改善擬人參皂苷元DQ水溶性的4種羧酸衍生物的合成研究

高連叢，朱雙含，張馨妍，韓柳*

（1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)院，吉林；2. 海南師范大學(xué) 物理與電子工程學(xué)院，海南 海口）

0 引言

人參為百草之王，在我國有著重要的藥用價值和文化價值，人參皂苷是人參的主要化學(xué)成分，具有抗腫瘤，改善心肌缺血，免疫調(diào)節(jié)，降血糖，抗休克，保肝，鎮(zhèn)靜安神等作用[1-2]，按皂苷元結(jié)構(gòu)不同主要分為達(dá)瑪烷型（Dammarane）、齊墩果酸型（Oleanane）、奧克梯隆型（Ocotillol）這三種類型[3]。擬人參皂苷元DQ是一種新型奧克梯隆型人參皂苷元，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1，近年來，人們對其研究較多，楊潔[4]利用了熒光光譜法研究擬人參皂苷元DQ與牛血清蛋白的相互作用，采取取代實驗確定在BSA上的結(jié)合位點。于晨[5]研究了在急性心急缺血損傷方面擬人參皂苷元的保護(hù)作用，以NBT標(biāo)本染色法測量心肌梗死范圍，結(jié)果表明擬人參皂苷元可以使急性心肌缺血大鼠血清LDH活性明顯降低。韋春晟[6]等利用大鼠全胚胎培養(yǎng)方法判斷擬人參皂苷元DQ對大鼠胚胎是否具有胚胎毒性作用，對其安全性做出初步評價。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)由于擬人參皂苷元DQ結(jié)構(gòu)中3個羥基基團(tuán)的存在，使得會產(chǎn)生分子間氫鍵，使擬人參皂苷元DQ的分子結(jié)合的非常緊密，水溶性較低，無法制成注射劑應(yīng)用在臨床上，導(dǎo)致用藥不便，且由于水溶性差，導(dǎo)致生物利用度較低，所以針對水溶性的問題展開研究。目前國內(nèi)外在對增加水溶性的結(jié)構(gòu)修飾研究較少，本實驗旨在通過引入一些親水性基團(tuán)（如引入羧基）進(jìn)行修飾，改善皂苷水溶性，使擬人參皂苷元DQ更好的溶在水中，提高制劑的開發(fā)，進(jìn)而改善擬人參皂苷元DQ在臨床上的用藥方法，使用藥更加便捷，用藥人群更加廣泛，為提高人參皂苷的產(chǎn)業(yè)競爭力奠定基礎(chǔ)。

圖1 擬人參皂苷元DQ的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海圣科儀器設(shè)備有限公司），磁力攪拌器（上海力辰科技有限公司），恒溫水浴鍋（東京立基凱有限公司），調(diào)溫?zé)犸L(fēng)槍（昆山正富機(jī)械工業(yè)有限公司），電子天平（電子天平），丁二酸酐（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20180129），鄰苯二甲酸酐（天津市大茂化學(xué)試劑廠，85-44-9），順丁烯二酸酐（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，9011-13-6），戊二酸酐（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20180212），石油醚60-90（遼寧泉瑞試劑有限公司，20181018），乙酸乙酯（乙酸乙酯，141-78-6），二氯甲烷（遼寧泉瑞試劑有限公司，20180625），三乙胺（天津市大茂化學(xué)試劑廠，121-44-8），無水硫酸鈉（遼寧泉瑞試劑有限公司，20180125），甲醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠，67-56-1），正丁醇（遼寧泉瑞試劑有限公司，20180201），活性氧化鋁（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20161027），二水甲酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20180112），乙醇95%（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，083010），娃哈哈純凈水（吉林娃哈哈食品有限公司）。

2 合成方法

2.1 擬人參皂苷元DQ丁二酸衍生物的合成

稱取0.5g擬人參皂苷元DQ（1當(dāng)量，1.050mmol）溶于預(yù)先干燥的10.33mL 1，2-二氯甲烷中，然后在室溫下加入1.033mL三乙胺和0.6415g丁二酸酐（6當(dāng)量，6.3mmol）。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌96h，同時利用TLC實時監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。待反應(yīng)結(jié)束后，取30mL純凈水分三次洗滌混合物，合并有機(jī)層，將有機(jī)層在硫酸鈉上干燥，并在真空中濃縮，得到粗產(chǎn)品Ⅰ。

