杉木雜交組合內(nèi)生長性狀分離的機制探討

王海蓉，齊 明，葉金俊，何貴平

（1.浙江省遂昌縣林業(yè)技術推廣總站，浙江 遂昌 323300；2.中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；3.浙江省林木育種技術研究重點實驗室，浙江 杭州 311400）

雜交育種是杉木Cunninghamia lanceolata遺傳改良的主要途徑[1]。在杉木雜交育種研究中，生長性狀的雜種優(yōu)勢現(xiàn)象已有報道[2]，但對雜種的生長、材質(zhì)等性狀分離的分子機理研究的較少。杉木是我國重要的工業(yè)用材樹種，按照短周期工業(yè)用材的要求，除了速生優(yōu)質(zhì)外，另外就是要收獲期一致。杉木遺傳改良進入了第三代，杉木育種群體是多世代與高強度選擇的產(chǎn)物，雜合體居多。福建省已觀察到杉木高世代種子園的后代生長明顯分離，這明顯不利于杉木工業(yè)用材林的收獲。杉木無性系和親本性狀互補的親本雙系雜交種子園有著獨有的優(yōu)勢，但是無性系對立地條件要求較高，且存在“C”效應（即年齡效應和位置效應）。杉木雙系種子園有獨有的優(yōu)勢，但是這必須建立在優(yōu)良雜交組合的子代分離研究的基礎上。通過選擇性狀互補的優(yōu)良親本進行控制雜交，再經(jīng)苗期評價，可以選育出生長節(jié)律大致相同的雜交新品種。

近年來，我國對一年生雜種實生苗分離狀況的研究報道多在李[3]Prunus salicina，柚[4]Citrus maxima，棗[5]Ziziphus jujuba，蘋果[6-7]Malus pumila和梨[8-9]Pyrusspp.等園藝植物上，研究多在1～ 3 年生以上的生長勢或親本與童期的關系方面，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一年生植物枝干、葉片、針刺等性狀可作為早期鑒定、早期選擇的主要指標。在用材林研究上，邱有德等[10]發(fā)現(xiàn)巨桉Eucalyptus grandis控制優(yōu)質(zhì)大徑材的EgLBD基因及其作用機制，但杉木雜交組合的子代分離對收獲期的影響尚未引起同行的注意。不少學者在杉木研究中借助RNA-seq 技術來研究杉木纖維性狀發(fā)育的形成機制和木材形成層活動的機理[11-13]。

目前，尚未發(fā)現(xiàn)有人采用轉(zhuǎn)錄組技術研究杉木優(yōu)良雜交組合內(nèi)生長性狀分離的分子機理。本研究在齊明等[14-15]對杉木雜交子代試驗林生長量前期試驗調(diào)查的基礎上，利用無參轉(zhuǎn)錄組測序技術，在基因差異研究的基礎上，以基因差異表達分析為切入點，以杉木一個優(yōu)良組合的超親、低親兩組雜交子代及其親本為研究材料，展開雜種子代和親本兩兩間的比較分析，來探討杉木雜種生長性狀分離的分子機理，揭示杉木優(yōu)良雜交組合高生產(chǎn)力的原因。

1 材料與方法

1.1 研究材料

研究材料取自浙江省遂昌縣湖山鄉(xiāng)大橋村的杉木雜交子代試驗林，1996 年重復制種，1997 年育苗，1998年春營造試驗林，試驗設計為完全隨機區(qū)組，19 個處理，8 次重復，縱向單行5 株小區(qū)，每個家系40 株參加試驗，造林株行距為2 m×2 m。2005 年11 月進行生長量調(diào)查[14-15]。2017 年6 月完成葉片取樣，葉樣來自樣樹頂部當年生嫩枝和針葉，在研究其遺傳變異的基礎上，選取表現(xiàn)最優(yōu)的一個雜交組合（龍15×1339）中的超高親子代（生長超過最優(yōu)親本的子代，HF1）和超低親子代（生長低于中親的子代，LF2），和同齡雙親（龍15 和1339）。3 個生物學重復，共12 個樣本，參與測序分析。

1.2 研究方法

1.2.1 遺傳變異及生長性狀的分離研究 本試驗分析了研究材料的遺傳變異、生長等性狀的分離情況、以及優(yōu)良組合龍15×1339 的生產(chǎn)力，并將其與測序結(jié)果聯(lián)系起來，進行研究。

1.2.2 cDNA 文庫準備及RNA-seq 測序 文庫構(gòu)建、無參轉(zhuǎn)錄組測序，以及隨后的unigene 功能注釋、reads 富集與分類和基因表達等內(nèi)容的分析方法參見文獻[16-20]。

