pH對(duì)百子蓮體胚誘導(dǎo)期生理特性的影響

岳建華，董 艷，李文楊，李 蒙，張 琰，*

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 園藝學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464100； 2.信陽(yáng)市大別山區(qū)園藝植物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽(yáng) 464100； 3.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 林學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464100)

百子蓮(Agapanthuspraecox)又稱藍(lán)百合，百子蓮科(Agapanthaceae)百子蓮屬(Agapanthus)多年生草本花卉，原產(chǎn)南非，可作鮮切花、盆花、花境和園林地被應(yīng)用[1]。百子蓮觀賞價(jià)值高，抗逆性強(qiáng)，目前在上海已大量應(yīng)用，我國(guó)中部地區(qū)也在逐步推廣。但由于其生長(zhǎng)緩慢，播種、分株等繁殖方式難以滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需求。體細(xì)胞胚胎發(fā)生是一種高效的離體再生途徑，培養(yǎng)基的激素[2]、碳源[3]、pH[4]等通過(guò)影響離體培養(yǎng)條件下外植體的激素代謝、糖代謝、脅迫信號(hào)等來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)與分化，影響體胚誘導(dǎo)和發(fā)育[4-6]。目前，培養(yǎng)基激素、碳源的研究報(bào)道較多，毒莠定(picloram，PIC)特異性調(diào)控單子葉植物離體細(xì)胞胚性啟動(dòng)[7]，已被證實(shí)為調(diào)控百子蓮體胚發(fā)生的關(guān)鍵激素類物質(zhì)[8-10]；質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)2%～3%的蔗糖可為體胚發(fā)生提供合適的能量和滲透壓，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[2]，可應(yīng)用于百子蓮體胚誘導(dǎo)[8]。目前，一般將誘導(dǎo)百子蓮體胚發(fā)生的培養(yǎng)基pH在滅菌前調(diào)至5.6～5.8[8，11]。

激素、糖代謝和脅迫信號(hào)在植物體胚發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12-13]。PIC對(duì)百子蓮愈傷組織、胚性愈傷組織誘導(dǎo)和胚性能力的保持均有重要影響[9]，可顯著影響吲哚乙酸(indole acetic acid，IAA)含量[10]，而IAA通過(guò)影響細(xì)胞極性建立胚性[5]。赤霉素(gibberellin，GA)、脫落酸(abscisic acid，ABA)、細(xì)胞分裂素(cytokinin，CTK)等顯著調(diào)控體胚發(fā)生效果[2，14-15]，油菜素甾醇(brassinosteroid，BR)、乙烯(ethylene)、茉莉酸(jasmonate，JA)等對(duì)體胚發(fā)生進(jìn)程也具有重要影響[16]。不同植物、不同離體培養(yǎng)階段對(duì)碳源的需求不同，糖組分顯著影響體胚發(fā)生效率[17]。例如挪威云杉(Piceaabies)體胚發(fā)生過(guò)程中，在體胚成熟、干燥階段對(duì)蔗糖的需求量極大，在體胚成熟發(fā)育中期對(duì)淀粉含量需求較高[17]。植物體胚發(fā)生過(guò)程中的脅迫信號(hào)主要通過(guò)活性氧(reactive oxygen species，ROS)表達(dá)，包括羥自由基(·OH)和過(guò)氧化氫(H2O2)等[6，18]。合理強(qiáng)度的ROS可促進(jìn)細(xì)胞脫分化和體胚形成[6]，提高H2O2含量可促進(jìn)體胚發(fā)生[19]。植物細(xì)胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)和過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)可清除ROS，維持胞內(nèi)生理平衡[5-6，18]?？寡趸富钚灾苯佑绊懼参锛?xì)胞脫分化和再分化的相關(guān)生理過(guò)程，例如寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)SOD活性上升，可促進(jìn)胚性細(xì)胞的分化和早期胚胎發(fā)育[19]。

植物離體培養(yǎng)過(guò)程中，pH通過(guò)維持植物細(xì)胞生理代謝所需的弱酸性環(huán)境，影響激素含量、糖積累、ROS積累和抗氧化酶活性，以上因素對(duì)體胚發(fā)生的調(diào)控非常重要[5，18，20]，但pH對(duì)以上生理特性的調(diào)控效果卻鮮有報(bào)道，在百子蓮的研究中尚屬空白。本文擬研究不同pH處理下百子蓮體胚誘導(dǎo)效果，并初步揭示不同pH下百子蓮體胚內(nèi)源激素、糖類、活性氧和保護(hù)酶類的變化規(guī)律及其對(duì)體胚誘導(dǎo)效率的影響，豐富植物體胚發(fā)生理論。

