不同劑量龍血生肌溫敏凝膠對(duì)失神經(jīng)支配創(chuàng)面促愈合的實(shí)驗(yàn)研究

董黎強(qiáng)，羅統(tǒng)富，金圣煊，魏 浩，劉啟明，黃余亮，安忠誠(chéng)

失神經(jīng)支配創(chuàng)面一般指各種因素造成創(chuàng)面暫時(shí)性神經(jīng)支配缺失而導(dǎo)致愈合困難，目前在臨床上發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。而對(duì)于失神經(jīng)支配創(chuàng)面的治療，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外涌現(xiàn)了諸多如負(fù)壓封閉引流技術(shù)（VSD）、富血小板血漿(PRP)、皮膚祖源細(xì)胞、基因工程藥物、中藥、超聲波、高壓氧、電刺激等方法，相關(guān)研究結(jié)果均能收到一定效果，但療效仍未盡如人意，有進(jìn)行更深層次研究的必要。本課題組前期采用我院經(jīng)驗(yàn)復(fù)方中藥制劑龍血生肌膏治療失神經(jīng)支配創(chuàng)面，取得了較好的療效，基礎(chǔ)研究及臨床病例觀察均證實(shí)了龍血生肌膏對(duì)失神經(jīng)創(chuàng)面有較顯著的促愈合作用[2-4]，但由于藥劑制備工藝、器械等條件限制，其藥物的臨床療效仍未達(dá)到最佳狀態(tài)，因此本研究將龍血生肌膏有效成分改制成溫敏凝膠劑型，并將不同劑量的龍血生肌溫敏凝膠應(yīng)用于失神經(jīng)支配動(dòng)物創(chuàng)面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探索其最佳有效劑量，為下一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物來(lái)源 SD大鼠由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；龍血生肌溫敏凝膠藥物同龍血生肌膏，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院中藥房提供，再由杭州市創(chuàng)新中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究所有限公司制備溫敏凝膠。藥物制備是根據(jù)龍血生肌膏中每味中藥的主要有效成分、臨床用法等特點(diǎn)，分別采用乙醇提取、水提取以及粉碎制粉等工藝攝取出藥物有效成分，再以水溶性高分子材料泊洛沙姆為載藥基質(zhì)，經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性、重復(fù)性、專(zhuān)屬性等試驗(yàn)，制備成高、中、低三種不同濃度的龍血生肌溫敏凝膠。按生藥量計(jì)算，三種劑量的溫敏凝膠濃度分別為0.8、0.4、0.2 g/mL。凝膠觸發(fā)溫度為32～35℃，與人體正常體表溫度接近。

1.2 動(dòng)物分組及建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?將SD大鼠80只隨機(jī)分成4組：高劑量組、中劑量組、低劑量組、對(duì)照組，各20只。大鼠于實(shí)驗(yàn)前2 d用脫毛膏行背部、腹部脫毛，以四肢為界線，方便后期的創(chuàng)面換藥。將大鼠稱重，以10%戊巴比妥鈉（劑量25 mg/kg）進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉達(dá)成后，用直尺在T11與L2之間畫(huà)一條平行脊柱水平線(大鼠背部肋脊角可作T13定位標(biāo)志)，在T12、T13、L1間距離平行線右側(cè)外1 cm處再畫(huà)一直徑為2 cm圓弧線（與中國(guó)人民銀行2012年發(fā)行的5角硬幣等大）；對(duì)術(shù)口進(jìn)行常規(guī)的消毒鋪巾，沿標(biāo)記直線切開(kāi)皮膚，剝離右側(cè)的肌肉組織，松解斜方肌。先鈍性分離T13神經(jīng)根，向上在T11、T12肋下可發(fā)現(xiàn)T11和T12神經(jīng)根并作鈍性分離，同法分離出L1、L2神經(jīng)根；從脊神經(jīng)近端，用8-0線結(jié)扎切斷T11～L2神經(jīng)根0.5 cm，用5-0線逐層縫合斜方肌及皮下肌肉及皮膚，再對(duì)所畫(huà)圓弧線作切除全層皮膚及肌膜下2 mm深肌肉的深創(chuàng)面模型，失神經(jīng)支配創(chuàng)面模型的制備完畢，主要操作過(guò)程如圖1。

