囊型肝包蟲(chóng)外囊壁中鈣化性納米微粒的分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察

楊劍，彭心宇，張宏偉，楊靖，張永國(guó)，吳向未*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，新疆 石河子 832002；2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬 同濟(jì)醫(yī)院肝臟外科中心，湖北 武漢 430030)

包蟲(chóng)病是一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)性疾病，它與結(jié)核病、艾滋病、瘧疾等疾病一起被稱為“世界上被忽視的疾病”[1]。在我國(guó)其主要遍布于新疆、青海、西藏等西部牧區(qū)和半農(nóng)半牧地區(qū)，其中囊型肝包蟲(chóng)病患病率較高，占90%以上[2]。在囊型肝包蟲(chóng)病自然病程中，包蟲(chóng)囊腫經(jīng)歷著由小—大—小的過(guò)程，活性逐漸降低[3]。我們臨床研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)肝包蟲(chóng)外囊壁會(huì)逐步發(fā)生鈣化，且常伴有包蟲(chóng)內(nèi)容物退化，生物學(xué)上稱之為“非活躍期”，臨床稱之為“靜止性病變”[4]；當(dāng)肝包蟲(chóng)外囊壁鈣化范圍增大，蟲(chóng)體則大量死亡，這是因?yàn)橥饽冶诖蠓秶}化使得蟲(chóng)體很難從周?chē)M織中攝取營(yíng)養(yǎng)[5]?；诖死碚?，我們認(rèn)為引起和促進(jìn)肝包蟲(chóng)外囊壁鈣化，可能成為治療囊型肝包蟲(chóng)病新的方向，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于肝包蟲(chóng)囊壁鈣化發(fā)生、發(fā)展機(jī)制認(rèn)識(shí)尚不明確。有研究表明膽瘺的發(fā)生是一重要因素，其可在機(jī)體免疫機(jī)制作用下導(dǎo)致肝包蟲(chóng)囊壁鈣化[6]。多年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)從人體病理性鈣化組織中分離獲得鈣化性納米微粒，最新觀點(diǎn)認(rèn)為鈣化性納米微粒是一類(lèi)能夠自我復(fù)制的納米級(jí)蛋白復(fù)合體，具有自我礦化的特性[7]。鑒此，我們提出假設(shè)：囊型肝包蟲(chóng)患者的膽汁中存在鈣化性納米微粒，由于肝包蟲(chóng)膽瘺的發(fā)生其納米微?？蓪?dǎo)致肝包蟲(chóng)外囊壁逐步發(fā)生鈣化。本實(shí)驗(yàn)擬探討囊型肝包蟲(chóng)囊壁鈣化、包蟲(chóng)膽漏與鈣化性納米微粒的關(guān)系，分別從囊型肝包蟲(chóng)鈣化及非鈣化的外囊壁中試分離及培養(yǎng)鈣化性納米微粒，電鏡觀察該納米微粒特征，初步尋找鈣化性納米微粒誘發(fā)肝包蟲(chóng)外囊壁鈣化的證據(jù)及相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集 37例囊型肝包蟲(chóng)病患者于2018年1月至2018年12月在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門(mén)診確診并住院行手術(shù)治療，年齡43.5±7.6歲，其中女性為15例，男性為22例；術(shù)前CT明確包蟲(chóng)囊腫數(shù)目、大小、位置、WHO影像學(xué)分型及外囊壁鈣化情況，術(shù)后明確手術(shù)方式、術(shù)中是否發(fā)膽瘺。本研究得到石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)同意。

城市更新是一個(gè)由城市內(nèi)部多種因素復(fù)合驅(qū)動(dòng)的過(guò)程。城市更新的內(nèi)容已從單純“硬性”的物質(zhì)和形體更新擴(kuò)散到社會(huì)文化網(wǎng)絡(luò)、鄰里關(guān)系乃至人們的心理認(rèn)同等“軟性”更新。自改革開(kāi)放以來(lái)，隨著城市化速度的加快，我國(guó)的城市更新改造運(yùn)動(dòng)以前所未有的規(guī)模與速度展開(kāi)。在城市更新中，既定的環(huán)境是城市政府所供給的制度和法律，需要重點(diǎn)考慮的是如何在多元化主體和差異化利益訴求下保證其順利進(jìn)行。

(1)術(shù)前CT判斷肝包蟲(chóng)外囊壁鈣化的程度由少到多為標(biāo)準(zhǔn)。

囊壁鈣化進(jìn)行分類(lèi)：點(diǎn)片狀，弧狀，環(huán)狀。

(2)膽瘺診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.1 透射電鏡掃描-負(fù)染法

b：行開(kāi)放式外膜內(nèi)外囊切除術(shù)或次全切除術(shù)時(shí)囊壁內(nèi)側(cè)可見(jiàn)有膽汁滲入，囊內(nèi)容物感染壞死，呈膽汁污染樣顏色。