1 材料與方法

1.1 試材

百子蓮購(gòu)自南京市彩虹花卉公司，栽植于信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院校內(nèi)實(shí)驗(yàn)基地。2017年5～6月，選取5年生植株未開(kāi)裂的小花苞，切取小花梗作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，誘導(dǎo)方法參照文獻(xiàn)[21]。愈傷組織每月繼代1次，7～9個(gè)月后，得到單細(xì)胞起源的胚性愈傷組織，繼代6個(gè)月后用于試驗(yàn)研究。選取狀態(tài)一致、生長(zhǎng)旺盛、顏色鮮黃、結(jié)構(gòu)疏松的胚性愈傷組織進(jìn)行體胚幼胚(young somatic embryo，YSE)誘導(dǎo)，以YSE為試材進(jìn)行體胚成熟胚(mature somatic embryo，MSE)誘導(dǎo)。

1.2 培養(yǎng)基配制與接種

在YSE、MSE誘導(dǎo)階段，將培養(yǎng)基pH分別調(diào)至5.6、5.8、6.0、6.2。幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+30.0 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1瓊脂，成熟胚發(fā)育培養(yǎng)基為MS+20.0 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂。培養(yǎng)基配置方法：稱取MS干粉(Phytotech Lab M519)4.43 g·L-1，超純水溶解后加蔗糖，充分混勻，1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)至目標(biāo)pH，加瓊脂，121 ℃高壓滅菌25 min，冷卻至60 ℃左右于超凈工作臺(tái)內(nèi)分裝至90 mm × 16 mm玻璃培養(yǎng)皿，每皿倒25 mL左右，冷卻至室溫后接種。

1.3 培養(yǎng)條件

每皿培養(yǎng)基接種1.0 g材料，分為大小基本相同的9份，按3×3分布方式擺放至平板培養(yǎng)基中，每處理接種5皿，設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)室溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度65%左右，暗培養(yǎng)7 d后，轉(zhuǎn)至光周期14 h/10 h(L/D)下培養(yǎng)，光量子通量密度為50 μmoL·m-2·s-1。

1.4 觀察與計(jì)數(shù)

培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)體胚數(shù)量。YSE誘導(dǎo)階段，統(tǒng)計(jì)形態(tài)完整、尺寸大于1 mm的不透明狀胚胎數(shù)量。誘導(dǎo)的YSE轉(zhuǎn)接至MSE誘導(dǎo)培養(yǎng)基，30 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)量，該階段統(tǒng)計(jì)具有明顯胚芽和胚根結(jié)構(gòu)、形態(tài)學(xué)上端為綠色、整體長(zhǎng)度大于5 mm的胚數(shù)量。

1.5 生理指標(biāo)測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定激素、糖類、活性氧與保護(hù)酶等生理指標(biāo)，委托上海酶聯(lián)生物科技有限公司參照Pradko等[22]的方法進(jìn)行測(cè)定。方法如下：稱取1.0 g鮮樣，加2 mL樣品提取液，冰浴勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL試管；4 ℃提取上清液，過(guò)C-18固相萃取柱；轉(zhuǎn)入5 mL離心管，真空冷凍干燥，樣品稀釋液定容；加標(biāo)樣和待測(cè)樣，取標(biāo)樣稀釋為梯度濃度(含0 ng·mL-1)，將標(biāo)樣和待測(cè)樣加入96孔酶標(biāo)板，每孔50 μL，待測(cè)樣設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)；加一抗，將酶標(biāo)板置入濕盒內(nèi)，37 ℃ 30 min后洗板，洗滌4次；加二抗，放入濕盒內(nèi)，置于37 ℃ 30 min；洗板后加底物顯色，每孔加50 μL 2 mol·L-1硫酸終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)樣和樣品490 nm處的吸光度D490，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品含量或酶活性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016、GraphPad Prism 5、Adobe Photoshop進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(LSD法，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)體胚誘導(dǎo)效果的影響