2.2 擬人參皂苷元DQ鄰苯二甲酸衍生物的合成

稱取0.5g擬人參皂苷元DQ（1當(dāng)量，1.050mmol）溶于預(yù)先干燥的10.33mL1，2-二氯甲烷中，然后在室溫下加入1.033mL三乙胺和0.933g鄰苯二甲酸酐（6當(dāng)量，6.3mmol）。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌72h，同時利用TLC實時監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。待反應(yīng)結(jié)束后，取30mL純凈水分三次洗滌混合物，合并有機(jī)層，將有機(jī)層在硫酸鈉上干燥，并在真空中濃縮，得到粗產(chǎn)品Ⅱ。

2.3 擬人參皂苷元DQ順丁烯二酸衍生物的合成

稱取0.5g擬人參皂苷元DQ（1當(dāng)量，1.050mmol）溶于預(yù)先干燥的10.33mL1，2-二氯甲烷中，然后在室溫下加入1.033mL三乙胺和0.618g順丁烯二酸酐（6當(dāng)量，6.3mmol）。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌72h，同時利用TLC實時監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。待反應(yīng)結(jié)束后，取30mL純凈水分三次洗滌混合物，合并有機(jī)層，將有機(jī)層在硫酸鈉上干燥，并在真空中濃縮，得到粗產(chǎn)品Ⅲ。

2.4 擬人參皂苷元DQ戊二酸衍生物的合成

稱取0.5g擬人參皂苷元DQ（1當(dāng)量，1.050mmol）溶于預(yù)先干燥的10.33mL1，2-二氯甲烷中，然后在室溫下加入1.033mL三乙胺和0.7188g戊二酸酐（6當(dāng)量，6.3mmol）。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌96h，同時利用TLC實時監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。待反應(yīng)結(jié)束后，取30mL純凈水分三次洗滌混合物，合并有機(jī)層，將有機(jī)層在硫酸鈉上干燥，并在真空中濃縮，得到粗產(chǎn)品Ⅳ。

2.5 由羧酸衍生物制備鈉鹽的方法

取化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ（1.2當(dāng)量）分別溶解在預(yù)先干燥的1M甲醇中，然后分別在室溫下加入甲酸鈉（1當(dāng)量）。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌5小時，同時利用TLC實時監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)結(jié)束后將混合物在真空中濃縮得到粗產(chǎn)品1-4。

3 分離與純化

3.1 化合物Ⅰ的分離純化

將粗品A以石油醚：乙酸乙酯（1：1.5）為洗脫劑進(jìn)行柱層析分離，得到純品Ⅰ 243mg。

3.2 化合物Ⅱ的分離純化

將粗品Ⅱ以石油醚：乙酸乙酯（1:1.5）為洗脫劑進(jìn)行柱層析分離，得到純品Ⅱ 261mg。

3.3 化合物Ⅲ的分離純化

將粗品Ⅲ以二氯甲烷：甲醇（20:1）為洗脫劑進(jìn)行柱層析分離，得到純品Ⅲ 233mg。

3.4 化合物Ⅳ的分離純化

將粗品Ⅳ先分別以石油醚：乙酸乙酯（7:1）、石油醚：乙酸乙酯（5:1）、石油醚：乙酸乙酯（3:1）、石油醚：乙酸乙酯（2.5:1）、石油醚：乙酸乙酯（1.5:1）為洗脫劑進(jìn)行柱層析分離，得到純品Ⅳ 215mg。

