不同鹽度循環(huán)養(yǎng)殖水體微生物群落特征

馮國祿，羅金飛,*，廖永巖，李書迪

1.北部灣大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，廣西 欽州 535011 2.桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 桂林 541006 3.北部灣大學(xué)海洋學(xué)院，廣西 欽州 535011 4.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 欽州 535011

海洋養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展受到環(huán)境污染的嚴(yán)重制約[1]，急需向綠色環(huán)保方向轉(zhuǎn)型升級[2]. 工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖(RAS)因節(jié)水節(jié)能等優(yōu)勢，是未來重要的養(yǎng)殖模式之一[3]. 工廠化養(yǎng)殖可有效避免青蟹間相互殘殺，提高養(yǎng)殖成活率，但由于養(yǎng)殖系統(tǒng)相對封閉性，具有毒副作用的氮磷等污染物質(zhì)排入其中，如不能及時(shí)被轉(zhuǎn)化成為毒性更小，或無毒無害的物質(zhì)，則會造成養(yǎng)殖動物因其毒害作用而死亡. 如何迅速轉(zhuǎn)化水中具有毒副作用的氮磷物質(zhì)是水產(chǎn)工業(yè)化養(yǎng)殖面臨的關(guān)鍵問題[4]. 生物處理法作為一種無毒無害且不會造成二次污染的水質(zhì)凈化法[5]，被認(rèn)為是處理養(yǎng)殖系統(tǒng)中溶解態(tài)污染物最經(jīng)濟(jì)有效的方式，它主要利用微生物的吸收代謝等作用，降解轉(zhuǎn)化水體中的污染物[6].

鹽度作為一種基本的海產(chǎn)品養(yǎng)殖要素，不僅可以顯著影響青蟹的生理代謝，也會干擾水體微生物的新陳代謝，進(jìn)而影響水中氮磷污染物的轉(zhuǎn)化降解[7-8]. Rysgaard等[9]發(fā)現(xiàn)鹽度與河口沉積物中的硝化作用速率成反比，當(dāng)鹽度從0‰升至10‰時(shí)，硝化作用速率下降了50%. Jackson等[10]研究發(fā)現(xiàn)，鹽度可以有效增加沉積物中的微生物多樣性，而高氮則會降低其多樣性. 張磊等[11]研究內(nèi)陸湖泊中微生物群落對營養(yǎng)鹽和鹽度雙重脅迫的響應(yīng)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)α-變形菌綱的相對豐度隨鹽度的升高而增加，但會受到水體氮磷營養(yǎng)鹽水平的制約. 探究不同低鹽度下，氮磷環(huán)境因子與微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)關(guān)系，對于保障養(yǎng)殖水環(huán)境健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義. 目前關(guān)于鹽度對青蟹養(yǎng)殖影響的研究，更多地集中于對其生長狀態(tài)的宏觀性研究，如Stickle等[12]研究了鹽度對2種青蟹存活狀態(tài)的影響. 關(guān)于鹽度對青蟹養(yǎng)殖水體微生物群落的影響還鮮見報(bào)道，而工廠化養(yǎng)殖系統(tǒng)由于其相對封閉性和高穩(wěn)定性[13-14]，為探究環(huán)境因子與養(yǎng)殖水體微生物群落的相關(guān)關(guān)系提供了獨(dú)一無二的優(yōu)質(zhì)試驗(yàn)場所.

該研究在五組鹽度梯度(1‰、3‰、5‰、7‰、9‰)下開展擬穴青蟹循環(huán)水養(yǎng)殖試驗(yàn)，分析比較了不同鹽度下青蟹養(yǎng)殖水體的微生物群落特征，探討了循環(huán)養(yǎng)殖水體中鹽度、氮磷營養(yǎng)鹽因子與微生物群落三者之間的相關(guān)關(guān)系，以期為海水養(yǎng)殖水體中的污染物控制提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中開展為期21 d的擬穴青蟹養(yǎng)殖試驗(yàn)，各組所用青蟹數(shù)量、規(guī)格質(zhì)量(55±4.05)g和批次均相同，飼料投喂量相同. 每組循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水量為3 m3，循環(huán)水流量為3 m3/h. 養(yǎng)殖鹽度分別為1‰、3‰、5‰、7‰、9‰，對應(yīng)命名為S1、S3、S5、S7、S9，以青蟹極限生存鹽度5‰[15-16]的鹽度組為對照組. 養(yǎng)殖用水取自同一批天然海水，水質(zhì)呈天然弱堿性，經(jīng)過濾稀釋后投入養(yǎng)殖系統(tǒng)中. 通過添加NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.8±0.3，通過制氧機(jī)(CC-O2-15A，廣州暢馳環(huán)?？萍脊煞萦邢薰?維持系統(tǒng)ρ(DO)為7 mg/L，通過恒溫機(jī)(CC-SC-3ANJ6B，廣州暢馳環(huán)保科技股份有限公司)維持水溫為26 ℃.