1.2.3 序列比對及差異表達基因與雜種生產(chǎn)力間的關系分析 通過Illumina Hiseq 4000 測序獲得的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，需要經(jīng)過生物信息學處理與分析[16-20]，方能獲得有意義的結(jié)果。除了樣本針葉的采集和研究方案的制定外，所有測序和初步分析（包括GO 富集與分類、KEGG 的富集等分析）委托杭州聯(lián)川生物技術股份有限公司完成。在此基礎上，對注釋的基因，GO 和KEGG terms 富集結(jié)果，考查terms 間和terms 內(nèi)基因的平衡狀態(tài)，并追蹤幾個顯著KEGG terms 內(nèi)，四個比較組間基因上調(diào)或下調(diào)規(guī)律，以揭示雜種生產(chǎn)力的高產(chǎn)和低產(chǎn)的原因。unigene 的表達量FPKM（Fragments per kb per Million fragments），計算公式：

式中，F(xiàn)PKM是某個基因（A）的表達量，C是唯一比對到基因A 的片段數(shù)，N是唯一比對到所有unigene 的總片段數(shù)，L為unigene A 的堿基數(shù)。

樣本比較組的GO-term 或KEGG-term 間基因處于平衡或不平衡的狀態(tài)指數(shù)k=sum（第i個下調(diào)term 的基因數(shù)/第i個上調(diào)term 的基因數(shù)）/n，上式中i取1～n，標準差按常規(guī)公式計算。當k等于或接近于1 時，樣本組間的差異表達基因處于平衡狀態(tài)，反之則處于不平衡狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 研究材料的生長變異性和生長分離情況

對9 年生時試驗林生長性狀的遺傳變異進行調(diào)查分析[14-15]，結(jié)果見表1。

表1 研究群體和優(yōu)良雜交組合（龍15×1339）9 年生的生長性狀大小和分離信息[14-15]Table 1 Growth traits and segregation of C.lanceolata in a 9-year cross hybrid stand and cross combination 15× 1339 in Suichang

由表1 可知，優(yōu)良雜交組合的平均生長性狀水平比群體的平均水平要高；優(yōu)良雜交組合的生長性狀的變異幅度略小于全林試驗結(jié)果，這與參試子代樣本數(shù)的多少有關（組合樣本數(shù)/全林子代樣本數(shù)=36/602）；除材積的表型變異性，群體水平略高于雜交組合外，在樹高、胸徑上均為優(yōu)良組合龍15×1339 超過群體平均變異水平，說明本試驗中的優(yōu)良組合龍15×1339 中子代的分離變異還是較大的。

另外，HF1 的平均胸徑是LF2 胸徑的134.81%～ 138.32%；HF1 平均樹高是LF2 的134.60%～ 150%。采樣的子代植株、親本龍15 和1339 生長發(fā)育均正常。

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量和基因表達概況

杉木4 個處理12 個樣品，測序測得的原始序列（Raw reads）介于（4.3E+07）～（5.2E+07）nt；12 個樣本的Clean reads 分別介于（4.3E+07）～（5.2E+07）nt。Clean reads 有效數(shù)據(jù)占原始Raw reads 的比例在98%以上。二代測序中，每測一個堿基會給出一個相應的質(zhì)量值，這個質(zhì)量值是衡量測序準確度的。Q20 代表錯誤率為1%；Q30 代表錯誤率為0.1%。測序中的Q20 與Q30 則表示質(zhì)量值≥20 或30 的堿基所占百分比。12 個樣本的Phred數(shù)值大于Q20 和Q30 的堿基占總體堿基的百分比，Q20 和Q30 的百分比分別介于98.20%～ 98.84%和95.07%～96.4%。原始測序序列中，堿基G 和堿基C 的數(shù)量總和占總堿基數(shù)的百分比（GC%）介于44.20%～ 45.08%之間。

綜合以上幾個測序質(zhì)量評價指標，說明12 份樣品的測序質(zhì)量較高，能保證后續(xù)研究和滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析的要求。

2.3 測序數(shù)據(jù)的拼接和基因注釋結(jié)果

測序數(shù)據(jù)的拼接結(jié)果是，平均GC%達40.78%；當讀長數(shù)達50%時，該讀長的長度為1 214nt。綜合其它項的結(jié)果，可以得出測序數(shù)據(jù)的組裝拼接的結(jié)果很成功。

對Clean reads 在六個數(shù)據(jù)庫進行BLASTX 分析，將獲得的基因分別在Swiss-prot，Nr，Pfam，KEGG，KOG和GO 中注釋，結(jié)果杉木親代和子代共注釋有80 171 個基因。

杉木為無參測序，測得的數(shù)據(jù)通常采用blastX 序列比對，各數(shù)據(jù)庫所注釋總的基因比率大于100%，這表明有的基因同時在不同的數(shù)據(jù)庫得到了重復注釋。

