伐地那非增加EGCG-β-乳球蛋白納米粒對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用

陳春曉，樓文雨，丁鎮(zhèn)建，李卓燁，楊媛媛，金鵬，杜琪珍

伐地那非增加EGCG--乳球蛋白納米粒對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用

陳春曉，樓文雨，丁鎮(zhèn)建，李卓燁，楊媛媛，金鵬，杜琪珍*

浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300

較高濃度的EGCG才能抑制癌細(xì)胞的增殖，通過(guò)納米化和EGCG與其他藥物的聯(lián)合使用是提高EGCG生物活性的重要策略。本研究將EGCG和伐地那非（VD）同時(shí)包埋于-乳球蛋白（-Lg）納米載體中，制備出EGCG-VD--Lg納米粒（EV-NPs），體外試驗(yàn)證實(shí)，EV-NPs能提高人肝癌細(xì)胞（HepG2細(xì)胞）中Caspase-3活性，使HepG2細(xì)胞在S期產(chǎn)生明顯的阻滯，誘發(fā)細(xì)胞核分裂，從而導(dǎo)致HepG2細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果表明，將EGCG與微量的VD聯(lián)合使用，并通過(guò)納米化包埋可以顯著提高EGCG的抗癌活性。這一方法在EGCG抗癌制品的開發(fā)方面具有潛在的價(jià)值。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；伐地那非；-乳球蛋白；納米粒；增殖抑制

綠茶中主要活性成分為表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG），EGCG含有較多的酚羥基，具有抗氧化性，對(duì)炎癥、癌癥、心血管疾病的防治具有積極的意義[1]。但由于EGCG對(duì)光、熱和弱堿性環(huán)境敏感，在體液環(huán)境易降解和聚合，其在體內(nèi)的生物利用率較低。

-乳球蛋白（-Lg）屬于一種高度結(jié)構(gòu)化的蛋白質(zhì)，是一種廉價(jià)的、性能優(yōu)良的包埋材料[2]。用-Lg包埋白藜蘆醇、姜黃素和-3多不飽和脂肪酸可以改善這些功能性成分的生物利用率[3-5]。課題組前期研究表明，用-乳球蛋白包埋EGCG-維生素C可以使EGCG對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率提高20%~30%，但增效作用幅度相對(duì)不高[6]。已有研究表明，EGCG與伐地那非（Vardenafil，VD）聯(lián)合使用（EGCG-VD）對(duì)抑制癌細(xì)胞有一定的協(xié)同作用[7]。因此，本研究采用-Lg包埋EGCG-VD，以期進(jìn)一步提高EGCG對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肝癌細(xì)胞（HepG2細(xì)胞，中國(guó)生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、鹽酸伐地那非（VD）、-乳球蛋白（-Lg）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液：江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒：BD Pharmingen公司；活性Caspase-3檢測(cè)試劑盒：BioVision公司。

全自動(dòng)手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)器：美國(guó)Millipore公司；熒光顯微鏡DM 2500：德國(guó)徠卡公司；酶標(biāo)儀MD SpectraMax M4：美國(guó)Molecular Devices（MD）公司；流式細(xì)胞儀BD FACSCalibur：美國(guó)BD Biosciences；Nano-ZS 90型激光粒度儀：英國(guó)馬爾文公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 納米粒的制備

參照EGCG--Lg納米粒（E-NPs）的制備方法[8-9]，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行方法上的改進(jìn)。即用0.01?mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.5）溶解-Lg，配置配制成8?mg·mL-1的-Lg溶液；用純凈水配制EGCG濃度1?mg·mL-1的系列EGCG-VD溶液：(EGCG)∶(VD)分別為（1∶0）、（3∶1）、（4∶1）、（5∶1）、（10∶1）、（15∶1）、（20∶1）、（25∶1）；然后將2.5?mL-Lg溶液分別與2.5?mL系列EGCG-VD溶液混合，再超聲處理6?min即得到系列EGCG-VD--Lg納米粒（EV-NPs）。

