人工接種腸膜明串珠菌對(duì)發(fā)酵櫻菜中的化學(xué)成分和微生物數(shù)量的影響

劉笑笑,金永梅,李姝睿,李勝男,王嵩,魏春雁*

1(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春， 130033) 2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(長(zhǎng)春)，吉林 長(zhǎng)春， 130033)

朝鮮族泡菜是極具民族特色的發(fā)酵型泡菜，具有獨(dú)特濃厚的風(fēng)味且富含乳酸菌和乳酸[1-3],深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。目前，朝鮮族泡菜的生產(chǎn)方式主要是自然發(fā)酵，但存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、亞硝酸鹽含量高等缺點(diǎn)[4]。人工接種發(fā)酵朝鮮族泡菜是一種趨勢(shì)，也是發(fā)酵技術(shù)現(xiàn)代化的標(biāo)志，而其達(dá)到快速、穩(wěn)定和優(yōu)質(zhì)的關(guān)鍵在于菌種[5]。

腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)是自然發(fā)酵產(chǎn)品中的優(yōu)勢(shì)菌[6]，對(duì)人和動(dòng)物均無(wú)毒性和致病作用，具有抗氧化、改善產(chǎn)品風(fēng)味和拮抗致病菌能力[7-8]。因此，將其應(yīng)用于朝鮮族泡菜中，對(duì)人工接種生產(chǎn)方式進(jìn)行基礎(chǔ)研究具有重要意義。

櫻菜是延邊朝鮮族人種植的一種特色蔬菜，生長(zhǎng)期短且具有季節(jié)性，味道適口，營(yíng)養(yǎng)豐富，以其為原料制成朝鮮族泡菜，不僅提高了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還改善了其貯藏性[3]。發(fā)酵櫻菜口感源于發(fā)酵過(guò)程中微生物代謝而發(fā)生的復(fù)雜變化，而各種化學(xué)成分以及微生物數(shù)量變化對(duì)發(fā)酵櫻菜營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、口感和貯藏性起著至關(guān)重要的作用[9-10]。

本研究將具有降解亞硝酸鹽功能的腸膜明串珠菌人工接種制作發(fā)酵櫻菜，對(duì)比體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量、體積分?jǐn)?shù)為5%接種量和自然發(fā)酵3種發(fā)酵條件下發(fā)酵第0、7、14、21、28、35、42天的發(fā)酵櫻菜中亞硝酸鹽含量、還原糖含量、氨基酸態(tài)氮含量、總酸、pH、菌落總數(shù)、大腸菌群、乳酸菌數(shù)、酵母菌數(shù)變化情況，為人工接種生產(chǎn)朝鮮族泡菜提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

櫻菜，挑選無(wú)腐爛、無(wú)病蟲(chóng)害且成熟的櫻菜，延邊州延吉市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)售。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)JNZB003,由本實(shí)驗(yàn)室從延邊朝鮮傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜中分離，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，編號(hào)為CCTCC No：M 2018129。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

MRS固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar,PCA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA),青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violet centre red bile agar,VRBA),北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；NaCl(分析純),北京化工廠；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅(分析純),天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；NaNO2(化學(xué)純),天津市化學(xué)試劑一廠；對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 儀器設(shè)備

PRESOCLAVE-Ⅱ高壓滅菌器,西班牙 SELECTA；BT 124S電子天平,中國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；VF 611超純水系統(tǒng)，德國(guó)SARTORIUS；T6新世紀(jì)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DNP-9162BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；S210 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 朝鮮族傳統(tǒng)發(fā)酵櫻菜制作

初腌：挑選無(wú)腐爛、無(wú)病蟲(chóng)害的成熟櫻菜，將其在通風(fēng)良好的室外晾曬，待櫻菜變黃，清洗干凈，用鹽進(jìn)行初腌，待腌蔫。

備料：將辣椒粉、姜粉、蒜沫、蘋(píng)果梨塊等用少量水拌勻，備用。

自然發(fā)酵：每次取少量初腌好的櫻菜，用備料涂勻后，放入發(fā)酵罐中，蓋好蓋子，置于冷藏箱(4 ℃)進(jìn)行發(fā)酵。

人工接種發(fā)酵：在備料里混勻菌種，接種菌液中活菌數(shù)在108CFU/mL以上，分別以體積分?jǐn)?shù)為1%和5%接種量，放入發(fā)酵罐中，蓋好蓋子，置于冷藏箱(4 ℃)進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分為3組，自然發(fā)酵組、體積分?jǐn)?shù)1%接種組、體積分?jǐn)?shù)5%接種組。每組重復(fù)3個(gè)，其中自然發(fā)酵組為對(duì)照，均在4 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵第0、7、14、21、28、35、42天的發(fā)酵櫻菜中的亞硝酸鹽含量、還原糖含量、氨基酸態(tài)氮含量、總酸、pH、菌落總數(shù)、大腸菌群、乳酸菌數(shù)、酵母菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 測(cè)定方法

