基于高通量測(cè)序的貯藏白牡丹表面細(xì)菌多樣性分析

陳佳佳，胡雲(yún)飛，沈詩(shī)鈺，王志華，周喆，唐琴，孫威江1,*

基于高通量測(cè)序的貯藏白牡丹表面細(xì)菌多樣性分析

陳佳佳1,2,4，胡雲(yún)飛2,3,4，沈詩(shī)鈺1,2,4，王志華1,2,4，周喆1,2,4，唐琴1,2,4，孫威江1,2,3,4*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 352000；2. 福建省行業(yè)技術(shù)開(kāi)發(fā)基地，福建 福州 350002；3. 福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362400；4. 福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002

為分析貯藏白牡丹細(xì)菌多樣性，利用高通量測(cè)序?qū)?1個(gè)不同貯藏年份白牡丹細(xì)菌進(jìn)行16?S rDNA檢測(cè)。結(jié)果表明，貯藏茶樣的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)（）、擬桿菌門(mén)（）、厚壁菌門(mén)（等，優(yōu)勢(shì)菌綱為-變形菌綱（）、-變形菌綱（）、鞘脂桿菌綱（）等，優(yōu)勢(shì)菌屬為鞘氨醇單胞菌屬（）、甲基桿菌屬（）、土地桿菌屬（）等。不同貯藏年份白牡丹細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)相似，豐度存在差異；貯藏年份對(duì)白牡丹表面細(xì)菌組成未有顯著影響，而貯藏環(huán)境影響細(xì)菌多樣性。

高通量測(cè)序；白牡丹；細(xì)菌；多樣性

白茶是一種輕發(fā)酵茶類(lèi)，制作簡(jiǎn)單，只有萎凋及干燥工序[1]。貯藏白茶是在適當(dāng)條件下倉(cāng)儲(chǔ)若干時(shí)間的陳年白茶。貯藏黑茶較為常見(jiàn)，黑茶中已發(fā)現(xiàn)存在大量微生物，如冠突散囊菌（）、曲霉屬（）、假單胞菌屬（）等[2-3]。微生物在黑茶加工過(guò)程中具有重要作用，關(guān)于黑茶中微生物的研究已經(jīng)大量開(kāi)展。研究證明，貯藏年份[4]、加工過(guò)程[5]、原料[3]、產(chǎn)地[6]均會(huì)對(duì)茶葉微生物群落組成產(chǎn)生影響。楊雅焯等[7]研究發(fā)現(xiàn)，廣西六堡茶的優(yōu)勢(shì)菌為鞘脂單胞菌屬（）、、乳酸菌屬（）等，而重慶沱茶無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)菌。在下關(guān)沱茶發(fā)酵過(guò)程，發(fā)酵前期霉菌為優(yōu)勢(shì)菌屬，發(fā)酵后期酵母則占主導(dǎo)[8]。對(duì)不同年份普洱茶微生物群落的研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬（）為其主要優(yōu)勢(shì)菌，其次為賴(lài)氏桿菌屬（）[4]。茶葉中微生物來(lái)源豐富，黑茶中微生物可能來(lái)自于茶樹(shù)內(nèi)生菌、茶樹(shù)生長(zhǎng)環(huán)境和加工環(huán)境等。路偉堯[8]發(fā)現(xiàn)普洱茶渥堆過(guò)程中的部分優(yōu)勢(shì)菌與生長(zhǎng)環(huán)境中空氣微生物、茶樹(shù)內(nèi)生菌、車(chē)間環(huán)境（空氣、地面、發(fā)酵用水）微生物一致，推測(cè)普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中的微生物部分來(lái)自于茶樹(shù)的生長(zhǎng)環(huán)境、茶葉內(nèi)生菌以及發(fā)酵車(chē)間。陳麗瑩等[9]檢測(cè)到茶樹(shù)大量?jī)?nèi)生菌在土壤中存在，推測(cè)土壤是內(nèi)生菌的可能來(lái)源。因此，白茶在貯藏過(guò)程中的微生物也可能存在多種來(lái)源。