由圖1可知，pH對(duì)百子蓮體胚誘導(dǎo)效果有顯著影響。不同pH處理下YSE誘導(dǎo)數(shù)量具有顯著差異，培養(yǎng)基pH 6.0利于YSE誘導(dǎo)，誘導(dǎo)數(shù)量約為每皿46個(gè)，比pH 5.6、pH 5.8和pH 6.2分別增加21.05%、17.20%和138.96%，差異顯著(P<0.05)(圖1-A)。如圖1-B所示，隨著pH(5.6～6.2)的升高，MSE數(shù)量逐漸增加。pH 6.2處理下，MSE數(shù)量可達(dá)每皿75個(gè)，比pH 5.6、pH 5.8和pH 6.0分別增加135.79%、40.88%和36.59%。綜上，YSE誘導(dǎo)和MSE誘導(dǎo)階段，較佳的pH分別為6.0和6.2。

n=3，柱上無(wú)相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。n=3. Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.圖1 pH對(duì)體胚誘導(dǎo)效果的影響Fig.1 Effects of pH on somatic embryo induction

2.2 pH對(duì)體胚誘導(dǎo)內(nèi)源激素的影響

體胚誘導(dǎo)階段，pH對(duì)激素含量具有顯著影響(圖2)。與MSE階段相比，不同pH處理下YSE誘導(dǎo)階段內(nèi)源IAA含量相對(duì)較高，且在pH 6.0處理下達(dá)到最高，比pH 6.2處理增加25.31%，差異顯著(P<0.05)(圖2-A)。結(jié)合態(tài)IAA(binding IAA)含量受pH的影響較大，且與體胚誘導(dǎo)數(shù)量變化趨勢(shì)不一致(圖2-B)。IAA氧化酶活性與成熟胚數(shù)量變化規(guī)律一致，YSE階段在pH 6.0處理下IAA氧化酶活性較強(qiáng)，MSE階段在pH 6.2處理下IAA氧化酶活性較強(qiáng)(圖2-C)。GA含量在體胚誘導(dǎo)過(guò)程中變化顯著，尤其是GA4含量。YSE階段在pH 5.8處理中GA4含量較高；成熟胚階段在pH 6.2處理中GA4含量最高，分別比pH 5.6、pH 5.8和pH 6.0增加26.44%、18.63%和28.39%，差異顯著(P<0.05)。YSE階段的GA1含量顯著高于MSE階段，YSE階段在pH 6.0處理中GA1、GA3含量最低，MSE階段在pH 6.2處理中GA1、GA3含量相對(duì)較低(圖2-E、F)。YSE階段在pH 5.8處理下BR含量顯著低于其他處理，MSE階段在pH 5.8和pH 6.0處理下BR含量顯著低于其他處理。相同pH處理下YSE階段的CTK含量普遍高于MSE階段，pH 5.6處理下YSE階段和MSE階段的CTK含量高于其他處理，其他處理間差異不顯著(P>0.05)。YSE階段和MSE階段不同處理的乙烯含量差異均不顯著(P>0.05)，表明百子蓮體胚中乙烯含量受pH影響較小。ABA含量受pH的影響較大，YSE階段和MSE階段分別在pH 6.0和pH 6.2處理中含量最高，且與體胚發(fā)生效率較為一致。YSE階段和MSE階段的JA含量均在pH 6.0處理中最低(圖2-L)。

圖2 pH對(duì)體胚誘導(dǎo)期內(nèi)源激素的影響Fig.2 Effects of pH on endogenous hormone in somatic embryo induction stage

2.3 pH對(duì)體胚誘導(dǎo)糖代謝的影響

圖3-A所示，YSE階段pH 6.0處理的淀粉含量比pH 5.6和pH 5.8處理分別顯著(P<0.05)增加26.48%和16.57%，pH 6.0處理的總糖含量也較高，比pH 5.6、pH 5.8和pH 6.2處理分別顯著增加26.37%、25.95%和27.20%(P<0.05)，而MSE階段，總糖含量隨pH升高而降低(圖3-B)。pH對(duì)蔗糖含量的影響顯著，YSE階段pH 6.0處理的蔗糖含量顯著高于其他處理，比pH 5.6、pH 5.8和pH 6.2處理分別顯著增加22.36%、41.57%和17.19%(P<0.05)；MSE階段蔗糖含量隨pH升高而升高，pH 6.2處理的蔗糖含量最高，比pH 5.6和pH 5.8分別顯著增加36.78%和29.12%(P<0.05)(圖3-C)。YSE階段，葡萄糖和麥芽糖含量在不同pH處理中的變化趨勢(shì)一致，在pH 5.8和6.0處理中葡萄糖和麥芽糖含量均顯著高于其他處理(P<0.05)(圖3-D、E)。YSE階段pH對(duì)果糖含量的影響較小，pH 6.2處理的果糖含量顯著(P<0.05)高于pH 5.6處理，其他處理間差異均不顯著(P>0.05)；MSE階段，pH 5.8處理的果糖含量顯著(P<0.05)高于pH 5.6和6.0處理，與pH 6.2處理的果糖含量差異不顯著(P>0.05)(圖3-F)。