測序數(shù)據(jù)質(zhì)量、基因表達測序、數(shù)據(jù)的拼接和基因注釋結(jié)果更詳細的情況參見文獻[15]。

2.4 差異表達基因的GO 富集與分類分析和雜種子代的生產(chǎn)力

本研究選擇4 個樣本組，HF1 VS P1（HF1 與龍15 相比），HF1 VS P2（HF1 與1339 相比），LF2 VS P1（LF2 與龍15 相比），LF2 VS P2（LF2 與1339 相比），對所有的DEGs（differentially expressed genes）進行GO 功能富集分析，從中挑選出基因表達量顯著的GO terms 進行GO 分類分析作圖。GO 功能分類體系中有參與生物過程（BP）、細胞組分（CC）以及分子功能（MF）3 個大類，43 或45 個小類別。HF1 VS P1 中，GO的功能富集，前10 名的結(jié)果是：脅迫反應（k=3）>糖結(jié)合（k=9/0）>赤霉素介導的信號通路（k=2）>受體活性（k=20）>防御性反應（k=2）>脫落酸活性（k=5）>蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性（k=9/0）>轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域DNA結(jié)合（k=9/0）>節(jié)律過程（k=1）>過氧化物酶活性（k=0.33）。這10 個GO terms 內(nèi)，表達基因不均衡。

圖1 HF1 VS P1 差異表達基因的GO 分類Figure 1 GO classification of differentially expressed genes in HF1 VS P1

比較組LF2 VS P1 的GO 的功能富集結(jié)果，前10 名排列順序為：細胞壁組織（k=0.127 7） >細胞外區(qū)域（k=0.145 2） >不可或缺的膜（k=1.213 7）>受體活性（k=2.387 1）>蛋白激酶活性（k=2）>纖維素分解過程（k=0.142 9）>纖維素酶活性（k=0.142 9）>碳水化合物代謝過程（k=0.347 8）>轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移?；酝獾陌被；╧=0.428 6）>纖維素生物合成的過（k=0.2）。

圖2 是LF2 VS P1 的GO 富集與分類分析結(jié)果，與圖1 一樣，仍以龍15（P1）為參照物，LF2 VS P1 中不同的GO terms 中參與新陳代謝的基因數(shù)目不同；針對大多數(shù)GO terms，基因下調(diào)和上調(diào)有著相似的態(tài)勢。同時在所有的GO terms 上存在顯著的上調(diào)基因，LF2 VS P1 中GO terms 上基因分布趨于均勻、平衡。

圖2 LF2 VS P1 差異表達基因的GO 分類Figure2 GO classification of differentially expressed genes in LF2 VS P1

比較圖1 與圖2 發(fā)現(xiàn)，HF1 VS P1 和LF2 VS P1 的分析結(jié)果不一致，其一表現(xiàn)在GO terms 層面，富集分析前10 名的GO terms 中，僅有活體受性一個GO term 相同，其它terms 均不相同；其二表現(xiàn)在GO terms 內(nèi)上調(diào)基因和下調(diào)基因數(shù)目的不均衡性上，HF1 VS P1 的不平衡結(jié)果，比LF2 VS P1 比較組的結(jié)果更甚。在HF1 VS P1中，差異表達基因在不同GO terms 上分布處于不均勻、不平衡，而LF2 VS P1 中，整個系統(tǒng)間差異表達的基因數(shù)相差不大，平衡系數(shù)接近于1.0。由此得出，HF1 生長優(yōu)于LF2 正是HF1 的基因系統(tǒng)處于非均勻、非平衡狀態(tài)；而LF2 生長慢則是由于LF2 的基因系統(tǒng)趨向于均勻、平衡狀態(tài)。這是杉木雜種生長分離的內(nèi)在遺傳基礎。

本研究還研究了HF1 VS P2 和LF2 VS P2 比較組GO 的富集與分類研究結(jié)果。HF1 VS P2 和LF2 VS P2 的分析結(jié)果與HF1 VS P1 和LF2 VS P1 基本一致，盡管參照對象變了，但HF1 和LF2 其系統(tǒng)內(nèi)差異表達的基因數(shù)目所處的狀態(tài)并沒有改變。HF1 和LF2 基因所處的狀態(tài)、平衡參數(shù)的統(tǒng)計分析結(jié)果列于表2。

表2 杉木轉(zhuǎn)錄組組內(nèi)差異基因表達平衡與否的狀態(tài)分析Table 2 Differentially expressed genes in different group

