氟[18F]化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查及無(wú)菌檢查方法建立

孫祥敏，駱 丹，杜建冬，吳艷麗，張 云，郭飛虎

(原子高科股份有限公司，北京 102413)

氟[18F]化鈉注射液是一種用于骨顯像的正電子放射性藥物。該藥物由靜脈注射進(jìn)入血液系統(tǒng)后，可選擇性的吸附于骨骼系統(tǒng)，是一種優(yōu)良的骨顯像劑，能夠高靈敏度、高特異性地對(duì)腫瘤骨轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期診斷和檢測(cè)復(fù)發(fā)[1-3]，也能夠有效鑒別破裂斑塊和高風(fēng)險(xiǎn)的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[4]。目前我國(guó)并未有該產(chǎn)品上市，因此對(duì)該產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)研究具有較廣闊的市場(chǎng)前景和社會(huì)意義。新藥質(zhì)量研究作為新藥開(kāi)發(fā)的重要組成部分，是保障藥品安全性、有效性的基礎(chǔ)。細(xì)菌內(nèi)毒素和微生物進(jìn)入人體后會(huì)引起嚴(yán)重的后果，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)鹚劳鯷5-6]，因此細(xì)菌內(nèi)毒素檢查和無(wú)菌檢查對(duì)注射劑的安全性尤為重要。目前國(guó)內(nèi)尚未有氟[18F]化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查和無(wú)菌檢查相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和具體檢驗(yàn)方法的收載，因此，對(duì)該產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查、無(wú)菌檢查的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和具體檢驗(yàn)方法的研究對(duì)保障用藥安全具有十分重要的作用。

氟[18F]化鈉注射液為放射性藥品，放射性藥品具有生產(chǎn)批量小、樣品存在放射性等特點(diǎn)，要求檢驗(yàn)快速有效[7]，另外還需考慮操作時(shí)間對(duì)人員輻照劑量的影響和放射性廢物處理等因素。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查宜采用凝膠限度法，無(wú)菌檢查宜采用直接接種法。本文對(duì)氟[18F]化鈉注射液產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查和無(wú)菌檢查方法進(jìn)行研究，建立適宜于該產(chǎn)品的檢驗(yàn)方法，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行控制，保障用藥安全。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

TAL-40D型試管恒溫儀：湛江安度斯生物有限公司；XW-80A型旋渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BSC-1600IIB2型生物安全柜：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；RT1600S型隔離器：浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司；YXQ-LS-100SII型壓力蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱(BSP-250型、SPX-250C型)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；MP1100B型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 主要材料與試劑

氟[18F]化鈉注射液：原子高科股份有限公司提供；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：80 EU·支-1，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水)：湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品；鱟試劑：0.5 EU·mL-1，湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品(批號(hào)1406032)和廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司產(chǎn)品(批號(hào)150103)；菌珠：103·顆-1，4代，北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品；培養(yǎng)基：北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品；0.9%氯化鈉注射液：石家莊四藥有限公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法

2.1.1細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L) 按公式L=K/M[8]計(jì)算。其中，K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg·h)；M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，人均體重按60 kg計(jì)算，注射時(shí)間不足1 h，按1 h時(shí)計(jì)算。

2.1.2鱟試劑靈敏度復(fù)核 取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用1 mL BET水復(fù)溶后，在旋渦混合器上混勻15 min，逐步稀釋制備2λ、λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(λ為鱟試劑靈敏度標(biāo)示值)，每步稀釋均混勻30 s以上。每批鱟試劑，各取18支進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中16支分別用0.1 mL BET水復(fù)溶，然后分別加入0.1 mL濃度為2λ、λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行做4支；剩余2支，每支加入0.2 mL BET水，作為陰性對(duì)照(NC)?；靹?，(37±1) ℃恒溫培養(yǎng)(60±2) min。若2λ管均為陽(yáng)性(+)，0.25λ管均為陰性(-)，NC均為(-)時(shí)，實(shí)驗(yàn)有效。計(jì)算鱟試劑靈敏度測(cè)定值λc=antilg(∑X/4)(X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值)。λc在0.5λ～2λ范圍內(nèi)時(shí)，該批鱟試劑符合規(guī)定，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