2.4 pH對(duì)體胚誘導(dǎo)氧化脅迫的影響

體胚誘導(dǎo)階段，ROS積累受到pH影響顯著，YSE誘導(dǎo)階段pH 6.0和MSE誘導(dǎo)階段pH 6.2處理下，ROS強(qiáng)度在各處理中處于中等水平(圖4-A)。在YSE階段，pH 5.8和6.0處理的羥自由基(·OH)積累較多，顯著高于pH 5.6和6.2處理；成熟胚誘導(dǎo)階段，pH 5.6處理的·OH含量最高，顯著(P<0.05)高于其他處理，pH 6.2處理的·OH含量最低(圖4-B)。在YSE誘導(dǎo)階段，pH 6.0處理的H2O2含量顯著(P<0.05)低于其他處理，其他處理間差異不顯著(P>0.05)；在成熟胚誘導(dǎo)階段，pH 6.2處理下H2O2含量最高，比pH 5.6、pH 5.8和pH 6.0處理分別增加27.85%、30.83%和35.65%(圖4-C)。不同pH環(huán)境下，POD、CAT和SOD活性在YSE、MSE階段呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。YSE誘導(dǎo)階段，不同pH處理的POD活性差異不顯著(P>0.05)；MSE階段，pH 6.2處理的POD活性最低，顯著(P<0.05)低于pH 5.6和6.0處理(圖4-D)。YSE誘導(dǎo)階段pH 6.0處理下，CAT、SOD活性較低，MSE階段pH 5.6和6.2處理下CAT、SOD活性相對(duì)較高(圖4-E、F)。

2.5 不同pH處理下各指標(biāo)的相關(guān)性

為分析pH對(duì)體胚發(fā)生效果的影響，并揭示體胚誘導(dǎo)的生理變化規(guī)律，將pH、體胚誘導(dǎo)數(shù)量、生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表1與表2，表中僅顯示與體胚誘導(dǎo)數(shù)量相關(guān)性較強(qiáng)(Pearson相關(guān)系數(shù)>0.650)的生理指標(biāo)。幼胚誘導(dǎo)階段，pH與其他指標(biāo)的相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平。YSE的誘導(dǎo)數(shù)量與IAA含量呈極顯著正相關(guān)，與GA1、JA含量和POD活性均呈顯著負(fù)相關(guān)；IAA含量與GA1含量和POD活性呈顯著負(fù)相關(guān)；GA1含量與JA含量和POD活性呈極顯著正相關(guān)，與H2O2含量呈顯著正相關(guān)；JA含量與H2O2含量和POD活性呈顯著正相關(guān)。幼胚誘導(dǎo)階段的相關(guān)性分析表明，內(nèi)源IAA含量可能是促進(jìn)YSE數(shù)量的關(guān)鍵因子。

圖3 pH對(duì)體胚誘導(dǎo)期糖代謝的影響Fig.3 Effects of pH on carbohydrate metabolism in somatic embryo induction stage

圖4 pH對(duì)體胚誘導(dǎo)期活性氧積累與保護(hù)酶活性的影響Fig.4 Effects of pH on ROS accumulation and activity of protective enzymes in somatic embryo induction stage

成熟胚誘導(dǎo)階段，pH與成熟胚誘導(dǎo)數(shù)量、IAA氧化酶活性、蔗糖含量呈顯著正相關(guān)；成熟胚誘導(dǎo)數(shù)量與IAA氧化酶活性呈極顯著正相關(guān)，與羥自由基含量呈顯著負(fù)相關(guān)；IAA氧化酶活性也與羥自由基含量呈顯著負(fù)相關(guān)；GA4與H2O2含量呈顯著正相關(guān)；羥自由基含量與POD活性呈顯著正相關(guān)。GA4含量、蔗糖含量與MSE數(shù)量的相關(guān)性雖沒(méi)有達(dá)到顯著水平，但相關(guān)系數(shù)較高，推測(cè)GA4和蔗糖對(duì)MSE誘導(dǎo)較為重要。

