夜香樹花提取物對宮頸癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

盧紅梅，覃清霞，戴傳勇，李泰球，何歡

（廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧）

0 引言

夜香樹（Cestrum nocturnum Linn，簡寫為CN），又名夜來香，為茄科夜香樹屬植物，廣泛種植于熱帶、亞熱帶地區(qū)，藥物資源豐富。流行病學(xué)研究調(diào)查顯示，宮頸癌是婦女最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，給患者的身心健康帶來嚴(yán)重影響。本研究擬探討夜香樹花提取物在體外對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討其對Hela細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞株

Hela細(xì)胞從上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫購買。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國產(chǎn)，型號381）； 倒置顯微鏡（日本產(chǎn)，型號CK40）；倒置熒光顯微鏡（日本產(chǎn)，型號TE2000-U）；酶標(biāo)儀（奧地利產(chǎn)，型號Sunrise）；96孔板（德國產(chǎn)，型號3679）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠，型號DYY-6B）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠，型號RE-52AA）；流式細(xì)胞儀（美國產(chǎn)，型號Epricsxl）。

1.3 受試藥品與試劑

夜香樹花提取物；MTT（德國Sigma公司產(chǎn)）；PBS（杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)）；Trypsin（天津市景洋生物制品有限責(zé)任公司產(chǎn)）；DMSO（上海潤捷化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)）； RNase酶（sigma分裝）；碘化丙啶（PI，sigma分裝）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司產(chǎn)）。

2 實驗方法

2.1 受試藥品的制備和配制

夜香樹花（CN花）曬干，用95%乙醇浸泡3天，水浴回流提取2次，濾液進(jìn)行常壓蒸餾，濃縮得浸膏。浸膏用RPMI-1640培養(yǎng)基溶解，配成五個不同的濃度，分別是5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL；空白對照為等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基。

2.2 體外MTT法及細(xì)胞生長觀察 [2,3]

Hela細(xì)胞用0.5ml 、0.25%的胰蛋白酶消化，用含10%牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)配成濃度為5×103個/ mL，接種于96孔板，給藥組為190 μL細(xì)胞懸浮液和10μL藥液，即200μL/孔，空白組為190 μL細(xì)胞懸浮液和10μL生理鹽水，受試藥品每種濃度設(shè)3個平行孔，37℃、10% CO2培養(yǎng)3d。3d天后，用倒置顯微鏡（10×10）觀察細(xì)胞的生長情況及形態(tài)學(xué)變化。后棄上清液，每孔加入0.2mg/mL、200μL MTT溶液，震蕩均勻后繼續(xù)培養(yǎng)4h。再棄上清液，加入200μL DMSO溶液/孔，振蕩和溶解MTT甲臜沉淀，用酶標(biāo)儀（波長為550nm、參比波長為450nm）測定其OD值。抑瘤率%=（1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

2.3 體外誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的實驗研究

2.3.1 流式細(xì)胞術(shù)法檢測Hela的細(xì)胞周期及凋亡情況[4,5]

Hela細(xì)胞用含10%牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成1.5×105個/mL的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)在放有載玻片的培養(yǎng)瓶中，每瓶6mL，并加入濃度為20ug/mL的受試藥液?？瞻讓φ战M為等體積的RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃、10% CO2培養(yǎng)3d，收集培養(yǎng)瓶中的Hela細(xì)胞，用PBS洗滌2次，4℃、70%乙醇固定。第2d，離心（1500r/min、4℃）除去固定液，加0.5ml PBS重懸細(xì)胞，加（6μl、10mg/mL）RNase酶/管，37℃水浴20min，200目篩過濾除去粘連細(xì)胞，加50μg/ml PI染液，室溫染色30min，上機。流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期各時期細(xì)胞的比例和細(xì)胞凋亡。

2.3.2 形態(tài)學(xué)觀察：瑞氏-吉姆薩染色法[4]

步驟2.3.1中，Hela細(xì)胞培養(yǎng)3d后，取出載玻片用甲醇固定10min，先用瑞氏染液染色5min，再用吉姆薩溶液與Sorensen磷酸緩沖液以1:9配成混合液（現(xiàn)配現(xiàn)用），染色10min。用水沖洗，晾干，鏡檢（10×40）。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 實驗結(jié)果