2.1.3最大有效稀釋倍數(shù)(MVD) 按公式MVD=cL/λ計(jì)算。其中c為供試品溶液濃度，當(dāng)L以EU/mL表示時(shí)，c為1.0 mL/mL。

2.1.4預(yù)干擾實(shí)驗(yàn) 選用0.5 EU·mL-1的鱟試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將供試品溶液以BET水稀釋至不同濃度。供試品溶液組(NPC)，每個(gè)濃度平行兩管，每管以0.1 mL BET水復(fù)溶鱟試劑，然后加入0.1 mL供試品溶液；供試品陽(yáng)性對(duì)照組(PPC)，每個(gè)供試品濃度平行兩管，每管以0.1 mL 2λ細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶鱟試劑，然后加入0.1 mL供試品溶液；陽(yáng)性對(duì)照(PC)，平行兩管，每管以0.1 mL BET水復(fù)溶鱟試劑，然后加入0.1 mL 2λ細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；陰性對(duì)照組(NC)，平行兩管，每管加入0.2 mL BET水。混勻，(37±1) ℃恒溫培養(yǎng)(60±2) min。當(dāng)NPC、NC平行管均為陰性(-)，PC均為陽(yáng)性(+)時(shí)，實(shí)驗(yàn)有效。PPC中第一個(gè)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的濃度即初步將其判斷為樣品的無(wú)干擾濃度。

2.1.5干擾實(shí)驗(yàn) 以兩個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[9]。對(duì)于每批鱟試劑，供試品溶液組平行兩管，每管用0.1 mL BET水復(fù)溶鱟試劑，然后加入0.1 mL供試品溶液；干擾實(shí)驗(yàn)系列，每管加入0.1 mL供試品溶液，然后加入0.1 mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(共四個(gè)濃度2λ、λ、0.5λ、0.25λ)，每個(gè)濃度平行四管；鱟試劑標(biāo)示靈敏度對(duì)照系列，每管用0.1 mL BET水復(fù)溶鱟試劑，然后加入0.1 mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(共四個(gè)濃度2λ、λ、0.5λ、0.25λ)，每組平行兩管；陰性對(duì)照組平行兩管，每管加入0.2 mL BET水。(37±1) ℃恒溫培養(yǎng)(60±2) min。按公式計(jì)算BET水和供試品稀釋液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Es和Et)。Es=antilg(∑Xs/2)，Et=antilg(∑Xt/4)。Es和Et值均在0.5λ～2λ范圍內(nèi)時(shí)，判定供試品在該濃度下無(wú)干擾。

2.1.6氟[18F]化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 采用建立好的內(nèi)毒素檢查方法，對(duì)氟[18F]化鈉注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)。對(duì)于每批次供試品的檢查，取8管鱟試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中2管為供試品溶液組(S)，每管以0.1 mL BET水復(fù)溶鱟試劑，然后加入0.1 mL供試品溶液；2管為供試品陽(yáng)性對(duì)照組(PPC)，每管加入0.1 mL供試品溶液，然后加入0.1 mL濃度為2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；2管為陽(yáng)性對(duì)照組(PC)，每管用0.1 mL BET水復(fù)溶鱟試劑，然后加入0.1 mL濃度為2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；2管為陰性對(duì)照組(NC)，每管加入0.2 mL BET水。(37±1) ℃恒溫培養(yǎng)(60±2) min。NC平行管均為(-)，PPC、PC平行管均為(+)，實(shí)驗(yàn)有效；S均為(-)，判供試品符合規(guī)定。

2.2 無(wú)菌檢查方法

2.2.1菌液制備 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌珠均以1.1 mL 0.9%氯化鈉注射液溶解，靜置約30 s，旋渦混合5～10 s，然后取1 mL菌液加入9 mL 0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行10倍稀釋。