（2）進(jìn)行電氣設(shè)備配管下料時(shí)，必須要由專業(yè)的監(jiān)理工程師進(jìn)行施工監(jiān)督，且施工的整個(gè)過(guò)程，都需要按照施工規(guī)范與設(shè)計(jì)規(guī)范進(jìn)行相應(yīng)施工，施工時(shí)若發(fā)現(xiàn)下料的材料不符合質(zhì)量要求，必須進(jìn)行更換，以確保電氣設(shè)備的質(zhì)量與安全性。

1.2 標(biāo)本的處理

包蟲(chóng)外囊壁組織獲取與處理。根據(jù)術(shù)中發(fā)現(xiàn)，將肝包蟲(chóng)囊腫分為膽漏組和非膽漏組，均用無(wú)菌剪取手術(shù)切除的外囊組織各2份(多點(diǎn)取材)。每份一部分剪成3 cm×3 cm，分別稱取術(shù)中所取包蟲(chóng)外囊組織各500 mg，用無(wú)菌PBS洗凈，直到無(wú)肉眼可分離見(jiàn)血水為宜，37 ℃烘干，充分研磨組織至勻漿狀，0.1 mol·L-1鹽酸加入搖勻，37 ℃、30 min孵育脫礦，每次間隔10 min搖勻，調(diào)pH至7.0～7.4(1 mol·L-1HCl-Tris加入中和)，在離心管中自然沉淀后，取上清20 mL轉(zhuǎn)入離心機(jī)4 ℃、8,000 g，10 min離心，取上清液用0.22 μm 細(xì)菌濾器過(guò)濾約10 mL，56 ℃、30 min孵育去除支原體污染，4 ℃、12,000 g、離心40 min，再取上清液用0.22 μm細(xì)菌濾器過(guò)濾至15 mL試管中，每管2 mL，加入10%γ-PBS RPMI1640 4 mL作為培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5%CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，上述所有所取標(biāo)本4周。

1.3 電鏡標(biāo)本的制作

由于普通光學(xué)顯微鏡難以鑒別納米級(jí)的微粒，故應(yīng)用電子顯微鏡觀察已成為鑒定鈣化性納米微粒形態(tài)學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)方法，本實(shí)驗(yàn)方法主要運(yùn)用電鏡針對(duì)囊型肝包蟲(chóng)囊壁中分離、培養(yǎng)出來(lái)的鈣化性納米微粒進(jìn)行觀察和比較。

a：術(shù)中證實(shí)肝包蟲(chóng)破入膽道，膽道內(nèi)可見(jiàn)囊內(nèi)容物。

將肉眼觀察有白色顆粒沉淀于管底的培養(yǎng)液，以16 000 g離心45 min，去上清，以PBS將沉淀沖洗，在4 ℃下應(yīng)用2.5%戊二醛固定24 h，雙蒸水5 min，3次洗滌，4 ℃、

12 000 g，離心40 min，加入1mLPBS制備混懸溶液，進(jìn)行負(fù)染色，將銅網(wǎng)放置于混懸溶液上10 min，完全吸盡液體，在15 mol·L-1磷鎢酸液滴上放置100 s，再次吸盡液體并晾干，在工作電壓80 kV，H-7650透射電鏡下予以觀察。

1.3.2 掃描電鏡

貨幣資金的國(guó)內(nèi)外流動(dòng)必然是伴隨對(duì)外貿(mào)易投資活動(dòng)的開(kāi)展而進(jìn)行的，本國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展停滯，則商貿(mào)活動(dòng)減緩，貨幣流動(dòng)必然隨之而止，市場(chǎng)需求是一國(guó)貨幣走向國(guó)際市場(chǎng)的最根本動(dòng)力，靠人為拉動(dòng)或套利投機(jī)的貨幣國(guó)際化是不可持續(xù)的。絲綢之路上的古代貨幣的境外流通，完全就是市場(chǎng)需求帶動(dòng)的。因此，人民幣國(guó)際化要在市場(chǎng)需求的基礎(chǔ)上穩(wěn)妥推進(jìn)，無(wú)論是人民幣的跨境貿(mào)易結(jié)算還是人民幣的對(duì)外直接投資，都要注重海外市場(chǎng)的需求，現(xiàn)階段可以重點(diǎn)擴(kuò)大人民幣的計(jì)價(jià)使用，真正發(fā)揮貨幣互換在貿(mào)易投資中的功能。