在黑茶、煙草的貯藏過(guò)程中，均發(fā)現(xiàn)微生物多樣性變化對(duì)其品質(zhì)產(chǎn)生影響[10-12]。目前，國(guó)內(nèi)大部分的研究仍是基于黑茶，對(duì)于白茶微生物研究較少，且貯藏白茶細(xì)菌多樣性還尚未見(jiàn)報(bào)道，在白茶后期貯藏過(guò)程中，細(xì)菌多樣性的變化值得探討。因此，本試驗(yàn)選取了11個(gè)不同貯藏年份的白牡丹樣品，通過(guò)對(duì)其表面細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，揭示貯藏過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，以期為探究白茶貯藏條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品為福建品品香茶業(yè)有限公司、福建省裕榮香茶業(yè)有限公司、福建省天湖茶業(yè)有限公司、福鼎市張?jiān)洸铇I(yè)有限公司和福建鼎白茶業(yè)有限公司的不同貯藏年份白牡丹茶樣。貯藏地點(diǎn)均為福建省福鼎市，同一企業(yè)茶樣貯藏環(huán)境一致，樣品收集完畢后于實(shí)驗(yàn)室常溫密封保存，濕度小于50%。取樣過(guò)程的自封袋、錫箔紙、手套等均經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理。具體樣品信息如表1所示，以2017年生產(chǎn)的白牡丹為對(duì)照樣品（CK）。

表1 不同貯藏年份白牡丹樣品表

1.2 試驗(yàn)試劑

DNA Marker，日本Takara公司；E.Z.N.A.?Soil DNA Kitomega試劑盒，美國(guó)Omega公司；NaCl、Na2HPO4?12H2O、KH2PO4、50×TAE緩沖液，北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖，南京生興生物技術(shù)有限公司；rTaq DNA聚合酶試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，美國(guó)Axygen公司。

PBS緩沖液配制：稱(chēng)取NaCl 8?g，KCl 0.2?g，Na2HPO4?12H2O 3.62?g，KH2PO40.24?g，溶解于800?mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.4，然后加水定容至1?000?mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同年份白牡丹表面細(xì)菌富集及DNA提取

稱(chēng)取5?g混合好的樣品于無(wú)菌容器中，加入50?mL PBS緩沖液，置于搖床上振蕩培養(yǎng)30?min（180?r·min-1，37℃），然后超聲提取15?min，取出搖晃15?s，再次超聲15?min，置于搖床上振蕩培養(yǎng)30?min（180?r·min-1，37℃），過(guò)濾后將濾液轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌管，常溫狀態(tài)12?000?r·min-1離心10?min，棄上清液，將下層液體轉(zhuǎn)移到2.0?mL無(wú)菌離心管中，12?000?r·min-1離心10?min，棄上清液，沉淀進(jìn)行DNA提取。根據(jù)E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提。

1.3.2 測(cè)序建庫(kù)

提取樣品DNA后，根據(jù)V3和V4保守區(qū)設(shè)計(jì)得到引物（分別為338F和806R，338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'，806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5?min；95℃變性30?s，50℃退火30?s，72℃延伸30?s，30個(gè)循環(huán)；72℃穩(wěn)定延伸7?min；4℃保存。PCR產(chǎn)物使用2%凝膠回收，根據(jù)AxyPrep DNA Gel Extraction Kit說(shuō)明書(shū)純化產(chǎn)物，檢測(cè)定量，使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫(kù)，委托北京百邁克生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

使用FLASH v1.2.7軟件，通過(guò)overlap對(duì)每個(gè)樣品的雙端reads（PE reads）進(jìn)行拼接，得到原始序列（Raw tags）。使用Trimmomatic v0.33軟件，對(duì)原始序列進(jìn)行過(guò)濾，得到優(yōu)化序列（Clean tags）。使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效序列（Effective tags）。分別計(jì)算有效率（Effective，有效序列占原始序列的比例）、GC含量（G和C類(lèi)型的堿基占總堿基的百分比）、Q20（質(zhì)量值大于等于20的堿基占總堿基數(shù)的百分比）和Q30（質(zhì)量值大于等于30的堿基占總堿基數(shù)的百分比）。使用QIIME（version 1.8.0）軟件中的UCLUST對(duì)Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類(lèi)、獲得OTU（Operational taxonomic unit），并基于Silva（細(xì)菌）分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋。使用Mothur v.1.30軟件進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析，作稀釋性曲線(xiàn)（Rarefaction Curve）[13]，進(jìn)行Chao1、Ace、Shannon、Simpson指標(biāo)計(jì)算[14]。通過(guò)Graph Prism 8.0、R軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序質(zhì)量分析