2.2.2菌落計(jì)數(shù) 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌的計(jì)數(shù)采用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；白色念珠菌、黑曲霉的計(jì)數(shù)采用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。每皿加入0.3 mL菌液，澆注20 mL約45 ℃的培養(yǎng)基，混勻，冷卻凝固后，倒置培養(yǎng)，每種實(shí)驗(yàn)菌平行制備兩個(gè)平板。另以稀釋液代替菌液同法操作作為陰性對(duì)照。生孢梭菌放入?yún)捬醮袇捬跖囵B(yǎng)。接種后的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板置33 ℃培養(yǎng)3 d，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板置24 ℃培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。

2.2.3培養(yǎng)基適用性檢查 培養(yǎng)基適用性檢查包括無(wú)菌性檢查和靈敏度檢查[10]。取11支裝量為12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(FTM)，分別接種0.3 mL的金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、銅綠假單胞菌菌液各2支，另5支不接種作為培養(yǎng)基無(wú)菌性檢查用，加菌管33 ℃培養(yǎng)3 d，無(wú)菌檢查管培養(yǎng)14 d；取11支裝量為9 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)，分別接種0.3 mL的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌菌液、黑曲霉孢子懸液各2支，另5支不接種作為培養(yǎng)基無(wú)菌性檢查用，加菌管24 ℃培養(yǎng)5 d，無(wú)菌檢查管培養(yǎng)14 d。當(dāng)加菌培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，無(wú)菌性檢查管均無(wú)菌生長(zhǎng)，可判培養(yǎng)基適用性檢查均符合規(guī)定。

2.2.4方法適用性實(shí)驗(yàn)和產(chǎn)品無(wú)菌性檢查 取3批氟[18F]化鈉注射液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于每批產(chǎn)品的無(wú)菌檢查方法適用性實(shí)驗(yàn)，取6管裝量為7.5 mL的FTM，分別接入小于100 cfu的金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、大腸埃希菌各2管；取6管裝量為7.5 mL的TSB，分別接入小于100 cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接種0.2 mL的供試品，另一管不接種作為對(duì)照。另取FTM、TSB各2管，每管接入0.2 mL的供試品作為供試品的無(wú)菌檢查。方法適用性用FTM管置33 ℃培養(yǎng)3 d，TSB管置24 ℃培養(yǎng)5 d，無(wú)菌檢查管培養(yǎng)14 d，逐日觀察結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照管生長(zhǎng)良好，與陽(yáng)性對(duì)照管相比，供試品陽(yáng)性對(duì)照管均生長(zhǎng)良好，則該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)干擾。無(wú)菌檢查管溶液澄清、無(wú)菌生長(zhǎng)，則供試品無(wú)菌檢查符合規(guī)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法

3.1.1細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L) 氟[18F]化鈉注射液最大給藥體積為10 mL，注射時(shí)間小于1 h，計(jì)算M=10 mL/(60 kg·h)；放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg·h)，計(jì)算L=K/M=15 EU·mL-1。氟[18F]化鈉注射液的L定為15 EU·mL-1。

3.1.2鱟試劑靈敏度復(fù)核 對(duì)批號(hào)為1406032和150103，λ為0.5 EU/mL的鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1。2批鱟試劑的λc均在0.5～2.0λ范圍內(nèi)，鱟試劑靈敏度復(fù)核均符合規(guī)定，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

3.1.3最大有效稀釋倍數(shù)(MVD) 目前用于藥品檢驗(yàn)的鱟試劑靈敏度一般在0.03～0.5 EU·mL-1之間，氟[18F]化鈉注射液的L=15 EU·mL-1，按公式MVD=cL/λ計(jì)算所對(duì)應(yīng)的MVD為30到480倍(表2)。

3.1.4預(yù)干擾實(shí)驗(yàn) 取一批次氟[18F]化鈉注射液，用BET水稀釋制成10倍、30倍、60倍、120倍的供試品溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果列于表3。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，將供試品稀釋10倍后對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾作用。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核Table 1 The confirmation of the labelled lysate sensitivity