圖1 失神經(jīng)支配創(chuàng)面動(dòng)物造模的主要步驟

1.3 治療方案 術(shù)后3 d按青霉素常規(guī)用量給大鼠肌注以預(yù)防手術(shù)切口感染。高、中、低劑量組分別用相對(duì)應(yīng)劑量的龍血生肌溫敏凝膠均勻涂抹創(chuàng)面后包扎；對(duì)照組使用凡士林紗布覆蓋后包扎傷口；隔日換藥一次。

1.4 觀察指標(biāo)及方法 （1）大體觀察：建立動(dòng)物模型后直至創(chuàng)面愈合，觀察記錄剩余大鼠創(chuàng)面的出血、紅腫、肉芽生長(zhǎng)、滲出物等情況。（2）創(chuàng)面愈合時(shí)間：計(jì)算并記錄造模后各組大鼠創(chuàng)面愈合所需要的時(shí)間。（3）創(chuàng)面愈合率：在造模后的第4、7、11、14、21天共5個(gè)時(shí)點(diǎn)對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行等距離拍照，將圖像掃入計(jì)算機(jī)，用Image Pro Plus軟件計(jì)算創(chuàng)面愈合面積。計(jì)算創(chuàng)面愈合率=（原始面積－時(shí)間點(diǎn)面積）/原始面積。（4）于造模后第4、7、11、14、21天時(shí)，每組隨機(jī)切取4只大鼠創(chuàng)緣皮膚和肉芽組織樣本，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛固定48～72 h，酒精脫水，石蠟包埋切片，經(jīng)HE染色后在200倍顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，應(yīng)用PAS病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)視野中成纖維細(xì)胞進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 四組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)面均無(wú)明顯發(fā)炎、皮膚壞死等情況。高劑量組及中劑量組肉芽生長(zhǎng)情況相近，肉芽顆粒大，外觀新鮮，色澤鮮紅，輕觸易出血，第7天開(kāi)始明顯向創(chuàng)面中央聚集且上皮化加速，第10天肉芽填滿整個(gè)創(chuàng)面，第12天開(kāi)始出現(xiàn)上皮化；而低劑量組較之稍差，對(duì)照組肉芽生長(zhǎng)欠佳，肉芽顆粒較小，色澤蒼白，創(chuàng)面收縮速度較前三組慢。高、中、低劑量組滲出量較多，均為淺棕黃色，滲液較稀，第9天開(kāi)始逐漸減少，第11天僅有少量滲出；而對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中滲出量均少，創(chuàng)面較為干燥。

2.2 創(chuàng)面愈合時(shí)間比較 高劑量組及中劑量組愈合時(shí)間接近，均在第12天出現(xiàn)愈合的創(chuàng)面，到第14天兩組創(chuàng)面均痊愈，兩組數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低劑量組第13天開(kāi)始愈合，第15天痊愈，與高、中劑量組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組創(chuàng)面愈合慢，直至第23才有愈合的創(chuàng)面，高、中、低劑量組與對(duì)照組均有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1、圖2。

表1 創(chuàng)面愈合時(shí)間比較

圖2 四組創(chuàng)面愈合時(shí)間比較

2.3 創(chuàng)面愈合面積比較 在造模后的5五個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)，高劑量組及中劑量組愈合速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高、中、低劑量組比對(duì)照組愈合速度顯著加快（P＜0.01）。高、中、低劑量組在第4天時(shí)創(chuàng)面愈合面積無(wú)明顯差異（P＞0.05），在第7、11、14天時(shí)有顯著差異（P＜0.05），而到第21天時(shí)，高、中、低劑量組創(chuàng)面均已全部愈合，數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2、圖3。

