葉酸靶向超聲納米造影劑的制備及其細(xì)胞孵育裝置的設(shè)計

李 瑩，劉 威，廖秀玉（通訊作者）

（1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 福建 福州 350005）

（2福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院麻醉科 福建 福州 350005）

癌癥近年來已經(jīng)成為臨床上危害全世界人類健康的主要疾病之一，而癌細(xì)胞被檢測出的越早，則治愈的可能性就越高。研究表明癌癥可以實現(xiàn)早期檢測，則將有30%的癌癥患者得以生存，超聲分子成像技術(shù)近年來得到長足的發(fā)展。葉酸及其還原產(chǎn)物是真核細(xì)胞核酸合成過程必不可少的原料，可特異性地與細(xì)胞表面糖基磷脂酰肌醇連接的葉酸受體結(jié)合。葉酸受體在正常細(xì)胞表面的表達(dá)非常有限，而在腫瘤細(xì)胞表面常存在過表達(dá)，如宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌等，葉酸受體的特異性分布為腫瘤的靶向造影和靶向治療提供了可能性，也極大程度地降低了對正常組織的影響[1]。本實驗采用價格低廉、無細(xì)胞毒性、生物相容性較好的N-軟脂酰基殼聚糖（N-palmitoyl chitosan，PLCS）共價連接葉酸制備了葉酸靶向超聲納米造影劑[2]，粒徑均勻，靶向性可靠。本實驗還成功實現(xiàn)葉酸納泡與葉酸受體高表達(dá)的Hela細(xì)胞的共孵育，望用其作為分子探針對葉酸受體高表達(dá)的腫瘤進(jìn)行超聲分子成像。

1 材料與儀器

剪切儀（IKA ULTRA-TURRAX T25，德國IKA公司）；全氟丙烷（廣東佛山捷和氣體有限公司）；馬爾文粒度分析儀（ZS Nano S，英國Malvern公司）；共聚焦成像系統(tǒng)（FluoView FV10i，Olympus，日本）；透射電鏡（FEI TECNAI SPIRIT G2，美國）；掃描電鏡（FEI QUANTA 200，美國）；35mm×12mm玻底培養(yǎng)皿（耐思生物科技有限公司，中國）；100mm×20mm培養(yǎng)平皿（康寧，中國）；25cm2透氣培養(yǎng)瓶（康寧，中國）；HeLa細(xì)胞（行知生物科技有限公司，中國）；葉酸（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院提供）；DMSO（PanEra，中國）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma，美國）；DiO 細(xì)胞膜綠色熒光探針（碧云天，中國）；RPMI 1640培養(yǎng)基（gibco，美國）；胎牛血清（hyclone，南美洲）；0.25%胰酶（gibco，美國）；N-軟脂?；鶜ぞ厶?葉酸-N-軟脂酰基殼聚糖（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院提供）。

2 方法

2.1 納泡制備

2.1.1普通N-軟脂?；鶜ぞ厶羌{泡/葉酸-N-軟脂?；鶜ぞ厶羌{泡（以下簡稱C-NBs/F-NBs）的制備

將適量N-軟脂?；鶜ぞ厶?葉酸-N-軟脂?；鶜ぞ厶堑饶げ牧霞尤?0ml蒸餾水中，在50℃水浴條件下輕輕攪拌至完全溶解，置入50ml注射器內(nèi)，注射器頭端以三通管連通C3F8氟碳?xì)怏w。將剪切儀置人注射器內(nèi)至液面下2.5cm處，在通入氟碳?xì)怏w的同時，以剪切儀第5檔（21000r/min）剪切40s后，轉(zhuǎn)第6檔（24000r/min）剪切7min。納泡制備后分裝入青霉素瓶中，填充氟碳?xì)怏w并密封瓶口，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 DiO熒光N-軟脂?；鶜ぞ厶羌{泡（DiOencapsulated NBs）制備

為了在熒光下更好地觀察N-軟脂?；鶜ぞ厶羌{泡（NBs），我們將熒光探針DiO連接到NBs表面，制備DiO-encapsulated NBs，方法如下：將適量N-軟脂?；鶜ぞ厶腔蛉~酸-N-軟脂酰基殼聚糖加入20ml蒸餾水中，在50℃水浴條件下輕輕攪拌至完全溶解。下述步驟盡量避光操作：取適量DiO溶解于DMSO中（1mg/ml），用注射器吸取DiO/DMSO溶液，逐滴緩慢加入溶解的N-軟脂?；鶜ぞ厶腔蛉~酸-N-軟脂?；鶜ぞ厶侨芤褐校瑫r輕輕攪拌使DiO與殼聚糖充分混合；將上述溶液置入50ml注射器內(nèi)，注射器頭端以三通管連通C3F8氟碳?xì)怏w。以下步驟與普通納泡制備方法相同，將裝有熒光納泡的青霉素瓶以錫紙包裹后放于4℃避光保存。