表1 幼胚誘導(dǎo)階段體胚數(shù)量與生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

表2 成熟胚誘導(dǎo)階段體胚數(shù)量與生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

本研究表明，pH對(duì)百子蓮體胚發(fā)生過(guò)程中激素信號(hào)、糖代謝和氧化脅迫的發(fā)生強(qiáng)度有影響，進(jìn)而影響體胚發(fā)生效果。百子蓮在YSE誘導(dǎo)和MSE誘導(dǎo)階段較佳的pH分別為6.0和6.2。IAA、GA4、蔗糖含量對(duì)體胚誘導(dǎo)、成熟具有重要作用，中等強(qiáng)度的氧化脅迫利于體胚發(fā)生。今后可從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)、分子生物學(xué)等角度進(jìn)一步揭示不同pH環(huán)境下重要生理指標(biāo)對(duì)百子蓮體胚發(fā)生的調(diào)節(jié)機(jī)制。

體胚發(fā)生各階段對(duì)培養(yǎng)基pH需求不同，胞內(nèi)pH變化可顯著影響細(xì)胞分裂、分化與生長(zhǎng)[4]。百子蓮體胚發(fā)生培養(yǎng)基pH一般為5.6～5.8[11]，而本研究表明，百子蓮YSE和MSE誘導(dǎo)階段的較佳pH分別為6.0和6.2。體胚誘導(dǎo)早期，部分植物需要偏酸性的培養(yǎng)環(huán)境，隨體胚發(fā)育成熟，相對(duì)偏堿性培養(yǎng)條件利于胚和幼苗生長(zhǎng)，從離體細(xì)胞到體胚成熟，百子蓮對(duì)培養(yǎng)基pH的需求呈現(xiàn)出逐漸增高的趨勢(shì)，與胡蘿卜(DaucuscarotaL.)[20]、朝鮮山芹(Ostericumkoreanum)[23]離體再生的研究結(jié)果一致。通常培養(yǎng)基pH會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，尤其是以瓊脂作為支撐物[24]，以百子蓮pH 5.8的培養(yǎng)基為例，培養(yǎng)30 d時(shí)培養(yǎng)基pH約為3.8～3.9，偏酸環(huán)境造成的脅迫對(duì)體胚發(fā)育不利，細(xì)微的pH變化對(duì)生長(zhǎng)素等激素發(fā)揮作用也有影響[25]。

生長(zhǎng)素是調(diào)控植物發(fā)育的重要激素[26]，內(nèi)源IAA是唯一具有極性運(yùn)輸特性的植物激素[25]，極性運(yùn)輸?shù)哪芰恳蕾囉诎麅?nèi)外pH梯度產(chǎn)生的質(zhì)子動(dòng)力，環(huán)境pH可影響IAA的極性運(yùn)輸[26-27]，IAA的運(yùn)輸受到自身信號(hào)反饋[27]和pH的共同作用[25]。Dindas等[28]報(bào)道，胞外pH可通過(guò)調(diào)節(jié)擬南芥(Arabidopsisthaliana)根尖細(xì)胞H+和IAA-平衡改變細(xì)胞膜的極性，內(nèi)源IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到pH梯度的顯著影響。培養(yǎng)基pH可通過(guò)調(diào)節(jié)離體細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)素的攝取能力而影響培養(yǎng)效果[29]。本研究中，IAA含量及其代謝受到培養(yǎng)基pH的顯著影響，適宜的pH通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源IAA合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)體胚誘導(dǎo)數(shù)量，在體胚發(fā)生中起到關(guān)鍵調(diào)控作用[5]。PIC是外源生長(zhǎng)素類物質(zhì)，通過(guò)調(diào)控內(nèi)源IAA的合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)體胚發(fā)生進(jìn)程[10，30]，在水仙(Narcissuspseudonarcissus)[31]、郁金香(Tulipagesneriana)[7]和百子蓮[11]中具有高度的特異性。在體胚誘導(dǎo)階段，培養(yǎng)基去除PIC后會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源IAA含量增加，IAA通過(guò)調(diào)控細(xì)胞極性結(jié)構(gòu)影響體胚誘導(dǎo)數(shù)量[30]。

