奧貝膽酸對(duì)COPD模型小鼠IL-1β表達(dá)的影響

李冬，趙磊

（安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥）

0 引言

慢性阻塞性肺疾病 （Chronic obstructive pulmonary disease, COPD）以持續(xù)存在的氣流受限為特征。氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，與氣道和肺有害顆?；驓怏w所致慢性炎性反應(yīng)的增強(qiáng)相關(guān)。急性加重和合并癥影響個(gè)體患者整體疾病的嚴(yán)重程度。[1-2]IL-1β是IL-1的主要分泌形式，小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是IL-1β的主要來(lái)源，生理?xiàng)l件下其含量極低，但在COPD患者中，水平會(huì)增高[3]。錢文君等[4]的研究表明COPD患者的血清IL-1β水平明顯高于對(duì)照組，其中急性發(fā)作期患者的血清濃度增高比穩(wěn)定期患者更為明顯，提示IL-1β參與了COPD的發(fā)生和發(fā)展過程，并對(duì)急性加重有提示意義。Selvarajah等[5]的研究也表明COPD患者諸多血清細(xì)胞因子中，IL-1β與TNFα水平與對(duì)照組之間相比，是上升最為明顯的指標(biāo)，IL-1β的濃度與COPD的分級(jí)（GOLD分級(jí)1～3級(jí)）呈遞增關(guān)系。Katherine J Baines等[6]的研究提示慢性阻塞性肺病患者的呼吸道上皮細(xì)胞中，IL-1β受體的表達(dá)明顯增高，并與急性發(fā)作有相關(guān)性。Yuan-Huachen等[7]研究顯示奧貝膽酸可以顯著減弱IL-1β的產(chǎn)生。那么，減少IL-1β的分泌可能為治療COPD提供新的途徑。本實(shí)驗(yàn)通過奧貝膽酸對(duì)COPD模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)模型小鼠血漿IL-1β水平，探討奧貝膽酸對(duì)COPD是否存在保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物

48只C57BL/6J雄性小鼠（6-8周，19-27g）北京維通利華公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0001。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組（Control），單純奧貝膽酸組（OCA），模型組對(duì)照組（COPD）及奧貝膽酸干預(yù)組（OCA+COPD）。

1.2 試劑

紅三環(huán)牌香煙（安徽中煙工業(yè)公司生產(chǎn)，烤煙型，每支含焦油量12mg、煙氣煙堿量0.8mg、煙氣一氧化碳量15mg），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，美國(guó)Sigma公司）奧貝膽酸（Obeticholic，OCA, 美 國(guó)Sigma公 司），IL-1β ELISA試劑盒）。

1.3 儀器

電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；自動(dòng)控溫離心機(jī)（日本HITACHI公司）。

1.4 方法

1.4.1 奧貝膽酸的配制

奧貝膽酸采購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,按照5mg/kg給藥。

1.4.2 模型建立及藥物干預(yù)

采用鼻腔滴入LPS加熏香煙的方法建立COPD小鼠 動(dòng) 物 模 型[8]。COPD組、OCA+COPD組 分 別 于 第1、29和57天 經(jīng) 鼻 腔 滴 入LPS（30μg/6μL），第2-84天（除第29、57天）采取熏香煙法，將小鼠放入自制的玻璃熏箱（70cm×50cm×30cm），10支/次，30min/次，5d/周，共12周；Control組分別于第1、29和57天經(jīng)鼻腔滴入相同量的0.9%氯化鈉溶液，其余時(shí)間正常飼養(yǎng)。OCA+COPD組和OCA于第13周開始每只小鼠予奧貝膽酸5mg/kg/d灌胃，Control組和COPD組以同樣方法予0.9%氯化鈉溶液灌胃，共4周。