3.5 新鈉鹽的分離

將粗產(chǎn)品1-4采用硅膠柱層析法，從純乙酸乙酯到純甲醇作洗脫劑對粗產(chǎn)品進(jìn)行色譜分析，得到純產(chǎn)物1a-4a。

4 結(jié)構(gòu)鑒定

4.1 化合物Ⅰ的結(jié)構(gòu)鑒定

化 合 物Ⅰ正 離 子 ESI-MS（m/z）：577.41[M＋H]＋，推斷該化合物的相對分子質(zhì)量為576.40，結(jié)合13C-NMR和1H-NMR圖，確定化合物Ⅰ的分子式為C34H56O7。結(jié)合化合物Ⅰ的13C化學(xué)位移與Chemdraw模擬，確定某些基團(tuán)位置，以此推測化新化合物的結(jié)構(gòu)。13C NMR(126 MHz, Pyr) δ175.00(C-34),δ172.65(C-31),δ86.78(C-24),δ85.72(C-20),δ80.84(C-3),δ71.10(C-12),δ70.38(C-25),δ56.22(C-5),δ52.22(C-14),δ50.63(C-9),δ49.84(C-13),δ48.44(C-17),δ40.03(C-8),δ38.71(C-4),δ38.24(C-1),δ37.21(C-10),δ35.03(C-7),δ32.87(C-15),δ32.46(C-32),δ31.76(C-33),δ30.41(C-11),δ30.07(C-22),δ28.84(C-27),δ28.13(C-23),δ27.78(C-28),δ27.33(C-2),δ27.02(C-26),δ25.58(C-21),δ24.06(C-16),δ18.48(C-6),δ18.38(C-30),δ16.81(C-19),δ16.52(C-29),δ15.57(C-18)?；衔铫竦?3C NMR中170-180位移處均有兩個峰，按照各類化合物13C化學(xué)位移可知此處是羧基與酯鍵的位置，可以判斷在擬人參皂苷元DQ上加入了丁二酸酐，通過與擬人參皂苷元DQ的譜圖作對比，確定化合物Ⅰ的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2-A。

4.2 化合物Ⅱ的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅱ正離子 ESI-MS（m/z）：625.41[M＋H]＋，推斷該化合物的相對分子質(zhì)量為624.40，結(jié)合13C-NMR和1H-NMR圖，確定化合物Ⅱ的分子式為C38H56O7。結(jié)合化合物Ⅱ的13C化學(xué)位移與Chemdraw模擬，確定某些基團(tuán)位置，以此推測化新化合物的結(jié)構(gòu)。13C NMR (126 MHz, Pyr)δ170.25(C-38),δ168.61(C-31),δ134.55(C-34),δ134.38(C-35),δ131.07(C-32),δ131.02(C-37)，δ129.67 (C-36),δ129.05 (C-33),δ 86.78 (C-24), δ85.72 (C-20), δ82.39 (C-3), δ71.10 (C-12), δ70.38 (C-25), δ56.35 (C-5),δ52.21 (C-14), δ50.64 (C-9), δ49.83 (C-13), δ48.44 (C-17), δ40.04(C-8), δ38.78 (C-4), δ38.42 (C-1), δ37.23 (C-10), δ35.03(C-7), δ32.87 (C-15), δ32.46 (C-11), δ31.74 (C-22),δ28.84 (C-27), δ28.27 (C-23), δ27.78 (C-28), δ27.33 (C-2),δ27.02(C-26), δ25.57(C-21), δ23.68(C-16), δ18.47(C-6)，δ18.38(C-30), δ16.89 (C-19),δ16.45 (C-29), δ15.55 (C-18)?；衔铫虻?3C NMR中170-180位移處均有兩個峰，按照各類化合物13C化學(xué)位移可知此處是羧基與酯鍵的位置，可以判斷在擬人參皂苷元DQ上加入了鄰苯二甲酸酐，通過與擬人參皂苷元DQ的譜圖作對比，確定化合物Ⅱ的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2-B。

4.3 化合物Ⅲ的結(jié)構(gòu)鑒定

化 合 物Ⅲ正 離 子 ESI-MS（m/z）：575.39[M＋H]＋，推斷該化合物的相對分子質(zhì)量為574.39，結(jié)合13C-NMR和1H-NMR圖，確定化合物Ⅲ的分子式為C34H54O7。結(jié)合化合物Ⅲ的13C化學(xué)位移與Chemdraw模擬，確定某些基團(tuán)位置，以此推測化新化合物的結(jié)構(gòu)。13C NMR (126 MHz, Pyr)δ168.09(C-34),δ165.79(C-31),δ132.20(C-32),δ128.66(C-33),δ86.45(C-24),δ85.40(C-20),δ81.55(C-3),δ70.77(C-12),δ70.05(C-25),δ55.96(C-5),δ51.89(C-14),δ50.30(C-9),δ49.51(C-13),δ48.12(C-17),δ39.71(C-8),δ38.41(C-4),δ37.97(C-1),δ36.87(C-10),δ34.69(C-7),δ32.54(C-15),δ32.13(C-11),δ31.44(C-22),δ28.51(C-27),δ27.76(C-23),δ27.46(C-28),δ27.01(C-2),δ26.70(C-26),δ25.26(C-21),δ23.46(C-16),δ18.14(C-6),δ18.05(C-30),δ16.49(C-19),δ16.15(C-29),δ15.23(C-18)?；衔铫蟮?3C NMR中170-180位移處均有兩個峰，按照各類化合物13C化學(xué)位移可知此處是羧基與酯鍵的位置，可以判斷在擬人參皂苷元DQ上加入了順丁烯二酸酐，通過與擬人參皂苷元DQ的譜圖作對比，確定化合物Ⅲ的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2-C。