由表2可知，11個(gè)樣品測(cè)序共獲得784?599對(duì)序列，703?966條優(yōu)化序列，每個(gè)樣品至少產(chǎn)生39?027條優(yōu)化序列；有效率均＞85%，有效序列占原始序列比值大；樣品GC含量范圍為51.75%~55.20%，不存在明顯的GC偏好性；Q20值均≥96.24%，Q30值均≥92.71%。綜上所述，測(cè)序質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

2.2 OTU分析

對(duì)OTU分析，共獲得1?366個(gè)OTUs，各樣品OTU數(shù)在147~891之間，樣品間OTU數(shù)存在差異（圖1）。對(duì)同一企業(yè)的白牡丹樣品進(jìn)行比較，來(lái)自裕榮香的白牡丹樣OTU數(shù)呈現(xiàn)為：YRX16

表2 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)處理結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖1 11個(gè)樣品OTU個(gè)數(shù)分布圖

2.3 樣品豐富度分析

2.3.1 稀釋性曲線(xiàn)

稀釋性曲線(xiàn)（Rarefaction curve）可驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性，反映樣品中物種的豐富程度與持續(xù)抽樣下新物種出現(xiàn)的速率。如圖2所示，樣本測(cè)序數(shù)量小于1?000時(shí)，隨測(cè)序數(shù)量增加，PPX07、YRX07、PPX08、PPX11、YRX11、DB13的OTU個(gè)數(shù)急速上升，表示群落中鑒定到大量物種，測(cè)序數(shù)量大于1?000時(shí)，OTU增加趨于平緩，環(huán)境中物種不會(huì)隨測(cè)序數(shù)量增加而顯著增加，測(cè)序序列充分；樣本測(cè)序數(shù)量小于4?000時(shí)，TH12、ZYJ14、PPX16、YRX16、CK的OTU個(gè)數(shù)急速上升，大于4?000后，OTU增加趨于平緩，該5個(gè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量大于上述6個(gè)樣本。綜上所述，11個(gè)樣本序列充分，可以用于數(shù)據(jù)分析。

2.3.2 樣品間Alpha多樣性分析

Chao1和Ace指數(shù)用于衡量物種豐度，Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性。如表3所示，11個(gè)樣品中DB13的Chao1和Ace指數(shù)最高，分別為917.538?5和904.756?9，表明DB13的物種豐度最高；其Shannon指數(shù)在11個(gè)樣品中最高，Simpson指數(shù)最低，分別為5.374?0和0.017?2，說(shuō)明DB13物種多樣性最高。PPX16的Chao1和Ace指數(shù)最低，分別為206.368?4和201.113?5，表明其物種豐度最低。物種多樣性最低的是ZYJ14，其Shannon指數(shù)最低，Simpson指數(shù)最高。整體上，各樣品的Chao1、Ace、Shannon指數(shù)均較高，Simpson指數(shù)較低，說(shuō)明物種豐富度及多樣性高，表明不同年份白牡丹中均存在著物種豐富的細(xì)菌群落。OTU覆蓋率反映樣本中微生物的真實(shí)情況，數(shù)值越高，則樣本中物種被測(cè)出的概率越高。各樣品的覆蓋率均大于0.998?7，說(shuō)明絕大部分物種可以被檢測(cè)出，證實(shí)測(cè)序質(zhì)量良好，可以滿(mǎn)足后續(xù)分析要求。

圖2 11個(gè)樣品稀釋性曲線(xiàn)圖

表3 貯藏白牡丹Alpha多樣性指數(shù)