1.2 水樣采集及數(shù)據(jù)分析

所采水樣保存于1 L無菌玻璃瓶中，采集完成后低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室測定分析. 水質(zhì)檢測指標(biāo)分別為水溫、pH、ρ(DO)、ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(TN)、ρ(PO43--P)和ρ(TP). 水溫、ρ(DO)采用YSI溶氧儀(YSI6920，美國維賽儀器公司)現(xiàn)場測定，pH采用哈納pH計(jì)(HI98312，意大利哈納沃德公司)測定.ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(TN)、ρ(PO43--P)和ρ(TP)均采用德國SEAL流動注射分析儀(AA3，德國Seal公司)檢測[17-19]，測定3個平行樣，結(jié)果取其平均值. 青蟹質(zhì)量使用電子天平(CAV114C，美國奧豪斯公司)測量，結(jié)果取其平均值.

1.3 高通量測序及分析

取500 mL水樣經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，采用CTAB法提取樣本DNA，通過凝膠電泳檢測所提樣本DNA純度和濃度，之后取適量樣本DNA稀釋至1 ng/μL. 以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)選擇的測序區(qū)域，使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)采用回收試劑盒回收產(chǎn)物；采用單端測序(Single-End)法構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行單端測序；采用Qiime軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，并繪制稀釋曲線.采用維恩圖和UPGMA聚類樹分析樣品細(xì)菌群落之間的相似性；通過微生物相對豐度柱形圖比較樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；采用Mantel test分析和典范對應(yīng)分析得到循環(huán)水體中微生物群落和氮磷環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系.

2 結(jié)果與討論

2.1 養(yǎng)殖水體理化性質(zhì)

不同鹽度的養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)參數(shù)如表1所示. S1和S3的養(yǎng)殖水體中ρ(TP)相對較高，其次為S7.ρ(TN)在S1最高，其次為S3，這與鹽度對擬穴青蟹的脅迫有關(guān). 鹽度作為一種調(diào)節(jié)滲透壓的離子，可以顯著影響甲殼動物生長存活[20]，當(dāng)養(yǎng)殖鹽度低于最低極限生存鹽度時(shí)，為了維持滲透壓，養(yǎng)殖動物會增加排泄量，加劇養(yǎng)殖水體污染[21]，因此S1和S3水中氮磷污染物濃度較高. 對青蟹的生長情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在S1、S3的青蟹生長速率顯著低于S5、S7、S9(P<0.05)，S5、S7、S9的青蟹生長速率無顯著性差異(P>0.05). S9的青蟹生長速率最快，其正常生理代謝最旺盛，導(dǎo)致其水中ρ(NH4+-N)最高. 該研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖水體中污染物濃度與鹽度之間無明顯相關(guān)關(guān)系，這可能與鹽度造成養(yǎng)殖水體微生物群落的差異化有關(guān)，不同微生物對污染物的轉(zhuǎn)化效率不同.

表1 不同鹽度水體水質(zhì)參數(shù)

2.2 微生物群落多樣性分析

以97%的一致性對所有有效OTU序列進(jìn)行聚類分析，得到細(xì)菌在不同分類水平上的數(shù)目分別為67門74綱152目281科745屬431種，說明在養(yǎng)殖水體中具有較高的微生物多樣性. 所有水樣的有效序列數(shù)統(tǒng)一抽取至 46 378 條，S5的OTU數(shù)目最少，為443 bp，S3水樣中具有最多的OTU數(shù)目，為912 bp，S1的OTU數(shù)目為861 bp，S7和S9的OTU分別為646和546 bp. 繪制基于OTU的稀釋曲線(見圖1)，發(fā)現(xiàn)稀釋曲線均隨序列數(shù)的增加而逐漸趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，測序結(jié)果能反映養(yǎng)殖水體中細(xì)菌多樣性的真實(shí)情況.