1.2.3.1 亞硝酸鹽含量

根據(jù)GB 5009.33—2010《食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測(cè)定》，采用鹽酸萘乙二胺法進(jìn)行測(cè)定[11]。

1.2.3.2 還原糖含量

根據(jù)GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測(cè)定》，采用3,5-二硝基水楊酸比色法進(jìn)行測(cè)定[12]。

1.2.3.3 氨基酸態(tài)氮含量

根據(jù)GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》，采用甲醛滴定法進(jìn)行測(cè)定[13]。

1.2.3.4 總酸含量

根據(jù)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》，采用酸堿滴定法進(jìn)行測(cè)定[14]。

1.2.3.5 pH

取發(fā)酵罐中多個(gè)位置的發(fā)酵液進(jìn)行混合，用pH計(jì)測(cè)定直至數(shù)值穩(wěn)定，連續(xù)測(cè)3次，取平均值。

1.2.3.6 菌落總數(shù)測(cè)定

根據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定[15]。

1.2.3.7 大腸菌群測(cè)定

根據(jù)GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》，采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定[16]。

1.2.3.8 乳酸菌測(cè)定

根據(jù)GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》進(jìn)行測(cè)定[17]。

1.2.3.9 酵母菌測(cè)定

根據(jù)GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》，采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 和SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量的變化

櫻菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。

圖1 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量和pH的變化Fig.1 Change of nitrite content and pH value duringthe fermentation of L. sativum注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(下同)

由圖1所示，自然發(fā)酵組和體積分?jǐn)?shù)5%接種組中亞硝酸鹽含量均先增加再降低，并在第7天亞硝酸鹽出現(xiàn)明顯的高峰，自然發(fā)酵組上升的速度與含量顯著高于接種組(P<0.05)。而體積分?jǐn)?shù)1%接種組隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，亞硝酸鹽含量逐漸降低并趨于穩(wěn)定，且在發(fā)酵第7天已降至國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以下(<20 mg/kg)。同一時(shí)間，人工接種量不同，發(fā)酵櫻菜中亞硝酸鹽殘留量也不同，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，以體積分?jǐn)?shù)1%接種組保持含量較低，表明人工接種發(fā)酵有利于抑制亞硝酸鹽的生成與積累。

自然發(fā)酵組在前7 d亞硝酸鹽含量快速增加，可能由于蔬菜及發(fā)酵器上的革蘭氏陰性菌分泌硝酸還原酶，導(dǎo)致大量的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[19]。人工接種組中的腸膜明串珠菌開(kāi)始就高于自然發(fā)酵組，能立即進(jìn)行乳酸發(fā)酵，產(chǎn)生大量乳酸[20]，使pH在5.0以下，此時(shí)硝酸還原酶酶活性開(kāi)始對(duì)亞硝酸鹽含量變化起作用，因此，接種組亞硝酸鹽含量逐漸降低并趨于穩(wěn)定。本試驗(yàn)亞硝酸鹽含量變化規(guī)律與何淑玲[21]研究結(jié)果一致。

2.2 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中pH的變化

pH影響發(fā)酵過(guò)程中微生物的種類(lèi)、數(shù)量以及代謝產(chǎn)物的變化，進(jìn)而影響發(fā)酵櫻菜的品質(zhì)。

由圖1所示，櫻菜發(fā)酵過(guò)程中pH呈規(guī)律變化，3組發(fā)酵櫻菜在0～28 d，pH均逐漸降低，人工接種組pH下降速度快于自然發(fā)酵組，但差異不顯著(P>0.05)，這是由于自然發(fā)酵組發(fā)酵起始乳酸菌少，而接種組起始接種了腸膜明串珠菌，因此，產(chǎn)酸多于自然發(fā)酵組。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌成為優(yōu)勢(shì)菌，發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，pH逐漸降低[22-23]。

28～35 d，pH穩(wěn)定在3.7～3.8，此時(shí)，發(fā)酵成熟，pH趨于穩(wěn)定，這與杜書(shū)[24]、馬歡歡等[25]和韓宏嬌等[10]的研究結(jié)果相似。