1.2.2 粒徑、電位測(cè)定

各納米粒的粒徑和電位采用英國(guó)馬爾文公司Nano-ZS 90型激光粒度儀測(cè)定。測(cè)試溫度為25℃，掃描波長(zhǎng)633?nm，散射角為173°。

1.2.3 細(xì)胞活力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10-11]，采用MTT（四甲基偶氮唑鹽比色法）試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力。培養(yǎng)細(xì)胞（37℃、5% CO2）至貼壁70%時(shí)，倒出培養(yǎng)基，用胰酶進(jìn)行消化。消化完畢后用移液槍輕輕吹打混勻，用培養(yǎng)基稀釋至預(yù)定濃度。將稀釋好的細(xì)胞以每孔200?μL（約5?500個(gè)細(xì)胞）分別接種于96孔板中，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁（約24?h）。更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基（180?μL），加入20?μL受試藥物（受試組）或生理鹽水（對(duì)照組）繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24?h或48?h后進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)定。將培養(yǎng)液棄置后用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，然后在每孔中加入完全培養(yǎng)基200?μL和MTT溶液50?μL，孵育4?h后將培養(yǎng)液移去，再加入二甲基亞砜（DMSO）150?μL，以300?r·min-1的低速搖床振蕩10?min，用酶標(biāo)儀在492?nm測(cè)定吸光值。受試藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率按下式計(jì)算：

對(duì)照組、受試組分別代表對(duì)照組和受試組的平均吸光值。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

將HepG2細(xì)胞用相應(yīng)受試藥物處理48?h，然后用倒置顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.5 細(xì)胞凋亡可視化觀察

采用DAPI染色對(duì)樣品處理后的HepG2細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行可視化觀察。將HepG2細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)24?h后加入受試藥物，給藥處理48?h后移去原培養(yǎng)基，并用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，然后在避光條件下加入DAPI染色液，染色處理15?min后移去染色液，PBS緩沖液漂洗細(xì)胞后用熒光顯微鏡觀察。

1.2.6 細(xì)胞凋亡率和壞死率測(cè)定

HepG2細(xì)胞被樣品處理后的凋亡率和壞死率通過(guò)Annexin-FITC/PI雙染色-流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。首先將HepG2細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80%~85%的融合狀態(tài)，然后加入相應(yīng)濃度的EV-NPs（EGCG濃度設(shè)為60?μg·mL-1）、EGCG（60?μg·mL-1）和VD（12?μg·mL-1）。給藥后培養(yǎng)48?h，移去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，用胰酶進(jìn)行消化后離心收集細(xì)胞。然后按照細(xì)胞凋亡試劑盒使用說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，處理完畢后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 細(xì)胞周期阻滯測(cè)定

采用PI染色法對(duì)細(xì)胞周期阻滯進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定步驟按周期阻滯試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。首先收集已用供試藥品處理好的細(xì)胞，然后用冰乙醇進(jìn)行冷凍處理（過(guò)夜），離心移去乙醇后用PBS緩沖液洗滌處理后的細(xì)胞，再加入適量的PI染色液，充分染色后用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期阻滯。

1.2.8 細(xì)胞中Caspase-3活性測(cè)定

細(xì)胞中Caspase-3活性通過(guò)Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。給藥處理后的細(xì)胞，先用PBS緩沖液洗滌，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，用胰酶進(jìn)行消化，再加入培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗）分散細(xì)胞。細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管后離心去除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞，再用50?μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液（Cell lysis buffer）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，通過(guò)BCA檢測(cè)法調(diào)節(jié)裂解液中的蛋白質(zhì)濃度至3~4?μg·μL-1。取45?μL稀釋裂解液于96孔板中，加入50?μL含有二硫蘇糖醇（DTT）的反應(yīng)緩沖液（含10?mmol·L-1DTT）和Caspase-3活性顯色底物（終濃度為200?μmol·L-1），在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5?h；培養(yǎng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀在405?nm測(cè)定吸光度。吸光度高低即表明細(xì)胞的活性Caspase-3含量的高低。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，使用SPSS 19.0軟件對(duì)獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)值表示為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG與VD的質(zhì)量比對(duì)納米體系的影響