3.1 體外對Hela細(xì)胞增殖的影響

CN花提取物對人宮頸癌細(xì)胞Hela的增殖抑制作用明顯，且與劑量相關(guān)，五個劑量組對細(xì)胞的增殖抑制率分別為8.96% 、16.32% 、41.07% 、68. 74% 、70. 11%，說明在一定濃度內(nèi)，藥物劑量對Hela細(xì)胞增殖抑制作用成正相關(guān)。見表1。

3.2 Hela細(xì)胞的生長情況及形態(tài)學(xué)變化

①空白組：細(xì)胞成集落、個體較大、飽滿、折光性好、形態(tài)均一、呈多邊形；②5μg/mL CN花提取物組：細(xì)胞集落漸變小、折光性減弱、形態(tài)稍變圓形；③10μg/mL CN花提取物組：細(xì)胞集落漸變小、折光性減弱、形態(tài)稍變圓形；④20μg/mL CN花提取物組：細(xì)胞集落變小、散在、大小不一、折光性弱、變圓形；⑤40μg/mL CN花提取物組：細(xì)胞散在、部分胞體變小皺縮、且輪廓消失；⑥80μg/mL CN花提取物組：胞體皺縮、壞死。見圖1。

表1 CN花提取物對宮頸癌細(xì)胞Hela增殖的抑制作用（±s，n=3）

表1 CN花提取物對宮頸癌細(xì)胞Hela增殖的抑制作用（±s，n=3）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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圖1 受試藥物作用于Hela細(xì)胞3d后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化及生長情況

3.3 體外誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的研究

3.3.1 誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

①空白對照組：細(xì)胞膜完整、胞質(zhì)透明、核大且圓；②20ug/mL CN花提取物組：

細(xì)胞變小變圓、細(xì)胞膜不夠完整，核質(zhì)較皺縮。見圖2。

3.3.2 流式細(xì)胞術(shù)法檢測Hela細(xì)胞周期變化

流式細(xì)胞術(shù)法檢測結(jié)果可知，CN花提取物（20ug/mL）在體外對Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期有較明顯作用，G0/G1期細(xì)胞從46.8%下降到32.4%，S期細(xì)胞從38.7%上升到51.1%，G2/M期細(xì)胞變化不明顯，其凋亡率為31.2%，較高，與空白組比較有顯著性差異。見表2。

4 討論

宮頸癌是目前臨床嚴(yán)重影響婦女健康的最常見惡性腫瘤之一，調(diào)查研究顯示，我國每年有大約20萬婦女死于宮頸癌，其發(fā)生率僅次于乳腺癌，位居婦女腫瘤疾患的第2位，且有年輕化的趨勢[6,7]。由于宮頸癌惡性程度高，對患者危害巨大，因此探索宮頸癌的防治方案成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重要課題。

表2 流式細(xì)胞術(shù)法檢測CN花提取物對Hela的調(diào)亡率和細(xì)胞周期

體外篩選抗腫瘤藥物具有用藥少、周期短、費用少等優(yōu)勢，且其篩選結(jié)果與體內(nèi)實驗的相關(guān)性好，因此已被一些研究機構(gòu)作為常規(guī)的抗腫瘤藥物初篩手段[8]。本實驗通過MTT法證實CN花提取物在體外對人宮頸癌細(xì)胞Hela增殖的抑制作用明顯，且抑制作用與劑量相關(guān)。

圖2 Hela細(xì)胞瑞氏-吉姆薩染色后的形態(tài)學(xué)變化

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是藥物抗腫瘤研究的一個重要領(lǐng)域，而觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化是測定細(xì)胞凋亡的一種途徑。本實驗通過瑞氏-吉姆薩染色法對Hela細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，觀察到CN花提取物（20μg/mL）與空白組比較，細(xì)胞變小變圓，細(xì)胞膜不夠完整，核質(zhì)較皺縮。流式細(xì)胞術(shù)法檢測結(jié)果進(jìn)一步表明，CN花提取物（20ug/mL）在體外對Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期有較明顯作用，其凋亡率為31.2%，較高，可能是通過阻斷細(xì)胞由S期進(jìn)入G2/M期而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實驗為夜香樹花今后的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供理論依據(jù)。