2.3 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的變化

在發(fā)酵過(guò)程中，還原糖是發(fā)酵底物，可以表征出發(fā)酵過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)情況以及代謝產(chǎn)物的量。

櫻菜發(fā)酵過(guò)程中還原糖變化如圖2所示，3組發(fā)酵櫻菜中還原糖含量均呈先增加再降低趨于穩(wěn)定。

圖2 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的變化Fig.2 Change of reducing sugar during the fermentationof L. sativum

0～7 d 還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢(shì)，分析認(rèn)為，一是櫻菜本身還原糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷溶出，此時(shí)，微生物活動(dòng)弱，對(duì)還原糖的利用速度小于生成速度，二是還原糖是發(fā)酵環(huán)境中酶的主要電子供體，微生物分泌的酶類(lèi)將多糖降解為還原糖。7～21 d還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)，這是由于隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌數(shù)量增多，活力增強(qiáng)，利用還原糖進(jìn)行生長(zhǎng)代謝所致。21～49 d還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本趨于穩(wěn)定略有增加，后期自然發(fā)酵組略高于接種組，分析認(rèn)為隨著微生物生長(zhǎng)繁殖的主要碳源被消耗而逐漸減少，微生物活力下降；而自然發(fā)酵組略高，是因?yàn)榫w的數(shù)量和活力下降，對(duì)還原糖的利用減少所致。這與馬艷弘等[26]研究結(jié)果類(lèi)似。

2.4 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化

總酸是反映櫻菜的發(fā)酵程度，影響產(chǎn)品的風(fēng)味和品質(zhì)的重要指標(biāo)。由圖3可知，3組櫻菜發(fā)酵過(guò)程中，總酸含量均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈持續(xù)上升趨勢(shì)，42 d達(dá)到最大值，分析認(rèn)為，一是由于發(fā)酵初期，以腸膜明串珠菌的異型乳酸發(fā)酵為主，產(chǎn)生的CO2、CHCOOH、CH3CH2OH導(dǎo)致發(fā)酵液中總酸含量升高[27-28]，二是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌成為優(yōu)勢(shì)菌，利用發(fā)酵櫻菜中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸，由此創(chuàng)造的酸性環(huán)境促進(jìn)部分抗酸乳酸菌的繁殖，產(chǎn)生大量乳酸。因此，3組總酸含量持續(xù)增加。自然發(fā)酵組總酸含量在前14 d上升程度不大，是因?yàn)槭卟俗陨韼в械娜樗峋推渌⑸镌邴}水、低溫和密閉缺氧條件下代謝慢，產(chǎn)生的有機(jī)酸速度慢[29]。

圖3 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中總酸含量變化Fig.3 Change of total acid during the fermentation ofL. sativum

人工接種組總酸含量以及上升速度顯著高于自然發(fā)酵組(P<0.05)，表明人工接種發(fā)酵利于縮短發(fā)酵時(shí)間，提高生產(chǎn)效率。

42～49 d，3組總酸含量上升程度趨于穩(wěn)定，這可能是由于發(fā)酵后期，發(fā)酵環(huán)境中的碳源、氮源被大量消耗而不足，乳酸菌的代謝產(chǎn)酸能力減弱并逐漸停止，發(fā)酵環(huán)境中總酸含量趨于穩(wěn)定[30]。

2.5 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量的變化

人工接種與自然發(fā)酵櫻菜中氨基酸態(tài)氮含量與發(fā)酵時(shí)間關(guān)系如圖4所示。3組發(fā)酵櫻菜中氨基酸態(tài)氮含量變化趨勢(shì)基本一致，均先增加后降低，自然發(fā)酵組上升速度與含量高于人工接種組。

圖4 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量變化Fig.4 Change of amino acid nitrogen during the fermentationof L. sativum

0～7 d呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這可能是由于初期微生物數(shù)量少、代謝活動(dòng)弱，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物數(shù)量增多，代謝產(chǎn)生蛋白酶，氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加。7～28 d整體呈下降趨勢(shì)，28～49 d基本趨于穩(wěn)定，可能由于微生物活動(dòng)，造成酸性發(fā)酵環(huán)境抑制蛋白酶的活性，同時(shí)發(fā)酵櫻菜中肽、氨基酸等逐漸被微生物利用[31]。

2.6 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中菌落總數(shù)的變化

菌落總數(shù)可直觀反映發(fā)酵櫻菜中雜菌數(shù)量，是判斷食用安全性的重要指標(biāo)。由圖5可知，3組菌落總數(shù)在0～7 d呈上升趨勢(shì)，7～14 d緩慢下降，14～28 d 下降幅度比較大，28～49 d 趨于平穩(wěn)，自然發(fā)酵組略微升高。

