shì),到達(dá)最大值后呈緩慢下降趨勢(shì),到發(fā)酵后期趨于平穩(wěn)。在發(fā)酵2 d時(shí)發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大值,此時(shí)單菌發(fā)酵的蛋白質(zhì)含量最低,為2.42g /L,1∶1∶3混合發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量最高,為4.32g /L,是單菌發(fā)酵的1.79倍。在發(fā)酵初期,在乳酸菌的發(fā)酵作用中,條斑紫菜中的蛋白質(zhì)被不斷釋放到發(fā)酵液中,使得發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量快速增長(zhǎng),由于乳酸菌生長(zhǎng)代謝利用發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)分解為氨基酸,使得發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量逐漸下降[15]。隨著代謝活動(dòng)減緩,發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的含量也趨于平穩(wěn), 其中3種乳酸菌混合發(fā)酵到達(dá)終點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)含量在2.29~2.50g /L,而單菌發(fā)酵中蛋白質(zhì)的含量為1.87 /L。從圖7中可發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)含量下降幅度最小的是單菌發(fā)酵,下降幅度最大的是1∶1∶3混合發(fā)酵液,說(shuō)明復(fù)合菌利用蛋白質(zhì)的能力比單菌發(fā)酵利用蛋白質(zhì)的能力強(qiáng)。
3 ? 結(jié)論
本試驗(yàn)利用16S rRNA序列比對(duì)法對(duì)老壇水中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定,得到3株菌,初步確定為短乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌。以分離鑒定的乳酸菌形成不同配比,將其作為發(fā)酵劑對(duì)條斑紫菜進(jìn)行直投式發(fā)酵,比例分別為1∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶3及單菌。通過(guò)對(duì)4種不同乳酸菌發(fā)酵制劑發(fā)酵條斑紫菜過(guò)程中理化因子的變化規(guī)律進(jìn)行研究,探索出單菌發(fā)酵和復(fù)合發(fā)酵對(duì)條斑紫菜發(fā)酵的影響。
對(duì)4種發(fā)酵液中的pH進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種發(fā)酵液的pH整體下降趨勢(shì)相似,發(fā)酵2 d由于乳酸菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,生長(zhǎng)代謝最旺盛,發(fā)酵液pH迅速下降,到發(fā)酵5 d時(shí)呈平穩(wěn)狀態(tài),4種發(fā)酵液的pH均從發(fā)酵前的4.50左右下降到2.90左右,這與于新穎等[12]測(cè)量的泡菜鹵中pH的變化趨勢(shì)相似。對(duì)總酸的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),總酸含量在發(fā)酵前3 d增加速度最快,并在發(fā)酵5 d后逐漸趨于平穩(wěn),從發(fā)酵開(kāi)始的總酸含量為2.30~3.52 g/L,到發(fā)酵后期總酸含量為13.00~13.75 g/L,對(duì)比發(fā)現(xiàn)3種復(fù)合菌發(fā)酵比單菌發(fā)酵的產(chǎn)酸能力略強(qiáng)[16]。4種不同比例乳酸菌發(fā)酵條斑紫菜發(fā)酵液的總糖含量逐漸降低,其中1∶1∶2乳酸菌混合發(fā)酵的總糖含量由最開(kāi)始的29.95 g/L下降到發(fā)酵終點(diǎn)的18.97 g/L,發(fā)酵過(guò)程中消耗可溶性總糖量最大。單菌發(fā)酵分解可溶性糖類(lèi)的能力比乳酸菌混合發(fā)酵分解糖類(lèi)的能力弱。在發(fā)酵初期,4種發(fā)酵液中亞硝酸鹽的含量的變化趨勢(shì)均為先增加達(dá)到峰值之后再降低[17-20]。4種發(fā)酵液發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽峰值出現(xiàn)時(shí)間相同,但峰值大小不同,其中1∶1∶2混合發(fā)酵液的峰值最低,為3.75 mg/kg;單菌發(fā)酵的峰值最高,為4.43 mg/kg。發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的總氨基酸含量都是先增加后降低,其中1∶1∶1混合發(fā)酵液發(fā)酵過(guò)程中的總氨基酸含量較高,最大值為58.16 μmol/mL,其他處理均在51.00 μmol/mL左右。發(fā)酵液中的總蛋白質(zhì)含量先呈快速上升趨勢(shì),發(fā)酵2 d達(dá)到最大值后呈緩慢下降趨勢(shì),到發(fā)酵5 d趨于平穩(wěn),其中總蛋白質(zhì)含量下降幅度相對(duì)較小的是單菌發(fā)酵液,下降幅度相對(duì)較大的是1∶1∶3混合發(fā)酵液,說(shuō)明混合發(fā)酵利用蛋白質(zhì)的能力比單菌發(fā)酵利用蛋白質(zhì)的能力強(qiáng)。
對(duì)從老壇水中分離并鑒定的純種乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),可以大大縮短條斑紫菜的發(fā)酵周期,發(fā)酵5 d進(jìn)入平穩(wěn)期,這是由于接種2 d后的乳酸菌處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,繁殖能力旺盛,產(chǎn)酸能力強(qiáng),產(chǎn)亞硝酸鹽含量低,利用蛋白質(zhì)和氨基酸能力強(qiáng),這與趙文紅等[21]的研究結(jié)果一致。4種乳酸菌發(fā)酵條斑紫菜的過(guò)程中,混合乳酸菌發(fā)酵比單菌發(fā)酵具有優(yōu)勢(shì),其中1∶1∶2混合發(fā)酵液發(fā)酵效果最好。但由于條斑紫菜前期經(jīng)過(guò)殺菌處理,排除了其他微生物的協(xié)同作用,所以風(fēng)味方面還需要進(jìn)一步研究。