表2 最大有效稀釋倍數(shù)Table 2 The maximum valid dilution

表3 氟[18F]化鈉注射液預(yù)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of interference advance tests of Na18F

3.1.5干擾實(shí)驗(yàn) 將連續(xù)生產(chǎn)的三批氟[18F]化鈉注射液稀釋10倍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各批次放射性濃度均合格(合格標(biāo)準(zhǔn)為0.37～7.40 GBq/mL)，放射性濃度分別為1.59 GBq/mL(20160406-1)、1.03 GBq/mL(20160407-1)、0.93 GBq/mL(20160407-2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表4。各組Es和Et值均在0.5λ～2λ范圍內(nèi)，將氟[18F]化鈉注射液稀釋10倍，對(duì)不同廠家的鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)均無(wú)干擾作用，可以采用將供試品至少稀釋10倍進(jìn)行該產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

表4 氟[18F]化鈉注射液干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of interference tests of Na18F

3.1.6氟[18F]化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 采用0.5 EU·mL-1的鱟試劑，將供試品直接稀釋30倍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3批次氟[18F]化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果均符合規(guī)定。

表5 氟[18F]化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Table 5 Results of bacterial endotoxin test of Na18F

3.2 無(wú)菌檢查方法

3.2.1菌落計(jì)數(shù) 對(duì)所采用的商業(yè)菌株進(jìn)行濃度測(cè)定，每種實(shí)驗(yàn)菌取0.3 mL的10倍稀釋液進(jìn)行計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)菌的接種體積均采用0.3 mL時(shí)，接種菌量均小于100 cfu。

表6 菌液計(jì)數(shù)結(jié)果Table 6 Results of colony counting

3.2.2培養(yǎng)基適用性檢查 對(duì)無(wú)菌檢查用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查，無(wú)菌性檢查各管均無(wú)菌生長(zhǎng)，靈敏度檢查各管均生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)基適用性檢查均符合規(guī)定，可用于供試品的檢驗(yàn)。

3.2.3方法適用性實(shí)驗(yàn)和產(chǎn)品無(wú)菌性檢查 取3批氟[18F]化鈉注射液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表7、表8。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照管相比，三批含供試品的培養(yǎng)基管中各實(shí)驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，接種0.2 mL供試品至7.5 mL培養(yǎng)基管中進(jìn)行無(wú)菌檢查時(shí)無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)。對(duì)三批產(chǎn)品進(jìn)行無(wú)菌檢查均合格。

表7 方法適用性實(shí)驗(yàn)Table 7 The method suitability test

表8 無(wú)菌檢查Table 8 The sterility test

4 結(jié)論

本研究根據(jù)藥品劑型和用藥情況，制定了內(nèi)毒素檢查和無(wú)菌檢查質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中細(xì)菌內(nèi)毒素限值為15 EU·mL-1，無(wú)菌檢查應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。建立了氟[18F]化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法和無(wú)菌檢查方法，可用于該產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗(yàn)、對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行控制，確保用藥安全。

氟[18F]化鈉注射液采用凝膠限度法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)時(shí)，須將供試品稀釋至少10倍進(jìn)行檢驗(yàn)。該法操作簡(jiǎn)便、快捷，且成本較低，是目前放射性藥品常用的檢測(cè)方法。

氟[18F]化鈉注射液的無(wú)菌檢查可以采用直接接種0.2 mL供試品至7.5 mL培養(yǎng)基管中進(jìn)行無(wú)菌檢查的方法。該方法操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)生廢物量小，適宜于該產(chǎn)品的無(wú)菌檢查。

在方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，均為生產(chǎn)結(jié)束后，即時(shí)取樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，射線對(duì)檢驗(yàn)影響較小。該產(chǎn)品屬正電子類放射性藥品，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查和無(wú)菌檢查可進(jìn)行追溯性檢驗(yàn)[10]，為避免檢驗(yàn)人員受到過(guò)量電離輻射，可將樣品進(jìn)行適當(dāng)衰變后進(jìn)行檢驗(yàn)。