1.4.3 肺組織形態(tài)學(xué)標(biāo)本

采集及處理 腹腔麻醉小鼠后，開胸暴露胸腔：取右側(cè)肺葉固定于10%多聚甲醛溶液24h，常規(guī)脫水石蠟包埋，切片行HE染色，光鏡下觀察。

1.4.4 IL-1β檢測(cè)

16周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱體質(zhì)量，1%戊巴比妥鈉（按0.05mL/10g）腹腔麻醉小鼠，將各組小鼠腹主動(dòng)脈取血法取血1mL，室溫下放置2h后，2 000r/min離心20min，取血清，-20℃保存?zhèn)溆谩０碋LISA試劑盒操作步驟說(shuō)明檢測(cè)小鼠血清中IL-1β的含量。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

對(duì)照組小鼠無(wú)死亡，毛發(fā)光澤，活潑好動(dòng)，反應(yīng)敏捷；COPD組小鼠死亡4只，毛發(fā)無(wú)光澤，精神萎靡，熏煙時(shí)倦怠蜷縮，呼吸急促，偶有張口呼吸，進(jìn)食進(jìn)水量減少。OCA組小鼠無(wú)死亡，皮毛柔順，動(dòng)作靈活，營(yíng)養(yǎng)良好。OCA+COPD組死亡2只，前12周一般情況同COPD組，補(bǔ)充OCA 4周后與COPD組相比毛發(fā)較有光澤，呼吸較均勻，氣促不明顯。各組存活率見圖1。

圖1 不同組別存活率與死亡率的比較

2.2 肺組織病理觀察

對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，大小均勻。管壁厚度均勻。管腔未見炎癥，（圖2A/3A）；OCA組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)于對(duì)照組小鼠相似（圖/3B）。COPD組小數(shù)部分肺泡壁塌陷，肺泡不規(guī)則擴(kuò)大并相互融合，代償性肺氣腫形成，血管及支氣管周圍可見不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管壁增厚，管腔變窄（圖2C/3C），符合COPD病理改變；OCA+COPD組小鼠肺組織仍存在肺大皰形成，但肺泡面積較小，肺組織及氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)減少（圖2D/3D），奧貝膽酸使COPD模型小鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變有所改善（圖2、圖3）。

圖2 小鼠肺組織HE染色（×100）

圖3 小鼠肺組織HE染色（×200）

2.3 不同組別每高倍鏡下炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)

COPD組細(xì)胞計(jì)數(shù)總數(shù)與空白組相比，細(xì)胞計(jì)數(shù)總數(shù)明顯增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。OCA+COPD組與COPD相比，細(xì)胞計(jì)數(shù)總數(shù)明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。OCA組與對(duì)照組相比，細(xì)胞計(jì)數(shù)總數(shù)稍有增多，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見圖4。

2.4 不同組別血清IL-1β含量

COPD組 中 IL-1β濃度與對(duì)照組相比，IL-1β濃度增高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。COPD+OCA組與COPD組相比，IL-1β濃度降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。OCA組與對(duì)照組相比，IL-1β濃度有所升高，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

圖4 不同組別每高倍鏡視野炎細(xì)胞計(jì)數(shù)

表1

圖5

3 討論

IL-1β能激活巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，在肺內(nèi)可引起以巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的肺部炎癥。本研究結(jié)果顯示各組的血清IL-1β濃度水平在各組間比較有顯著差異，提示IL-1β可能是參與COPD 氣道炎癥的重要細(xì)胞因子，高水平的IL-1β可能是導(dǎo)致肺部慢性炎癥的原因之一。當(dāng)COPD患者的呼吸道受到細(xì)菌、病毒等刺激時(shí)，它們所含某些抗原成分可以激活的炎癥細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β 等炎性因子，過量產(chǎn)生的IL-1β在肺內(nèi)可引起肺部炎癥，從而加重肺功能的損傷。本研究結(jié)果顯示，可作為 COPD 患者嚴(yán)重程度的炎性標(biāo)志物。因此，抑制 IL-1β的生成，可以阻斷IL-1β病理性作用，從而減輕COPD患者的氣道炎癥反應(yīng)。在 COPD 患者的治療方面，可以選取IL-1β的拮抗劑，可能是一種治療選擇，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可為研制治療COPD 的藥物，提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。