表2 創(chuàng)面愈合面積比較

圖3 各組創(chuàng)面愈合面積百分比對(duì)比

2.4 創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)量比較 高、中、低劑量組的創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組有顯著差異（P＜0.01）。高、中、低劑量組均第11天達(dá)峰值，且高、中劑量組高于低劑量組及對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他時(shí)間點(diǎn)高、中、低劑量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)量比較

3 討 論

龍血生肌膏由古代斂瘡名方“金槍鐵扇散”加減化裁而來(lái)，由地龍、血竭、乳香、沒(méi)藥、黃柏、黃連、大黃、白芨、爐甘石等藥物成方，方中取地龍通絡(luò)、血竭化瘀止血及斂瘡生肌之效同為君藥，共奏活血生肌、通絡(luò)止痛之功；乳香、沒(méi)藥活血止痛，消腫生肌，為癰疽瘡瘍之要藥，二者為臣，可強(qiáng)君藥之療效，盡臣藥之本分；佐以黃柏、黃連清熱燥濕，解毒療瘡，大黃泄火解毒，破積行瘀，白芨收斂止血，消腫生肌，爐甘石斂瘡等，全方盡顯清熱解毒、活血化瘀、祛腐生肌之功效。而現(xiàn)代的藥理研究已證實(shí)地龍的提取液能促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化，大黃的大黃素有抑菌、抗炎、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)作用，血竭的血竭素、乳香的揮發(fā)油、沒(méi)藥的樹(shù)脂、血竭的血竭素、爐甘石的鈣離子、白芨的黏液質(zhì)等可加速炎性反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。研究發(fā)現(xiàn)，龍血生肌膏可調(diào)控神經(jīng)因素對(duì)失神經(jīng)支配創(chuàng)面有較明顯的促愈合作用，但在使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其存在某些不足，如有效成分顆粒粗大、使用時(shí)涂抹不勻、創(chuàng)面易有殘留、藥物起效不可控等。通過(guò)優(yōu)化劑型改善上述不足或許能進(jìn)一步提高龍血生肌膏的療效。溫敏凝膠目前在藥劑領(lǐng)域是一大研究熱點(diǎn)，其在使用之初是以液體形態(tài)存在的，通過(guò)人體體溫觸發(fā)其交聯(lián)系統(tǒng)而由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w凝膠，在局部形成一層具有密閉性的薄膜。據(jù)報(bào)道，溫敏凝膠劑型具有流動(dòng)性突出、使用方法簡(jiǎn)便、藥物局部停留時(shí)間長(zhǎng)、藥效發(fā)揮充分、緩釋作用強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。在本研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)階段，通過(guò)觀察龍血生肌溫敏凝膠在使用過(guò)程中的相關(guān)情況，發(fā)現(xiàn)其特性與既往報(bào)道相符。因此，溫敏凝膠能滿足龍血生肌膏劑型改進(jìn)的要求，且其緩釋作用又更利于藥效發(fā)揮，同時(shí)溫敏凝膠的緩釋系統(tǒng)能降低藥物副反應(yīng)，使藥物的安全性更好。因此，筆者設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，觀察不同濃度藥物對(duì)失神經(jīng)支配創(chuàng)面愈合的影響是其中關(guān)注的焦點(diǎn)。