用2.5%的戊二醛將肉眼觀察有白色顆粒沉淀于管底的培養(yǎng)液固定24 h，以PBS反復(fù)清洗3次，每次持續(xù)10 min，再用50%、70%、80%、90%、100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水,各脫水10 min,到臨界點(diǎn)進(jìn)行干燥；以導(dǎo)電膠粘附樣品放置樣品臺(tái)上，真空離子鉑金膜噴鍍，在工作電壓25 kV和3 kV掃描電鏡下予以觀察。

中國(guó)是航運(yùn)大國(guó)，世界10大港口中，中國(guó)占據(jù)8個(gè)席位。2017年，中國(guó)港口完成貨物吞吐量140億噸，比上年增長(zhǎng)6%；完成集裝箱吞吐量2.38億標(biāo)箱（TEU），比上年增長(zhǎng)8.3%。2017年，外籍船舶靠泊中國(guó)港口數(shù)量超過(guò)28萬(wàn)余艘次，是1994年的5倍以上，而國(guó)際航行船舶燃油平均含硫量高達(dá)2.6%～3.5%，是車(chē)用柴油的3500倍，船舶燃油質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于陸上機(jī)動(dòng)車(chē)燃油品質(zhì)。上海市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心的數(shù)據(jù)顯示，2012年，船舶排放二氧化硫、氮氧化物分別占當(dāng)?shù)嘏欧趴偭康?2.4%和11.6%，2015年分別上升到25.7%和29.4%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本文均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 囊型肝包蟲(chóng)外囊有無(wú)鈣化與其膽瘺發(fā)生率的比較

1.2.3 食物成分調(diào)整 適當(dāng)增加精神分裂癥并2型糖尿病患者高纖維素等食物的攝入量，此類(lèi)食物能夠?qū)ξ概趴盏乃俣瓤刂?，從而將患者的餐后血糖水平降低。若患者存在胃癱的情況，則應(yīng)減少其高纖維素食物的攝入量，同時(shí)增加維生素C的攝入量[8]。

經(jīng)過(guò)歷代的治理，特別是新中國(guó)成立60多年來(lái)的大力治理，現(xiàn)在全國(guó)大江大河的防洪體系已基本形成，可以防御新中國(guó)成立以來(lái)發(fā)生的最大洪水。但是，全國(guó)絕大多數(shù)中小河流治理滯后，大雨大災(zāi)、小雨小災(zāi)頻繁發(fā)生。目前全國(guó)大約有2/3的中小河流缺乏治理，防洪標(biāo)準(zhǔn)低于20年一遇~10年一遇洪水，達(dá)不到國(guó)家規(guī)定的防洪標(biāo)準(zhǔn)。

c：行“肝包蟲(chóng)外膜內(nèi)外囊完整切除術(shù)”時(shí)證實(shí)囊壁外側(cè)與囊周肝內(nèi)膽管相通，或術(shù)后切開(kāi)標(biāo)本時(shí)發(fā)現(xiàn)囊壁或囊內(nèi)容物呈膽汁污染樣顏色等存在膽瘺的間接表現(xiàn)。

表1 囊型肝包蟲(chóng)外囊有無(wú)鈣化的膽漏發(fā)生率比較

2.2 實(shí)驗(yàn)圖片

2.2.2 組織獲取與處理

術(shù)前CT顯示囊型肝包蟲(chóng)囊壁鈣化與術(shù)后證實(shí)囊型肝包蟲(chóng)膽漏發(fā)生的關(guān)系(圖1～圖4)。術(shù)前CT檢查未見(jiàn)囊壁鈣化的肝包蟲(chóng)，經(jīng)手術(shù)切除后證實(shí)包蟲(chóng)囊內(nèi)未見(jiàn)膽漏發(fā)生，而術(shù)前CT檢查已明確囊內(nèi)、囊壁鈣化的肝包蟲(chóng)，術(shù)后證實(shí)囊內(nèi)均存在膽漏的發(fā)生，囊內(nèi)物壞死。

圖1 囊型肝包蟲(chóng)CT(囊壁無(wú)鈣化)

圖2 術(shù)后證實(shí)肝包蟲(chóng)無(wú)膽漏發(fā)生

圖3 囊型肝包蟲(chóng)CT(囊壁鈣化)