圖1 高通量測序稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of high-throughput sequencing results

高通量測序的多樣性指數(shù)如表2所示，Coverage指數(shù)表明測序深度均在99.9%及以上，說明水樣中微生物基因未被檢出的概率極低. PD_whole_tree指數(shù)顯示，S1和S3樣品中優(yōu)勢菌種的地位和作用顯著高于S5、S7和S9. Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)都是衡量樣品中的物種數(shù)目，五組樣品中物種數(shù)目從大到小依次為S3、S1、S9、S5、S7，Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)都印證了該結(jié)果的準(zhǔn)確性，二者之間也相互驗(yàn)證. 在Alpha Diversity指數(shù)中，Shannon-Wiener指數(shù)是用來衡量樣本豐富度和均勻度，S3的Shannon-Wiener指數(shù)最高，S1其次，S5最低. Simpson指數(shù)反映樣本的物種群落多樣性，所有樣本中S1和S3的微生物群落多樣性相對較高，S5的最低. 在五組水樣中，S1和S3的水體中，微生物的物種數(shù)目和豐富度較高，這可能是由于水中氮磷濃度較高造成的. 大量研究表明，水中氮磷濃度會明顯影響微生物群落多樣性，如陳兆進(jìn)等[22]研究發(fā)現(xiàn)，NH4+-N等環(huán)境因子會對丹江口水庫中微生物多樣性指數(shù)造成影響；李玉華等[23]發(fā)現(xiàn)水深會造成TN、TP含量發(fā)生變化，間接導(dǎo)致松花湖水體中微生物群落多樣性發(fā)生變化. 在養(yǎng)殖水體中鹽度變化會改變細(xì)菌的群落特征，但其是直接作用還是間接作用，或者共同作用，目前尚不明確，其關(guān)鍵驅(qū)動因子也有待探究.

2.3 微生物群落相似性分析

表2 養(yǎng)殖水體細(xì)菌多樣性指數(shù)

為了更加直觀地表現(xiàn)鹽度對養(yǎng)殖水體微生物群落的影響，采用維恩圖對其OTU數(shù)目相似性及重疊情況進(jìn)行展示，結(jié)果見圖2. 由圖2可見，S1、S3、S5、S7和S9特有的OTU數(shù)目分別為321、456、82、155和96，五組水樣的總OTU數(shù)為1 943，共有OTU數(shù)為111，占總OTU數(shù)的5.71%，說明五組水樣的相似度較低，鹽度的波動會明顯改變養(yǎng)殖水體微生物群落，同時(shí)也說明微生物對外界環(huán)境變化具有非常靈敏的響應(yīng)機(jī)制.

圖2 OTU分布維恩圖Fig.2 Venn diagram showing the distribution of OTU

圖3 微生物群落的聚類樹與條形圖Fig.3 Cluster tree of microbial community

對養(yǎng)殖水體微生物群落進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果見圖3. 由圖3可見，S1和S3的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度高，S7與S9的相似度高，鹽度為5‰的S5處于過渡階段，因此S5與S1、S3、S7、S9均具有一定相似度，說明青蟹的極限生存鹽度為5‰，可能與養(yǎng)殖水體中的微生物有直接關(guān)系，同時(shí)也說明養(yǎng)殖水體中微生物的群落結(jié)構(gòu)與鹽度梯度存在一定相關(guān)性. 王子超[24]研究發(fā)現(xiàn)，在SBR系統(tǒng)中鹽度低于3%時(shí)，微生物多樣性指數(shù)隨鹽度增加而增加. 王新瑩[25]發(fā)現(xiàn)，在巴丹吉林天然鹽堿湖泊中的古菌群落多樣性隨鹽度的增加而降低，低鹽度湖泊的種群多樣性比高鹽度的高. 羅勇等[26]發(fā)現(xiàn)，鹽度可以顯著影響燃料電池體系中的微生物群落.