可以通過(guò)電位來(lái)判斷納米粒的穩(wěn)定性，通常認(rèn)為電位的絕對(duì)值在30?mV以上時(shí)納米體系穩(wěn)定[12]。本研究制備的納米體系的粒徑、電位和多分散指數(shù)（PDI）如表1所示。由于-Lg的等電點(diǎn)為pH 5.1，當(dāng)(EGCG)∶(VD)為1∶1時(shí)，呈酸性的VD使得體系的pH為5.8，接近-Lg的等電點(diǎn)，導(dǎo)致-Lg溶解度降低而出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象[13]；(EGCG)∶(VD)在(3∶1)~(25∶1)的幾種納米體系均澄清，測(cè)得的平均粒徑為71?nm左右，電位均小于–35.1?mV，納米體系穩(wěn)定。同時(shí)，較小的PDI值表明，納米顆粒大小較一致。(EGCG)∶(VD)為5︰1制備的納米粒的透射電鏡圖（圖1）表明，EGCG-VD--乳球蛋白制備的納米粒（EV-NPs）呈球形，粒徑度大小與激光粒度儀測(cè)定結(jié)果（表1）一致。

2.2 EVβ-NPs對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用

細(xì)胞液EGCG終濃度為60?μg·mL-1時(shí)，不同EGCG與VD的質(zhì)量比的EV-NPs與E-NPs（不添加VD）對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制率如表2。

表1 EGCG與VD質(zhì)量比對(duì)納米粒的粒徑、ζ電位和PDI的影響

圖1 EVβ-NPs [m(EGCG)∶m(VD)=5∶1]透射電鏡照片

可以看出，添加VD制備的納米粒（EV-NPs）在24?h和48?h比E-NPs對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制效果更好。當(dāng)(EGCG)∶(VD)為5∶1時(shí)，EV-NPs處理24?h和48?h對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制比不添加VD的E-NPs [(EGCG)∶(VD)=1∶0]分別提高69%和75%。(EGCG)∶(VD)=3∶1的EV-NPs（178?nm）的抑制效果不及(EGCG)∶(VD)=5∶1的EV-NPs（73?nm），可能是因?yàn)?EGCG)∶(VD)=3∶1的EV-NPs的粒徑過(guò)大。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[14]，當(dāng)納米粒的粒徑在50~75?nm時(shí)，細(xì)胞易內(nèi)吞納米粒，而(EGCG)∶(VD)=5∶1的EV-NPs的粒徑更適合于細(xì)胞的內(nèi)吞。當(dāng)VD的添加量減少到(EGCG)∶(VD)到10∶1和15∶1后，EV-NPs的粒徑無(wú)明顯變化（表1），但它們的腫瘤細(xì)胞抑制活性顯著降低，可能是由于VD的添加量過(guò)少所致。

2.3 EVβ-NPs對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

通過(guò)對(duì)比正常細(xì)胞組、VD組、不添加VD的E-NPs組和EV-NPs組細(xì)胞的形態(tài)（圖2）可以看出，EV-NPs組細(xì)胞變形嚴(yán)重，大多數(shù)細(xì)胞呈球形（圖2-D），而正常細(xì)胞呈條形（圖2-A）。相對(duì)而言，E-NPs組細(xì)胞只有輕度的細(xì)胞變形，而VD組細(xì)胞形態(tài)與正常組細(xì)胞基本一致。由此看來(lái)，納米形式的樣品對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了一定的毒性，而含有VD的EV-NPs對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性比E-NPs進(jìn)一步提高。

表2 不同納米粒對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率

注：不同處理間不同上標(biāo)字母表示有顯著性差異（< 0.05）

Note: Significant differences (< 0.05) were indicated by different uppercase letters in each column