圖4 術(shù)后證實(shí)肝包蟲(chóng)有膽漏發(fā)生

2.2.1 術(shù)前CT圖片

囊型肝包蟲(chóng)外囊壁組織獲取與處理(圖5、6)。選取囊型肝包蟲(chóng)鈣化性外囊壁，分別剪成碎片樣再將碎片鈣化組織研磨成泥漿狀，逐一進(jìn)行脫鈣、離心、過(guò)濾取上清液，加入10%γ-PBC RPMI1640 4 mL作為培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5% CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

圖5 肝包蟲(chóng)外囊壁組織獲取

圖6 肝包蟲(chóng)外囊壁組織處理

2.2.3 培養(yǎng)結(jié)果

CFG樁復(fù)合地基變形計(jì)算，首先按照J(rèn)GJ 79—2012《建筑地基處理技術(shù)規(guī)范》第7.1.7條和7.1.8條確定復(fù)合土層的壓縮模量和變形計(jì)算深度范圍內(nèi)壓縮模量的當(dāng)量值，再按GB 50007—2011《建筑地基基礎(chǔ)設(shè)計(jì)規(guī)范》式（5.3.5）的有關(guān)規(guī)定計(jì)算復(fù)合地基變形。

經(jīng)過(guò)四周培養(yǎng)，鈣化的外囊壁組管底可見(jiàn)白色顆粒樣沉淀(圖7)，而無(wú)鈣化囊壁組未見(jiàn)白色沉淀物(圖8)。

圖7 鈣化外囊壁組管底見(jiàn)白色沉淀

圖8 無(wú)鈣化外囊壁組管底未見(jiàn)沉淀

2.2.4 透射電鏡掃描結(jié)果

在收集的37例囊型肝包蟲(chóng)標(biāo)本中，其中膽漏出現(xiàn)外囊壁鈣化的有12例，有膽漏無(wú)鈣化5例，無(wú)膽漏無(wú)鈣化的20例，χ2=20.894，P<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

放置于透射電鏡下觀測(cè)，可見(jiàn)納米顆粒存在，這種顆粒的形態(tài)大多數(shù)呈現(xiàn)腎形或者圓球形，直徑約100～600 nm。

呈現(xiàn)出二分裂的形態(tài)，同時(shí)可見(jiàn)毛刺現(xiàn)象(圖9、10)，隨機(jī)選取透射電鏡(負(fù)染法)為陽(yáng)性的樣本，進(jìn)行超薄切片透射電鏡觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)在顆粒外周有一層黑色致密物包繞(圖11、12)，掃描電鏡下觀察這些顆粒大小不一，顆粒表面有類(lèi)似結(jié)晶物(圖13、14)。

圖9 透射電鏡下可見(jiàn)黑色顆粒

圖10 透射電鏡下呈二分裂的形態(tài)

圖11 超薄切片電鏡下顆粒外周黑色致密物包繞

圖12 黑色顆粒外周可見(jiàn)毛刺現(xiàn)象

圖13 掃描電鏡顆粒大小不一，呈球形居多

圖14 顆粒表面有類(lèi)似結(jié)晶物

2.3 囊型肝包蟲(chóng)有無(wú)鈣化性納米微粒與其膽瘺發(fā)生率的比較

在收集的37例囊型肝包蟲(chóng)標(biāo)本中，其中有膽漏培養(yǎng)出鈣化性納米微粒的有16例，有膽漏培養(yǎng)出無(wú)鈣化性納米微粒1例，無(wú)膽漏無(wú)鈣化納米微粒的20例，χ2=33.165，P<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 囊型肝包蟲(chóng)有無(wú)鈣化性納米微粒的膽漏發(fā)生率比較

2.4 囊型肝包蟲(chóng)外囊有無(wú)鈣化性納米微粒與其膽瘺發(fā)生率的比較

在收集的37例囊型肝包蟲(chóng)標(biāo)本中，有膽漏無(wú)鈣化外囊壁培養(yǎng)出鈣化性微粒4例，有膽漏鈣化外囊壁培養(yǎng)出鈣化性微粒12例，有膽瘺無(wú)鈣化組未發(fā)現(xiàn)鈣化性納米微粒1例，無(wú)膽漏無(wú)鈣化組未發(fā)現(xiàn)納米微粒20例，χ2=33.740，P<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 囊型肝包蟲(chóng)有無(wú)鈣化性納米微粒的 膽漏與鈣化發(fā)生率比較