圖5 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中菌落總數(shù)變化Fig.5 Change of colony count during the fermentation ofL. sativum

發(fā)酵初期環(huán)境利于雜菌繁殖，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌活力增強(qiáng)，逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌，代謝產(chǎn)酸抑制雜菌生長(zhǎng)，發(fā)酵后期自然發(fā)酵組菌落總數(shù)多于人工接種組，由此可知，人工接種發(fā)酵櫻菜可提高食用安全性。

2.7 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中大腸菌群數(shù)的變化

大腸菌群是判斷衛(wèi)生安全的重要指標(biāo)，由圖6可知，3組發(fā)酵櫻菜隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，大腸菌群呈下降趨勢(shì)。發(fā)酵第0天，自然發(fā)酵組略高于人工發(fā)酵組，從發(fā)酵第7～49天，3組均未檢出大腸菌群。這是由于大腸菌群對(duì)酸性比較敏感，隨著乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸，酸性和低氧環(huán)境導(dǎo)致大腸菌群生長(zhǎng)受到抑制[32]。

圖6 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中大腸菌群變化Fig.6 Change of coliform bacteria during the fermentationof L. sativum

2.8 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌數(shù)的變化

乳酸菌是加速發(fā)酵櫻菜成熟、形成風(fēng)味的決定性因素，從圖7可知，發(fā)酵起始階段，由于腸膜明串珠菌的加入，人工接種發(fā)酵櫻菜中乳酸菌數(shù)多于自然發(fā)酵組。3組發(fā)酵櫻菜中乳酸菌均經(jīng)歷了增長(zhǎng)期(0～14 d)、相對(duì)停滯期(14～21 d、42～49 d)和下降期(28～42 d)。體積分?jǐn)?shù)1%接種組在發(fā)酵第14天時(shí)乳酸菌數(shù)達(dá)到峰值9.78 lg(CFU/g)，同一發(fā)酵時(shí)期，自然發(fā)酵組中乳酸菌數(shù)小于人工接種組。

圖7 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌總數(shù)變化Fig.7 Change of lactic acid bacteria during the fermentationof L. sativum

增長(zhǎng)期是由于發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌；進(jìn)入停滯期和下降期，一是由于乳酸富集抑制不耐酸乳酸菌的生長(zhǎng)[33]，二是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，使得乳酸菌數(shù)量減少。

2.9 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中酵母菌數(shù)的變化

由圖8可知，酵母菌數(shù)量呈先增加后降低再趨于穩(wěn)定，0～7 d酵母菌呈增加趨勢(shì)，由于乳酸菌還未成為優(yōu)勢(shì)菌；從7～35 d逐漸下降，乳酸菌開(kāi)始成為優(yōu)勢(shì)菌，產(chǎn)酸造成的酸性和低氧環(huán)境抑制了酵母菌的生長(zhǎng)。整個(gè)發(fā)酵期間，自然發(fā)酵組中的酵母菌數(shù)多于人工接種組，說(shuō)明人工接種對(duì)酵母菌的抑制優(yōu)于自然發(fā)酵。

圖8 櫻菜發(fā)酵過(guò)程中酵母菌變化Fig.8 Change of yeasts during the fermentation ofL. sativum

3 結(jié)論

通過(guò)分析降解亞硝酸鹽腸膜明串珠菌發(fā)酵對(duì)櫻菜化學(xué)成分和微生物變化，研究人工接種發(fā)酵和自然發(fā)酵對(duì)櫻菜品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)人工接種發(fā)酵櫻菜亞硝酸鹽含量低且降解速度快、總酸含量高、pH下降快、乳酸菌數(shù)量多，發(fā)酵周期比自然發(fā)酵縮短7 d左右；菌落總數(shù)和氨基酸態(tài)氮含量少，接種發(fā)酵比自然發(fā)酵食用安全性更高。

通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，人工接種發(fā)酵和自然發(fā)酵相比，亞硝酸鹽含量、總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量、乳酸菌數(shù)量差異顯著(P<0.05)，人工接種發(fā)酵組對(duì)菌落總數(shù)、大腸菌群和酵母菌等有害菌的抑制效果優(yōu)于自然發(fā)酵組。

綜合分析，人工接種發(fā)酵櫻菜優(yōu)于傳統(tǒng)自然發(fā)酵，且以體積分?jǐn)?shù)1%接種量較好。