從表2 中可以發(fā)現(xiàn)，HF1 的差異表達基因的分布處于不均勻、不平衡狀態(tài)，LF2 的差異表達基因的分布趨于均勻、平衡狀態(tài)。就KEGG terms 的富集結(jié)果，我們使用了更多的KEGG terms（上調(diào)/下調(diào)基因）資料，從系統(tǒng)的角度，探討了全部資料的KEGG terms 的富集結(jié)果與雜種生長性狀分離間的關系，計算其平衡系數(shù)，結(jié)果也列于表2。由表2 可知，255 個KEGG terms 中，相對優(yōu)良親本，HF1 的平衡系數(shù)k>1.2；而LF2 的平衡系數(shù)k十分接近于1.0。

2.5 差異表達基因的Pathway 顯著性富集分析與子代的生長優(yōu)勢

通過KEGG 數(shù)據(jù)庫中的Pathway 富集分析，確定DEGs 參與的主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑等，結(jié)果顯示，子代/親代4 個比較組中，差異表達的基因分布在74～ 130 條Pathway 中。表3 為處理比較組HF1 VS P1，HF1 VS P2，LF2 VS P1 和 LF2 VS P2 富集結(jié)果中最顯著的前10 條Pathway。由表3 可見，HF1 VS P1 和HF1 VS P2富集結(jié)果接近；LF2 VS P1 和LF2 VS P2 的富集結(jié)果接近。但在相同的參照物下，HF1 與LF2 的KEGG 富集結(jié)果差異很大：LF2 VS P1 與HF1 VS P1 僅有兩個KEGG terms（苯丙氨酸代謝和亞油酸的新陳代謝）相同，其它八個KEGG terms 不相同；同時相同的KEGG term 內(nèi)，上調(diào)基因數(shù)與下調(diào)基因數(shù)不同。LF2 VS P2 與HF1 VS P2間的比較結(jié)果：也有兩個KEGG terms（苯丙素的生物合成和苯丙氨酸代謝）相同，其它八個KEGG terms 不相同，同時在相同的KEGG terms 內(nèi)，上調(diào)基因數(shù)與下調(diào)基因數(shù)相同或不同。

表3 4 個比較組的KEGG 富集結(jié)果中前10 個代謝途徑（表中p<0.01）Table 3 KEGG enrichment and top 10 metabolic pathways of four group samples of parents and cross seedlings

綜合以上Pathway 富集分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，HF1 和LF2 比較組的遺傳差異，表現(xiàn)在兩個層面上：其一是KEGG-term 間的不平衡；其二是KEGG-term 內(nèi)，上調(diào)/下調(diào)的基因不均衡。這與GO 的富集分析結(jié)果基本一致，這正是HF1 生長優(yōu)于LF2 的原因。但要揭示杉木雜交組合生長性狀分離的內(nèi)在機制，最好在HF1 和LF2 比較組間，選擇相同的富集顯著的terms，然后再比較terms 內(nèi)基因是上調(diào)表達，還是下調(diào)表達。

按照這一思路，我們比較了LF2 VS P1 與HF1 VS P1，HF1 VS P2 與LF2 VS P2 幾個相同的KEGG terms 基因表達情況，列于表4。

表4 相同terms 下基因的差異表達情況Table 4 Differential expression of genes within same terms

由表4 可知，在LF2 中，基因一般仍表現(xiàn)為下調(diào)表達或沉默，而在HF1 中上調(diào)表達，只有亞油酸代謝中，在LF2 中下調(diào)表達，在HF1 中上調(diào)表達，這是解釋雜種生長分離的原因之一，但它屬于terms 間的差異。

3 結(jié)論與討論

杉木雜種高生產(chǎn)力的原因是其內(nèi)在基因系統(tǒng)中基因分布不均勻、不平衡的原因。杉木優(yōu)良組合中子代生長會出現(xiàn)分離：HF1 生長比LF2 生長快，是由于HF1 GO terms 和KEGG terms 層面不平衡，以及GO terms 和KEGG terms 內(nèi)的基因表達數(shù)量，以及其內(nèi)上調(diào)/下調(diào)的基因分布處于不均勻、不平衡狀態(tài)；LF2 GO terms 和KEGG terms的差異基因的數(shù)量，以及其內(nèi)上調(diào)/下調(diào)的基因分布趨于均勻、平衡狀態(tài)（圖1 和圖2）。杉木雜種生產(chǎn)力的高低符合耗散結(jié)構(gòu)理論：不平衡體系，能量大，信息多，生產(chǎn)力也最高。

杉木雜種生長性狀存在分離現(xiàn)象，對收獲期不利。GO 和KEGG 富集分析，揭示有大量的基因參與了生長過程。標記輔助選擇MAS 研究工作量太大，成本高，技術復雜。利用分子生物學技術，對育種群體展開遺傳多樣性研究，選擇表達基因互補的親本，進行雜交組配，形成雜合體子代，這樣降低雜種生長性狀的分離，以達到收獲期的大體一致，是一條可行的技術路線[21-22]。