2.4 微生物群落組成分析

為進(jìn)一步判斷鹽度、氮磷營養(yǎng)鹽、脫氮除磷微生物三者之間的相關(guān)關(guān)系，了解鹽度對養(yǎng)殖水體微生物的影響，分別從門水平和屬水平分析樣品中細(xì)菌群落組成及分布. 養(yǎng)殖水樣中門分類水平前10位的微生物群落相對豐度如圖4所示，分別為變形菌門(Proteobacteria，占比為50.39%～72.47%)、厚壁菌門(Firmicutes，占比為2.98%～8.48%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，占比為15.95%～21.51%)、浮霉菌門(Planctomycetes，占比為1.16%～3.17%)、放線菌門(Actinobacteria，占比為0.34%～0.87%)、梭桿菌門(Fusobacteria，占比為0.01%～0.84%)、酸桿菌門(Acidobacteria，占比為0.01%～1.95%)、綠彎菌門(Chloroflexi，占比為0.33%～1.51%)、纖細(xì)菌門(Gracilibacteria，占比為0.16%～0.74%)以及少量分類地位不明確的細(xì)菌類群，并以變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門為主要微生物菌門. 五組水樣中變形菌門相對豐度依次為S5>S7>S9>S1>S3，厚壁菌門相對豐度依次為S9>S3>S5>S7>S1，擬桿菌門相對豐度依次為S1>S7>S3>S9>S5.

由圖4可見，五組水樣中變形菌門均為絕對優(yōu)勢菌門，這與吳越等[27-28]的研究結(jié)果一致，即與養(yǎng)殖用水為海水有關(guān)，且有研究[29]表明變形菌門是海洋中主要的微生物菌群. 變形菌門主要由α綱、β綱和γ綱組成，其適應(yīng)力強(qiáng)，同時(shí)參與水體自凈，廣泛分布于江河湖海中[30]. 微生物動態(tài)變化是對環(huán)境變化的有效響應(yīng)，養(yǎng)殖水體氮磷等污染物含量高，而變形菌門是脫氮除磷降低水中COD的主要功能菌門，能夠去除和轉(zhuǎn)化多種污染物[31-33]. 這些氮磷污染物為變形菌門提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)了海水中變形菌門的生長繁殖，因此變形菌門占據(jù)了水體中絕對的生態(tài)位優(yōu)勢. 擬桿菌門均為第二優(yōu)勢菌群，擬桿菌門能有效地促進(jìn)水中有機(jī)物的氧化分解，是維持生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的重要微生物菌群[34]. Cottrell等[35]研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門對海洋中有機(jī)物的降解必不可少，尤其對蛋白質(zhì)的降解轉(zhuǎn)化效率高. 養(yǎng)殖動物會排泄出大量氮磷化合物，其中含氮化合物主要包括氨、尿素及蛋白質(zhì)，同時(shí)殘餌里也含有大量蛋白質(zhì)，這些污染物促進(jìn)擬桿菌門微生物在水中大量繁殖. 放線菌門微生物能分泌多種酶，促進(jìn)水中蛋白質(zhì)分解[36]. 厚壁菌門微生物能分泌多種消化酶和抗生素，也可以通過直接利用水中硝酸鹽和亞硝酸鹽從而凈化水質(zhì)[37]. 浮霉菌門微生物中的厭氧氨氧化菌可以將氨氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)猓档退邪钡?，維護(hù)養(yǎng)殖水質(zhì)健康[38]. 部分綠彎菌門微生物能夠進(jìn)行光合作用，配合部分?jǐn)M桿菌門微生物降解水中有機(jī)物[39]. 酸桿菌門是由于在酸性環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)而得名[40]，但是也有部分研究[41]顯示該菌也可以存在于堿性環(huán)境下，試驗(yàn)所用海水為天然弱堿性海水，發(fā)現(xiàn)存在酸桿菌門，但相對豐度極低.