王清任曾言：“藥味要緊，分量更要緊”，由此看出劑量是影響方藥療效的關(guān)鍵因素。又如吳鞠通所言：“治上焦如羽，非輕不舉；治中焦如衡，非平不安；治下焦如權(quán)，非重不沉”，說(shuō)明藥物的不同功效也是由劑量的大小決定的。目前，有大量藥劑學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床觀察研究均已證實(shí)藥物的劑量與療效有密切關(guān)聯(lián)[7-9]。張衛(wèi)紅等[10]對(duì)中藥量效關(guān)系的分析中提出：在藥物質(zhì)量保證、方藥組成明確的前提下，藥物的劑量對(duì)治療效果起決定性作用。然而，中藥復(fù)方的成分多、作用靶點(diǎn)廣泛，疾病種類(lèi)及個(gè)體差異等因素均對(duì)療效造成影響，注定其量效關(guān)系的復(fù)雜性。即在臨床研究中無(wú)法對(duì)復(fù)方中的每一個(gè)成分進(jìn)行量化研究。為解決這個(gè)棘手的問(wèn)題，有學(xué)者提出了“劑量閾”[11]研究方法，先計(jì)算出半飽和量（[D]0.5），再算最佳的劑量閾范圍（[D]0.2～[D]0.8）而得到方藥顯效的劑量閾值（[D]0.2）。該方法仍處于探索階段，目前未有明確結(jié)論，但有一定的實(shí)用價(jià)值。通過(guò)借鑒該計(jì)算方法，結(jié)合藥物特性及臨床需求本研究最后將龍血生肌溫敏凝膠分別制備成高、中、低三種不同劑量進(jìn)行動(dòng)物研究。

方藥量效關(guān)系的表現(xiàn)形式是多樣化的，有量增效增者，有量增效減者，亦有表現(xiàn)量效多波折者[12]。理想藥物劑量是指用最小的藥量達(dá)到最佳的治療效果。而盲目提高劑量可能無(wú)法增效，甚至起到量增效減的作用。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)是實(shí)踐性很強(qiáng)的學(xué)科，以臨證用藥顯效與否為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合中藥復(fù)方的復(fù)雜性，有學(xué)者提出“整體效”[13]的研究方法，即是否有效直接觀察患者用藥后的整體效果。在本研究中，以創(chuàng)面大體情況、愈合時(shí)間及愈合率作為觀察“整體效”的指標(biāo)，通過(guò)比較使用高、中、低三種不同劑量藥物的“整體效”而得出哪一劑量藥物療效最佳的結(jié)論。這種研究方法符合中醫(yī)傳統(tǒng)的思維，也具備實(shí)驗(yàn)研究的科學(xué)性。

創(chuàng)面愈合需要大量肉芽組織增生才能完成，而失神經(jīng)支配創(chuàng)面在愈合過(guò)程中表現(xiàn)出細(xì)胞增殖低下的病理改變，嚴(yán)重阻礙了愈合的速率。研究表明[14-15]，成纖維細(xì)胞大量增殖能加速創(chuàng)面基質(zhì)沉淀及再上皮化速度，且細(xì)胞增殖標(biāo)記抗體主要集中在上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中，故而肉芽基質(zhì)在分子細(xì)胞學(xué)層面又以成纖維細(xì)胞為代表。本研究結(jié)果提示高、中、低劑量組均比對(duì)照組的成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著增多，說(shuō)明龍血生肌溫敏凝膠對(duì)失神經(jīng)支配創(chuàng)面有明顯的促愈合作用，而在增殖峰期，高、中劑量組比低劑量組的成纖維細(xì)胞顯著增多，說(shuō)明高、中劑量組的藥物劑量更佳。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中分別用高、中、低三種劑量龍血生肌溫敏凝膠治療大鼠失神經(jīng)支配創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)高、中劑量組的愈合時(shí)間及愈合率相近，均比低劑量組及對(duì)照組的更佳，且大體觀察中也是中、高劑量組肉芽生長(zhǎng)及滲出最佳，而組間無(wú)顯著區(qū)別，從宏觀層面證明藥物的臨床療效。再通過(guò)觀察成纖維細(xì)胞增殖數(shù)量變化，從微觀層面說(shuō)明藥物的顯效與促進(jìn)細(xì)胞增殖有明顯關(guān)聯(lián)，最后通過(guò)比較這四組的整體效果，不難發(fā)現(xiàn)高、中劑量龍血生肌溫敏凝膠組的療效最佳，且最為接近理想藥物劑量。值得期待的是，將來(lái)可應(yīng)用中劑量龍血生肌溫敏凝膠進(jìn)行更深入的研究，為中藥劑型改進(jìn)提供思路和更多依據(jù)。