2.4 樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 細(xì)菌群落分析

11個(gè)白牡丹茶樣的高通量測(cè)序結(jié)果共鑒定出266種細(xì)菌，涉及2個(gè)界，24個(gè)門(mén)，54個(gè)綱，102個(gè)目，194個(gè)科，373個(gè)屬。由圖3-A可知，在門(mén)水平上，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)（）、擬桿菌門(mén)（）、厚壁菌門(mén)（）等，其中變形菌門(mén)是最主要的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，在所有樣品中占比均大于40%，在TH12、PPX07中的占比大于90%。由圖3-B可知，在綱水平上，貯藏茶樣中的優(yōu)勢(shì)菌綱為-變形菌綱（）、-變形菌綱（）、鞘脂桿菌綱（）、-變形菌綱（）、梭菌綱（）、擬桿菌綱（）、芽孢桿菌綱（），其余一些不可識(shí)別以及不可培養(yǎng)細(xì)菌的占比極小。對(duì)上述結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在門(mén)及綱水平上，相同貯藏年份的白牡丹樣品物種組成相似，豐度上存在顯著差異，表明物種豐度和年份之間無(wú)顯著相關(guān)性，推測(cè)白牡丹表面的細(xì)菌可能來(lái)自于環(huán)境，主要受環(huán)境因素的影響。

注：A為細(xì)菌門(mén)分類(lèi)；B為細(xì)菌綱分類(lèi)

2.4.2 屬水平群落分析

選取屬水平上豐度大于5%的物種進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（圖4），不同貯藏年份的白牡丹茶樣細(xì)菌群落組成相似，豐度較高的菌屬均為鞘氨醇單胞菌屬（）、甲基桿菌屬（）、土地桿菌屬（）、貪噬菌屬（）、中慢生根瘤菌屬（）、布赫納氏菌屬（）、沙雷菌屬（）、根瘤菌屬（），以及毛螺菌科（）中未分類(lèi)的一些菌屬。但是在細(xì)菌豐度、優(yōu)勢(shì)菌屬上存在差異，CK中的優(yōu)勢(shì)菌屬為貪噬菌屬（）、鞘氨醇單胞菌屬（）、土地桿菌屬（）、甲基桿菌屬（），而YRX07中的優(yōu)勢(shì)菌屬為中慢生根瘤菌屬（）、鞘氨醇單胞菌屬（）以及毛螺菌科下未分類(lèi)菌屬。屬水平下，不同貯藏年份中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相似，物種豐度上存在差異，無(wú)明顯規(guī)律，說(shuō)明貯藏年份對(duì)細(xì)菌菌落多樣性及結(jié)構(gòu)影響不顯著，其年份并非影響菌落多樣性的關(guān)鍵因素，與上述在門(mén)和綱水平上的分析結(jié)果一致。

圖4 不同貯藏年份白牡丹細(xì)菌屬水平的相對(duì)豐度統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

3.1 貯藏白牡丹細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

貯藏白牡丹細(xì)菌群落多樣性高，豐度大；細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，物種豐度存在差異。高通量測(cè)序結(jié)果表明，貯藏茶樣中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要為變形菌門(mén)（）、擬桿菌門(mén)（）、厚壁菌門(mén)（）等；優(yōu)勢(shì)菌綱為-變形菌綱（）、-變形菌綱（）、鞘脂桿菌綱（）、-變形菌綱（）；優(yōu)勢(shì)菌屬為鞘氨醇單胞菌屬（）、甲基桿菌屬（）。不同貯藏年份白牡丹樣品的細(xì)菌分析結(jié)果表明，群落結(jié)構(gòu)未有規(guī)律性變化，菌屬種類(lèi)與貯藏年份無(wú)顯著相關(guān)性，推測(cè)白茶表面的細(xì)菌主要來(lái)源于貯藏環(huán)境，而非加工過(guò)程，煙草的研究中也存在相似結(jié)果[12]。而黑茶后期貯藏中的優(yōu)勢(shì)菌與渥堆過(guò)程中微生物有直接相關(guān)性，渥堆促進(jìn)部分微生物大量繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌屬，這些優(yōu)勢(shì)菌屬在后續(xù)干燥等加工過(guò)程中依然可以存活，隨后在后期貯藏過(guò)程中這些優(yōu)勢(shì)微生物再次繁殖，成為優(yōu)勢(shì)菌，使得后期貯藏與渥堆過(guò)程中黑茶表面呈現(xiàn)的微生物群落結(jié)構(gòu)相似。研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬（）是普洱茶渥堆發(fā)酵及后期貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬，可證實(shí)黑茶后期貯藏過(guò)程中的微生物主要來(lái)源于加工過(guò)程[10,15]。已有研究顯示，這些微生物可促進(jìn)黑茶品質(zhì)的形成，改善后期加工及貯藏中黑茶的滋味[16]。因此，在白茶貯藏過(guò)程中，尤其是一些粗老的白茶，可利用微生物進(jìn)一步提升其品質(zhì)，改善其苦澀的口感，增強(qiáng)甜醇的滋味。