2.4 EVβ-NPs導(dǎo)致的HepG2細(xì)胞凋亡作用

對(duì)照組和VD處理的HepG2細(xì)胞中正常細(xì)胞的細(xì)胞核藍(lán)色熒光彌散均勻（圖3-A和圖3-B），而E-NPs和EV-NPs處理的細(xì)胞細(xì)胞核均出現(xiàn)了典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)，即染色質(zhì)邊緣化、細(xì)胞核固縮、形成凋亡小體（紅色箭頭所示）。但EV-NPs處理的細(xì)胞的細(xì)胞核裂解比E-NPs更嚴(yán)重，凋亡小體進(jìn)一步裂解成碎塊（圖3-D）。結(jié)果表明，EV-NPs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用效果比EGCG--NPs進(jìn)一步提高。

2.5 EVβ-NPs導(dǎo)致的HepG2細(xì)胞凋亡和壞死

EV-NPs與不同受試樣品作用于HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞壞死率存在明顯差異（圖4）。結(jié)果表明，E-NPs和EV-NPs處理的HepG2細(xì)胞的凋亡率顯著高于壞死率，且細(xì)胞壞死率和凋亡率顯著高于對(duì)照組和VD處理組（＜0.01）。此結(jié)果印證了上述DAPI染色顯示的細(xì)胞凋亡結(jié)果（圖3）。增加樣品濃度，EV-NPs導(dǎo)致HepG2細(xì)胞的凋亡率和壞死率亦逐漸提高（圖4-B），且具有明顯的劑量加性效應(yīng)。

圖2 不同樣品處理的HepG2細(xì)胞形態(tài)

圖3 不同樣品處理HepG2細(xì)胞后經(jīng)DAPI染色顯示的細(xì)胞核形態(tài)差異

2.6 EVβ-NPs對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響

用EV-NPs處理的HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)出S期細(xì)胞占比率大幅升高的現(xiàn)象（圖5），表明EV-NPs可使細(xì)胞S期產(chǎn)生阻滯，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但E-NPs和VD處理的細(xì)胞，S期細(xì)胞占比率相較于正常對(duì)照組細(xì)胞有明顯下降。EV-NPs與E-NPs的顯著差別是納米顆粒的大小，EV-NPs平均粒徑為73?nm，而E-NPs的平均粒徑只有31?nm。有研究報(bào)道，最適合于細(xì)胞內(nèi)吞的納米直徑為50~75?nm[14]，而EV-NPs大多數(shù)處于這一范圍。由此推測(cè)EV-NPs對(duì)細(xì)胞S期產(chǎn)生的阻滯可能與其粒徑尺寸有關(guān)。

2.7 EVβ-NPs對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

不同樣品處理的HepG2細(xì)胞的Caspase-3活性存在顯著差異（圖6），EV-NPs處理組細(xì)胞Caspase-3活性最高，其次為E-NPs組處理細(xì)胞，而VD處理組的Caspase-3活性與正常細(xì)胞組無(wú)差異?？梢?，EGCG與VD聯(lián)用顯著提高了凋亡蛋白的表達(dá)，說(shuō)明EV-NPs主要通過(guò)調(diào)控Caspase-3信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

注：EVβ-NPs設(shè)置3個(gè)濃度，EVβ-NPs-1的EGCG濃度為30?μg mL-1；EVβ-NPs-2的EGCG濃度為60?μg mL-1；EVβ-NPs-3的EGCG濃度為90?μg mL-1。不同處理間不同字母表示有顯著性差異（P<0.05）