3 討論

鈣化性納米微粒(calcifying nanoparticles，CNPs)[8]，是由芬蘭科學(xué)家Kajander E.O等人在研究牛血清培養(yǎng)失敗時(shí)意外發(fā)現(xiàn)的，在被發(fā)現(xiàn)的初期又稱之為納米細(xì)菌(nanobacteria，NB)，CNPs在自然界及人體的許多組織中普遍存在，其直徑大約在100～600 nm之間，外形多呈圓球形或圓球桿狀，在該顆粒外層有磷灰石礦化致密外殼，革蘭氏染色呈陰性，代謝慢，耐酸、耐熱。當(dāng)前最新觀點(diǎn)認(rèn)為CNPs是一類(lèi)能夠自我復(fù)制的納米級(jí)蛋白復(fù)合體，具有自我礦化的特性，CNPs在生理性鈣、磷濃度中能形成羥磷灰石碳酸鹽結(jié)晶，產(chǎn)生堅(jiān)硬的礦化外殼覆蓋于其周?chē)?，?gòu)成晶體核心，其分泌鈣化脂多糖生物膜，具有較大的毒性，可引起細(xì)胞空泡形成、組織的炎癥和腫脹，并出現(xiàn)一系列相關(guān)炎癥因子的反應(yīng)，因此與人類(lèi)病理和感染性鈣化疾病相關(guān)密切[7]。Larry W Hunter等[9]研究表明外源性CNPs在體外被主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞吸收，并在礦化部位增強(qiáng)平滑肌源性凋亡小體的大量積累，加速血管鈣化；吳基華等[10]實(shí)驗(yàn)研究表明CNPs可以作為結(jié)晶的活性核心，黏附、侵入并破壞腎集合管的上皮細(xì)胞和腎乳頭細(xì)胞，形成磷灰石晶核，從而誘發(fā)腎結(jié)石形成；據(jù)李亞楠等[11]研究發(fā)現(xiàn)在61.3%患者膽汁中可分離及培養(yǎng)出來(lái)CNPs，并證實(shí)CNPs與膽結(jié)石的形成存在關(guān)系；多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究表明鈣化性納米微粒與鈣化性主動(dòng)脈狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、腎結(jié)石、慢性Ⅲ前列腺炎、多囊肝、膽囊結(jié)石、胎盤(pán)的鈣化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性牙周炎、周?chē)窠?jīng)性病變等人體內(nèi)組織的病理性鈣化及慢性炎性疾病的發(fā)生與發(fā)展存在緊密聯(lián)系[12-14]。而肝包蟲(chóng)外囊壁中鈣鹽的沉積被認(rèn)為是機(jī)體局部反應(yīng)而引起的營(yíng)養(yǎng)不良性鈣化[15]，營(yíng)養(yǎng)不良性鈣化是與感染，炎癥，異物及細(xì)胞損傷密切相關(guān)，那么在肝包蟲(chóng)的自然病程中包蟲(chóng)囊壁的逐步鈣化是否也與鈣化性納米微粒有一定關(guān)聯(lián)？當(dāng)前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道和研究，在本次實(shí)驗(yàn)中我們明確證實(shí)囊型肝包蟲(chóng)囊壁鈣化與肝包蟲(chóng)膽漏發(fā)生存在一定關(guān)系(發(fā)現(xiàn)包蟲(chóng)囊壁出現(xiàn)鈣化均有膽漏發(fā)生)，進(jìn)一步從發(fā)生膽漏的囊型肝包蟲(chóng)鈣化外囊壁中分離及培養(yǎng)出鈣化性納米微粒，其培養(yǎng)特性和電鏡觀察形態(tài)特征均與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)相關(guān)信息描述高度一致，明確證實(shí)在肝包蟲(chóng)鈣化外囊壁中同樣存在鈣化性納米微粒，初步說(shuō)明在囊型肝包蟲(chóng)自然病程中包蟲(chóng)囊壁鈣化與鈣化性納米微?？赡艽嬖谝欢ㄏ嚓P(guān)性，但目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有此相關(guān)報(bào)道；至于鈣化性納米微粒與囊型肝包蟲(chóng)囊壁鈣化之間的具體關(guān)系和機(jī)制需進(jìn)行深入研究和進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)首次在囊型肝包蟲(chóng)鈣化外囊壁中分離和培養(yǎng)出與鈣化性納米微粒類(lèi)似的納米顆粒，明確證實(shí)囊型肝包蟲(chóng)鈣化囊壁中存在鈣化性納米微粒。

如表1所示，模型組和丁酸鈉組DAO和NO顯著高于對(duì)照組（P＜0.05、0.01），丁酸鈉組DAO和NO顯著低于模型組（P＜0.05）。

(2)鈣化性納米微?？赡苁菍?dǎo)致囊型肝包蟲(chóng)外囊壁鈣化的其中因素之一，可為我們研究囊性肝包蟲(chóng)病的自然病程和治療囊型肝包蟲(chóng)病提供重要的補(bǔ)充和可能的思路。