GA在植物發(fā)育中具有重要功能，不具備極性運(yùn)輸特性，GA和IAA信號(hào)存在互作，GA信號(hào)可影響IAA合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[32]。在小毛彩雀(Chaenorrhinumminus)種子萌發(fā)試驗(yàn)中，pH能夠影響GAs生物合成和功能發(fā)揮[33]。GA對(duì)體胚發(fā)生的效果因物種而異，多數(shù)研究表明，GA對(duì)體胚誘導(dǎo)不利[14-15]，例如GA3不利于紫花苜蓿(Medicagosativa)[34]、天竺葵(Pelargonium×hortorumBailey)體胚發(fā)生[14]，而GA1、GA4利于胡蘿卜體胚同步化[15]。GA1和GA4是植物主要活性內(nèi)源GAs，百子蓮中主要為GA4，在花芽、株高發(fā)育中均具有重要功能[32，35]，相對(duì)于GA1，GA4含量與百子蓮體胚發(fā)生效果一致，具有正向調(diào)節(jié)功能。在體胚發(fā)育后期，GA4可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)促進(jìn)體胚成熟與幼苗形態(tài)建成[15]，本研究中YSE誘導(dǎo)和MSE誘導(dǎo)階段GA4與體胚數(shù)量均具有較強(qiáng)的相關(guān)性。

碳源可維持細(xì)胞滲透壓、提供細(xì)胞骨架、參與能量代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)維持細(xì)胞膜完整性，是影響植物體胚發(fā)生的重要因素[17]，其種類和水平在體胚的誘導(dǎo)和發(fā)育成苗過(guò)程中有重要作用[3，17]。細(xì)胞內(nèi)源糖代謝不僅依賴外源供給，還受胞內(nèi)糖組分利用規(guī)律的影響[17，36]，而pH顯著影響植物糖代謝[37]，pH可通過(guò)影響真核細(xì)胞中磷酸化作用，改變淀粉等糖類代謝、蛋白質(zhì)積累，從而影響體胚發(fā)生過(guò)程[5，20，38]。淀粉積累通?？勺鳛轶w胚發(fā)生中的重要事件[36，39]，IAA等激素在蔗糖和淀粉的轉(zhuǎn)換中起重要調(diào)控作用，IAA、GA對(duì)淀粉的積累和蔗糖代謝具有顯著調(diào)節(jié)作用[2，40-41]。在甘蔗(Saccharumspp.)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、土豆蔻(Kelussiaodoratissima)、橡膠(Heveabrasiliensis)體胚誘導(dǎo)過(guò)程中，由于胞內(nèi)糖代謝的變化，碳源的種類和濃度對(duì)體胚發(fā)生效果均有顯著影響[3，36，42-43]。本研究中，體胚發(fā)育階段蔗糖含量與MSE數(shù)量相關(guān)性較高，而淀粉、麥芽糖含量較高時(shí)，百子蓮YSE誘導(dǎo)數(shù)量也達(dá)到較高水平。

脅迫信號(hào)和激素、糖代謝之間存在復(fù)雜的平衡關(guān)系[18]。離體培養(yǎng)中適宜的pH導(dǎo)致適度脅迫的發(fā)生，有利于IAA極性運(yùn)輸和胞內(nèi)pH梯度建立，最終建立細(xì)胞全能性[5，17]，而生長(zhǎng)素對(duì)非生物脅迫具有重要的調(diào)節(jié)效果[27]。培養(yǎng)基蔗糖滲透壓、pH和脅迫條件對(duì)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程具有重要貢獻(xiàn)[4，17]。最近研究證實(shí)，ROS可通過(guò)活性羰基(reactive carbonyl species，RCS)影響生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控植物發(fā)育，與生長(zhǎng)素具有協(xié)同作用[44]。高濃度的H2O2會(huì)誘發(fā)逆境響應(yīng)激素的積累，比如ABA、乙烯等，對(duì)體胚發(fā)育成熟具有促進(jìn)作用[18]。體胚發(fā)生過(guò)程中，POD活性顯著增加，參與細(xì)胞防御反應(yīng)，細(xì)胞全能性一旦建立，脅迫程度也相應(yīng)減弱，細(xì)胞膜完整性得以有效保持，利于提高體胚發(fā)生質(zhì)量[36]。本研究中YSE和MSE階段對(duì)逆境響應(yīng)和對(duì)pH變化的耐受能力存在差異，H2O2含量、POD活性與體胚發(fā)生效果相關(guān)性較強(qiáng)，表明適宜的pH能有效調(diào)節(jié)脅迫強(qiáng)度與保護(hù)酶活性的平衡，利于植物細(xì)胞代謝與器官發(fā)育[45]。