由于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的相對封閉性，水中氮磷等污染物主要依賴于脫氮除磷微生物的轉(zhuǎn)化，分析不同鹽度水體中脫氮除磷微生物的分布特征，對了解鹽度對養(yǎng)殖水體微生物群落的影響具有代表性作用. 相對豐度前40位的屬水平細(xì)菌中，具有脫氮除磷特性的有14種(見表3)，主要為具有反硝化作用的福格斯氏菌屬(Vogesella)、不動桿菌屬(Acinetobacter)和氣單胞菌屬(Aeromonas)，其可將養(yǎng)殖水體中的NO3--N在無氧的條件下還原為(NO2--N、NO、N2O)，最后還原為氮?dú)? 養(yǎng)殖水體在充氧裝置的作用下始終處于好氧狀態(tài)，反硝化作用被抑制，水中含氮污染物難以通過反硝化作用得到去除. 養(yǎng)殖水體中含有大量的好氧反硝化細(xì)菌，NO3--N在好氧反硝化作用下以氮?dú)獾男问奖幻摮?，可有效降低水中的無機(jī)氮含量. 在不同鹽度的養(yǎng)殖水體中，好氧反硝化所依賴的微生物種類不同. S1中主要依賴于黃桿菌屬(Flavobacterium)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)；S3中主要依賴于鞘脂單胞菌屬；S5和S7中主要依賴于黃桿菌屬和弧菌屬(Vibrio)等；S9中主要依賴于假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、黃桿菌屬和副球菌屬(Paracoccus)等. 養(yǎng)殖水體磷酸鹽的去除轉(zhuǎn)化主要依賴于不動桿菌屬和希瓦氏菌屬(Shewanella)，其相對豐度在S5、S7、S9中明顯高于S1、S3的養(yǎng)殖水體，因此在S5、S7、S9水體中ρ(TP)也較低. 在S1的養(yǎng)殖水體，好氧固氮微生物固氮螺菌屬(Azospira)和吸收有機(jī)氮的球衣細(xì)菌(Sphaerotilus)相對豐度顯著高于其余鹽度組，因此S1中ρ(TN)最高. 綜上，不同鹽度的養(yǎng)殖水體中主要的脫氮除磷微生物種類不同，其相對豐度也不同，鹽度的變化會極大地影響?zhàn)B殖水體微生物群落組成，水中氮磷污染物也會導(dǎo)致其發(fā)生變化，但直接驅(qū)動因子和關(guān)鍵驅(qū)動因子尚不明確.

2.5 微生物群落與環(huán)境因子相關(guān)性分析

為更全面地探究鹽度對養(yǎng)殖水體微生物群落的作用機(jī)制，分析鹽度、氮磷環(huán)境因子、微生物群落三者的相關(guān)性意義重大. 首先采用典范對應(yīng)分析對造成水樣差異化的氮磷環(huán)境因子進(jìn)行篩選，然后采用Mantel test相關(guān)性分析進(jìn)一步得到造成微生物群落結(jié)構(gòu)差異化的主要環(huán)境驅(qū)動因子. 典范對應(yīng)分析(CCA)結(jié)果中軸1(CCA1)和軸2(CCA2)對樣本中屬水平微生物群落分布的解釋度分別為19.84%和46.96%(見圖5)，兩個軸的總解釋度為66.8%，這說明氮磷是直接影響?zhàn)B殖水體微生物群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子.ρ(NO2--N)、ρ(PO43--P)和ρ(TN)為軸1上的主要影響因子，ρ(NH4+-N)和ρ(TP)為軸2上的主要影響因子. S1與ρ(NO3--N)、ρ(TN)、ρ(TP)均呈正相關(guān)，S3與ρ(NO2--N)、ρ(PO43--P)均呈正相關(guān)，S5、S9與ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(TN)、ρ(TP)均呈負(fù)相關(guān)，S7與ρ(NH4+-N)、ρ(NO3--N)、ρ(PO43--P)均呈負(fù)相關(guān)，這說明鹽度是直接導(dǎo)致水體中氮磷環(huán)境因子出現(xiàn)差異化的主要原因. 在生態(tài)系統(tǒng)承載范圍內(nèi)，系統(tǒng)中的污染物與微生物息息相關(guān)，二者既相互促進(jìn)，也相互制約，直至達(dá)到動態(tài)平衡. 具有反硝化作用的福格斯氏菌屬與ρ(NO3--N)均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，這可能是由于ρ(NO3--N)較高，促進(jìn)了福格斯氏菌屬的繁殖；Marivivens、假交替單胞菌屬、黃桿菌屬與ρ(NO3--N)、ρ(PO43--P)均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，這主要與該類菌屬具有好氧反硝化特性以及反硝化過程的電子傳遞有關(guān)；具有好氧反硝化特性的弧菌屬(Vibrio)與ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(TN)均呈負(fù)相關(guān)；ρ(TP)與粘著桿菌(Tenacibaculum)呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與紅球菌屬(Rhodococcus)、葉桿菌屬(Phyllobacterium) 均呈正相關(guān)；乳球菌屬(Lactococcus)與ρ(TN)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，這可能與乳球菌屬的益生菌特性有關(guān)[56]，乳球菌屬還具有提高水產(chǎn)品質(zhì)量以及抑制病原菌的作用[57]. 綜上，鹽度主要是通過影響擬穴青蟹生理代謝導(dǎo)致水體中氮磷環(huán)境因子出現(xiàn)差異，間接影響?zhàn)B殖水體微生物群落結(jié)構(gòu).