2.2 納泡基本特征的觀察和測定

納泡制備后24小時進(jìn)行下列檢測：將納泡輕輕搖勻，取一小滴加至載玻片上，普通光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察納泡的外觀形態(tài)；以透射電鏡（Transmission electron microscopy，TEM）檢測納泡之前，先進(jìn)行甲胺鎢酸鹽染色：納泡混懸液滴在表面鍍了碳膜的銅網(wǎng)（200目）上，自然干燥5min后，以濾紙輕輕吸干銅網(wǎng)上殘余的液體，然后把銅網(wǎng)浸泡在甲胺鎢酸鹽的緩沖溶液中，染色1min，清水中漂1～2次，室溫下晾數(shù)分鐘，透射電鏡下觀察納泡的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；掃描電鏡（Scanning electron microscopy，SEM）觀察納泡表面形貌：納泡混懸液滴在表面鍍了碳膜的銅網(wǎng)（200目）上，室溫下干燥，鍍以鈀-鉑金屬膜；共聚焦顯微鏡下觀察F-NBs及C-NBs，明確葉酸是否成功地連接至殼聚糖納泡表面：納泡懸液稀釋后滴于載玻片上，以蓋玻片覆蓋，共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察，激發(fā)光波長為365nm，發(fā)射波長為450nm；馬爾文粒度分析儀檢測納泡的大?。?00μl納泡稀釋至5ml，倒入檢測池中，以532nm的激光垂直照射樣品池，檢測器與入射光的角度為90°；Zeta電位儀分析納泡表面電位：納泡混懸液用去離子水稀釋；細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)納泡的濃度。

2.3 納泡與細(xì)胞共孵育

本實驗中HeLa細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，可通過如下方法實現(xiàn)納泡與細(xì)胞的共孵育。

接種于25cm2透氣培養(yǎng)瓶的細(xì)胞：①細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)液，PBS沖洗后加入適量納泡，以RPMI 1640培養(yǎng)基加滿整個培養(yǎng)瓶以排盡瓶內(nèi)氣體，擰緊瓶蓋，上下顛倒數(shù)次使納泡在培養(yǎng)基中均勻分布，避免劇裂振蕩；②將上述培養(yǎng)瓶倒置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，納泡上浮后可與細(xì)胞充分接觸，達(dá)到孵育的目的（圖1A）。

接種于35mm×12mm玻底培養(yǎng)皿的細(xì)胞：①準(zhǔn)備一個100mm×20mm培養(yǎng)平皿，加入適量的培養(yǎng)基，再加入適量的納泡，充分混勻；②細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)液，PBS沖洗，將玻底皿倒扣于前述100mm×20mm培養(yǎng)平皿，以自制抽氣裝置將玻底皿內(nèi)氣體抽盡使細(xì)胞完全浸潤于培養(yǎng)基中，如圖1B～D所示。

圖1 NBs與細(xì)胞共孵育的裝置（A：接種于25cm2透氣培養(yǎng)瓶的貼壁細(xì)胞與NBs共孵育示意圖；B：自制抽氣裝置，將輸液針頭折彎形成約120°夾角，如紅色圓圈所示；C：玻底皿內(nèi)氣體被抽出前；D：玻底皿內(nèi)氣體被抽出后）。

2.4 共聚焦成像

將接種于玻底培養(yǎng)皿的HeLa細(xì)胞與DiO-encapsulated F-NBs孵育30min，去除培養(yǎng)基，PBS沖洗，再次加入新鮮的培養(yǎng)基，在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞與納泡的情況。

3 結(jié)果

3.1 納泡外觀形態(tài)和理化特性

F-NBs/C-NBs/DiO-encapsulated NBs制備后呈淡黃色/白色/橙黃色的混懸液，靜置24h后，上層為約2～3mm的淡黃色/白色/橙黃色納泡聚集層，下層為透明溶液（圖2-1A），輕輕搖勻后造影劑呈均勻毛玻璃樣混懸液（圖2-1B）。普通光學(xué)顯微鏡觀察，納泡呈透亮球形，粒徑小，大小較均一，分布均勻，彼此無聚集現(xiàn)象（圖2-1C），熒光顯微鏡觀察，DiO-encapsulated NBs呈綠色圓環(huán)狀（圖2-1D）。透射電鏡圖（圖2-1E）及掃描電鏡圖（圖2-1F）清楚地顯示N-軟脂?；鶜ぞ厶羌{泡的內(nèi)部結(jié)構(gòu)（殼聚糖外殼+中心空腔）和表面形貌。