3.2 貯藏環(huán)境對(duì)白牡丹細(xì)菌群落的影響

不同貯藏條件對(duì)微生物群落及動(dòng)態(tài)變化有顯著影響，不同貯藏環(huán)境下的煙草在細(xì)菌群落上存在明顯差異[17]。研究表明，適宜的溫度、水活度、氧氣、pH和充足的養(yǎng)分會(huì)促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)[18-19]。大部分細(xì)菌最適培養(yǎng)溫度為25℃~37℃，水活度為0.94以上[20]，本試驗(yàn)中所有白牡丹貯藏環(huán)境均為常溫密封保存，濕度小于50%（水活度小于0.5），該貯藏環(huán)境不利于微生物的生長(zhǎng)；微生物生長(zhǎng)還需要豐富的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，茶葉中（碳水化合物、蛋白質(zhì)等）營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)貧乏，同時(shí)白茶在加工過(guò)程中經(jīng)過(guò)干燥后，水分含量低，不適合微生物的繁殖，并且多酚等物質(zhì)具有顯著抑菌作用[21]，抑制微生物的生長(zhǎng)。綜上所述，白牡丹貯藏時(shí)微生物不易大量繁殖，未形成優(yōu)勢(shì)菌屬。本研究發(fā)現(xiàn)，貯藏白牡丹表面細(xì)菌中豐度較高的是一種廣泛存在于環(huán)境中的細(xì)菌——鞘氨醇單胞菌屬（），除此之外未檢測(cè)到其他在貯藏白茶中大量富集的細(xì)菌群落，證實(shí)在該白茶貯藏環(huán)境中細(xì)菌的群落相對(duì)穩(wěn)定。貯藏條件的改變均有可能引起細(xì)菌多樣性及豐度變化。近年來(lái)，已有大量研究對(duì)貯藏條件進(jìn)行探究，旨在通過(guò)調(diào)控貯藏條件改善茶葉品質(zhì)，研究結(jié)果顯示適當(dāng)溫、濕度可以加快貯藏白茶品質(zhì)的轉(zhuǎn)變[22]，但是白茶貯藏轉(zhuǎn)化需要適度環(huán)境，要兼顧微生物安全。因?yàn)榄h(huán)境條件會(huì)影響細(xì)菌生長(zhǎng)，因此在白茶貯藏過(guò)程中要嚴(yán)格把控環(huán)境因子，尤其是溫度、濕度與氧氣，加強(qiáng)安全監(jiān)管，減少有害細(xì)菌富集。

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Analysis of Bacterial Diversity of Stored White Peony by High-Throughput Sequencing

CHEN Jiajia1,2,4, HU Yunfei2,3,4, SHEN Shiyu1,2,4, WANG Zhihua1,2,4, ZHOU Zhe1,2,4, TANG Qin1,2,4, SUN Weijiang1,2,3,4*

1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 352000, China; 2. Industrial Technology Development Base in Fujian Province, Fuzhou 350002, China; 3. Anxi College of Tea Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Quanzhou 362400, China; 4. Tea Industry Engineering Technology Research Center of Fujian Province, Fuzhou 350002, China

To investigate the diversity of the bacterial communities in stored white peony, 16?S rDNA of bacteria collected from 11 samples of different storage durations were analyzed by high-throughput sequencing. The results show that the species richness and diversity of DB13 were the highest. While in all stored white peony, the dominant phylum wereand. The dominant class wereand.And the dominant bacterial species at genus level include:.The composition structures of samples were similar, but there was difference in their abundance. Storage duration had no significant effect on the bacteria composition of white peony, but environments played important roles.

high-throughput sequencing, white peony, bacteria, diversity

S571.1

A

1000-369X(2020)04-519-09

2019-12-23

2020-03-02

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFF0201904-03）、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31770732）、福建農(nóng)林大學(xué)茶產(chǎn)業(yè)鏈科技創(chuàng)新與服務(wù)體系建設(shè)

陳佳佳，女，碩士研究生，主要從事茶葉加工方面的研究，1160576736@qq.com。

swj8013@126.com

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