4.4 化合物Ⅳ的結(jié)構(gòu)鑒定

化 合 物Ⅳ正 離 子 ESI-MS（m/z）：591.42[M＋H]＋，推斷該化合物的相對分子質(zhì)量為590.42，結(jié)合13C-NMR和1H-NMR圖，確定化合物Ⅳ的分子式為C35H58O7。結(jié)合化合物Ⅳ的13C化學(xué)位移與Chemdraw模擬，確定某些基團(tuán)位置，以此推測化新化合物的結(jié)構(gòu)。13C NMR (126 MHz,Pyr) δ175.52(C-35),δ173.01(C-31),δ86.78(C-24),δ85.72(C-20),δ80.61(C-3),δ71.11(C-12), δ70.38(C-25),δ56.17(C-5),δ52.22(C-14),δ50.65(C-9),δ49.84(C-13),δ48.45(C-17),δ40.04(C-8),δ38.72(C-4),δ38.17(C-1),δ37.22(C-10),δ35.03(C-34),δ34.24(C-32),δ34.06(C-7),δ32.87(C-15),δ32.47(C-11),δ31.76(C-22),δ28.84(C-27),δ28.15(C-23),δ27.78(C-28),δ27.32(C-2),δ27.03(C-26),δ25.58(C-21),δ24.08(C-16),δ21.33(C-33),δ18.50(C-6),δ18.39(C-30),δ16.80(C-19),δ16.54(C-29),δ15.57(C-18)。化合物Ⅳ的13C NMR中170-180位移處均有兩個峰，按照各類化合物13C化學(xué)位移可知此處是羧基與酯鍵的位置，可以判斷在擬人參皂苷元DQ上加入了戊二酸酐，通過與擬人參皂苷元DQ的譜圖作對比，確定化合物Ⅳ的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2-D。

圖2 擬人參皂苷元DQ 4種羧酸衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

5 溶解度實驗

根據(jù)2015版藥典規(guī)定，進(jìn)行溶解度實驗，稱取研成細(xì)粉的供試品或量取液體供試品，于25°C ±2°C-定容量的溶劑中，每隔5分鐘強(qiáng)力振搖30秒鐘；觀察30分鐘內(nèi)的溶解情況，如無目視可見的溶質(zhì)顆粒或液滴時，即視為完全溶解。

經(jīng)過溶解度檢測，五種化合物溶解度實驗結(jié)果見表1。

表1 五種化合物的溶解情況

6 討論與結(jié)論

水溶性低不僅會使擬人參皂苷元DQ難以制成注射劑，在藥物進(jìn)入體內(nèi)后的分布，代謝等藥代動力學(xué)方面都會收到影響，水溶性很差也會使擬人參皂苷元DQ在體內(nèi)的生物利用度較低，使擬人參皂苷元DQ雖然有很好的要藥理活性，但卻無法在臨床上完全發(fā)揮出它的價值。本實驗利用改變分子上的羥基，使羥基與酸反應(yīng)生成酯鍵，并且四種酸都是環(huán)狀酸，在反應(yīng)中均會發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，使擬人參皂苷元DQ上不僅能夠加入酯鍵，還能加入羧酸。羧酸也會使化合物的水溶性提高，并且羧酸與甲酸鈉反應(yīng)可以成羧酸鹽，能夠更好的改善擬人參皂苷元DQ的水溶性，并且與加入助溶劑相比，這種方法更加安全，可靠。通過本文的相關(guān)研究，為進(jìn)一步深入研究擬人參皂苷元DQ的藥理活性和制劑開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，也為改變?nèi)藚⒃碥账苄缘姆椒ㄌ峁┝诵滤悸贰?/p>