共聚焦顯微鏡下觀察F-NBs及C-NBs，激發(fā)光波長為365nm，發(fā)射波長為450nm，F(xiàn)-NBs表面帶藍(lán)色熒光，熒光分布均勻，而C-NBs表面無熒光，說明靶分子葉酸成功連接到納泡表面，且葉酸分布均勻，F(xiàn)-NBs構(gòu)建成功（圖2-2）。

馬爾文粒度分析儀測得納泡平均粒徑為（617±12）nm（圖2-3A），Zeta電位儀測定表面電位為（55.3±2.1）mV（圖2-3B），計數(shù)板計算納泡濃度約為（7.2±0.6）×109/ml。

圖2-1 納泡外觀形態(tài)（A：NBs制備后靜置24小時大體形態(tài)；B：NBs搖勻后大體形態(tài)，A、B圖由左至右依次為F-NBs、C-NBs及DiO-encapsulated F-NBs；C：NBs在普通顯微鏡下所見形態(tài)；D：DiOencapsulated F-NBs在熒光顯微鏡下所見形態(tài)；E、F：NBs的透射電鏡圖及掃描電鏡圖；C、D、E、F圖左上角均為局部放大圖）。

圖2-2 共聚焦顯微鏡下觀察F-NBs及C-NBs（A：F-NBs表面呈藍(lán)色熒光，說明葉酸已成功連接到NBs表面；B：F-NBs在明場下所見；C：C-NBs表面無熒光；D：C-NBs在明場下所見）。

圖2-3 納泡粒徑及表面電位分布（A：馬爾文粒度分析儀所測得納泡的粒徑分布；B：Zeta電位儀所測得納泡的表面電位）。

3.2 DiO-encapsulated F-NBs與Hela細(xì)胞共孵育后的共聚焦成像

在共聚焦顯微鏡下可見，Hela細(xì)胞形態(tài)正常，分布均勻，細(xì)胞間緊密結(jié)合，可見較多DiO-encapsulated F-NBs粘附在細(xì)胞表面，部分散在分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，納泡結(jié)構(gòu)完整（圖3A、3B）。

圖3 DiO-encapsulated F-NBs與Hela細(xì)胞共孵育后的共聚焦成像

4 結(jié)論

近年來，臨床上惡性腫瘤發(fā)病率一直有升高的趨勢，而且惡性腫瘤致死率高，如何能在早期診斷中確診，如何做到靶向治療是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點。本實驗將葉酸共價連接到N-軟脂?；鶜ぞ厶巧?，結(jié)合穩(wěn)定，F(xiàn)-NBs制備過程中葉酸不易丟失和改變構(gòu)象，可良好解決靶向造影劑生物連接中配體產(chǎn)率和配體靶向活性的問題。實驗材料葉酸、殼聚糖來源豐富、價格便宜，且無毒副作用，生物相容性好。

研究表明疾病狀態(tài)時內(nèi)皮細(xì)胞間隙會出現(xiàn)變化，如腫瘤新生血管的間隙較大，大部分腫瘤新生血管允許700nm以下的粒子通過[3]，F(xiàn)-NBs粒徑小，可以通過腫瘤血管內(nèi)皮間隙進(jìn)入血管外組織間隙，而葉酸與葉酸受體有效特異的結(jié)合，使F-NBs有望作為分子探針對葉酸受體高表達(dá)的腫瘤進(jìn)行靶向超聲分子成像[4]。

微泡/納泡具有良好的藥物和基因包載功能，可設(shè)計單靶點、多靶點、多功能和多模式的分子探針等。因此，有效跨越血管內(nèi)皮屏障的靶向納泡的成功構(gòu)建，為使超聲分子成像技術(shù)能全面實現(xiàn)在活體中從分子水平定位、定量和可視化研究疾病發(fā)生和發(fā)展的規(guī)律，以及為疾病的早期預(yù)警診斷和干預(yù)效果監(jiān)測提供了可能。以靶向超聲納泡為基礎(chǔ)可設(shè)計出載藥靶向納泡，以及可設(shè)計出具有診斷和治療功能的載藥靶向微泡/納泡/納米粒復(fù)合劑，具有靶向治療的潛在價值。