圖5 不同樣品處理的HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期分布

注：*與CK（正常生長(zhǎng)細(xì)胞）組比較有顯著性差異（P<0.05），**與CK組比較有極顯著性差異（P <0.01）

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

EGCG有一定的抗腫瘤作用，但其穩(wěn)定性較差，抗腫瘤效果離臨床應(yīng)用還有較大的差距[15]。-Lg包埋EGCG可阻礙EGCG與氧氣的接觸從而相對(duì)提高了EGCG的穩(wěn)定性，這種簡(jiǎn)單的包埋可以一定程度提高EGCG的抗癌活性[16]。將EGCG與抗氧化劑綠原酸、3-巰基己醇、沒(méi)食子酸甲酯等聯(lián)合包埋于-Lg中，可以進(jìn)一步提高EGCG的穩(wěn)定性，EGCG的抗癌活性可以進(jìn)一步提高[17-19]。然而，僅僅提高EGCG的穩(wěn)定性，其抗癌活性依然難以達(dá)到臨床應(yīng)用要求。本研究結(jié)果表明，將EGCG與伐地那非聯(lián)合包埋于-Lg中制備成納米粒，其體外抗腫瘤活性進(jìn)一步增強(qiáng)，是一種有別于通過(guò)提高EGCG穩(wěn)定性來(lái)提高其抗癌活性的策略。

伐地那非（VD）是一種PDE5抑制劑，研究表明，PDE5抑制劑可能通過(guò)增加細(xì)胞對(duì)藥物的攝取來(lái)提高抗癌藥物的療效[20-21]。因此，本研究中，EV-NPs表現(xiàn)出比E-NPs更好的腫瘤細(xì)胞抑制效果，極可能是得益于VD增加了細(xì)胞對(duì)EGCG的攝取。類似于VD的PDE5抑制劑還有多種，如西地那非、他達(dá)那非、雙嘧達(dá)莫等。研究將這些PDE5抑制劑與EGCG聯(lián)用，并采取納米化包埋，有可能進(jìn)一步提高EGCG的抗癌活性。其次，本研究?jī)H進(jìn)行了EV-NPs體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用效果，有必要通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)和人體試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)其在抗癌上的應(yīng)用前景。

3.2 結(jié)論

EGCG與伐地那非聯(lián)合包埋于-Lg中制備成納米粒（EV-NPs），能提高Caspase-3的活性，使HepG2細(xì)胞在S期產(chǎn)生明顯的阻滯，促進(jìn)細(xì)胞核分裂，從而加速腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此，將EGCG與微量的VD聯(lián)合使用，并通過(guò)納米化包埋，在EGCG抗癌制品的開發(fā)方面具有潛在的價(jià)值。

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Vardenafil Improves the Proliferative Inhibition of EGCG--lactoglobulin Nanoparticles Against Liver Cancer Cells

CHEN Chunxiao, LOU Wenyu, DING Zhenjian, LI Zhuoye, YANG Yuanyuan, JIN Peng, DU Qizhen*

School of Agricultural and Food Science, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Hangzhou 311300, China

The combination of nano and other drugs is an important strategy to improve the biological activity of EGCG, since a high EGCG concentration is essential for the inhibition of the proliferation of cancer cells. In this study, EGCG-vardenafil (VD)--lactoglobulin (-Lg)-nanoparticles (EV-NPs) was prepared by encapsulating EGCG and VD in-Lg nano-carriers.experimental results show that EV-NPs could upgrade the activity of caspase-3 in HepG2 cells compared to the native EGCG, which caused cell cycle arrest in the S phase of HepG2 cells to induce cell nuclear division, and finally lead to HepG2 cell apoptosis. The results demonstrate that the encapsulation of EGCG-VD can significantly improve the anticancer activity of EGCG, and possesses potential value in the development of EGCG anticancer products.

EGCG, vardenafil,-lactoglobulin, nanoparticles, proliferative inhibition

S571.1；Q946.84+1

A

1000-369X(2020)04-528-08

2019-10-09

2020-04-11

浙江省重點(diǎn)研發(fā)（2019C02072）、浙江農(nóng)林大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新（113-2013200135、115-2013200021）

陳春曉，女，碩士研究生，主要從事天然活性物質(zhì)方面的研究。

qizhendu@163.com

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