表3 養(yǎng)殖水樣脫氮除磷功能菌分布特征

圖5 水體環(huán)境因子的CCA分析Fig.5 CCA analysis of physical and chemical factors

營養(yǎng)鹽因子的種類和濃度會造成水中微生物群落差異化. 為了進(jìn)一步明確營養(yǎng)鹽中的關(guān)鍵驅(qū)動因子，采用Mantel test分析對相關(guān)的氮磷環(huán)境因子進(jìn)行篩選，結(jié)果如表4所示. 對單一營養(yǎng)鹽分子而言，對門水平微生物群落的影響從大到小依次為ρ(NO2--N)、ρ(TN)、ρ(TP)、ρ(NH4+-N)、ρ(PO43--P)、ρ(NO3--N)，其中NO2--N對微生物群落具有顯著性影響(P<0.05)，單一營養(yǎng)鹽與屬水平微生物群落的相關(guān)性依次為ρ(NO2--N)>ρ(PO43--P)>ρ(TP)>ρ(TN)>ρ(NH4+-N)>ρ(NO3--N)，ρ(NO2--N)與微生物群落結(jié)構(gòu)呈顯著正相關(guān)(P<0.05). 系統(tǒng)中的能量流動生生不息，在這個過程當(dāng)中往往伴隨著物質(zhì)的循環(huán)轉(zhuǎn)化，各個物質(zhì)處于不斷的形態(tài)轉(zhuǎn)化之中，如水中三氮污染物會在微生物的作用下不斷相互轉(zhuǎn)化，因此整體分析氮化物和磷化物對微生物的影響，對加深了解關(guān)鍵驅(qū)動因子具有十分重要的作用. 該研究發(fā)現(xiàn)，ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)的復(fù)合營養(yǎng)鹽因子與屬水平微生物群落呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(PO43--P)的復(fù)合營養(yǎng)鹽因子與屬水平微生物群落呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與門水平微生物群落的相關(guān)系數(shù)為0.564；ρ(TP)和ρ(TN)不會對微生物群落產(chǎn)生太大影響. 綜上，ρ(NO2--N)是影響?zhàn)B殖水體中微生物群落的主要營養(yǎng)鹽因子，系統(tǒng)中的營養(yǎng)鹽因子并不是單獨(dú)地對微生物群落起著作用，而是協(xié)同發(fā)揮，共同調(diào)節(jié)，營養(yǎng)鹽元素在相互在轉(zhuǎn)化過程中，對微生物群落的影響程度盡管可能會被削弱，但仍不可忽略，營養(yǎng)鹽因子之間的相互作用機(jī)制和對微生物群落的影響方式還需進(jìn)一步深入研究.

表4 環(huán)境因子與門水平微生物群落Mantel test分析

3 結(jié)論

a) 在五組鹽度的擬穴青蟹循環(huán)養(yǎng)殖水體中，細(xì)菌群落共有67門74綱152目281科745屬431種，Ace指數(shù)和Chao 1指數(shù)顯示物種豐度依次表現(xiàn)為S3>S1>S5>S7>S9，Shannon-Wiener指數(shù)表明細(xì)菌的多樣性依次表現(xiàn)為S3>S1>S9>S7>S5，Simpson指數(shù)表明細(xì)菌的豐富度和均勻度依次表現(xiàn)為S1>S3>S7> S5>S9.

b) 五組鹽度的養(yǎng)殖水體中共有OTU數(shù)占總OTU數(shù)的5.71%，S1與S3養(yǎng)殖水體微生物群落結(jié)構(gòu)相似度高，S7與S9養(yǎng)殖水體中微生物群落結(jié)構(gòu)相似度高.

c) 五組鹽度的養(yǎng)殖水體中，變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為主要微生物菌群，養(yǎng)殖水體優(yōu)勢菌種中大量為具有脫氮除磷特性的微生物.

d) 4種營養(yǎng)鹽中的ρ(NO2--N)對養(yǎng)殖水體微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著影響(P<0.05)，ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)和ρ(PO43--P)整體與屬水平微生物群落呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，養(yǎng)殖水體中營養(yǎng)鹽因子協(xié)同對微生物群落發(fā)揮作用，但其營養(yǎng)鹽元素之間的相互作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究.