香青蘭總黃酮對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠mTOR信號(hào)通路及相關(guān)自噬蛋白水平的影響

梁自強(qiáng)，鄧潔，袁勇，馬曉莉，郭新紅，黃川生，曹文疆*

(1石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832008)

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)會(huì)嚴(yán)重影響缺血性心臟疾病患者的預(yù)后，甚至?xí)M(jìn)一步誘發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥而致死。研究MIRI的發(fā)生機(jī)制及防治藥物是近年來(lái)研究熱點(diǎn)之一。

自噬是MIRI的重要機(jī)制之一[1-2]。AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR是細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典的自噬通路，其通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器，如線(xiàn)粒體等，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器更新及自我新陳代謝。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞能量代謝中起到了重要作用，被稱(chēng)為細(xì)胞中的“能量調(diào)節(jié)器”[3-5]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)蛋白家族在很多生理活動(dòng)中起到了重要的的調(diào)節(jié)作用。AKT,亦稱(chēng)為蛋白激酶B(PKB)，是PI3K下游主要的效應(yīng)物，主要調(diào)控細(xì)胞能量代謝，糖代謝，細(xì)胞自噬等。mTOR是AMPK和AKT下游蛋白，雷帕霉素靶蛋白(mTOR)參與心肌缺血再灌注損傷的自噬調(diào)控過(guò)程，mTOR的抑制可激活自噬水平。研究自噬與AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的作用機(jī)制對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌保護(hù)具有重要作用[6-7]。

課題組前期研究結(jié)果表明，香青蘭總黃酮(DracocephalumMoldavicaL.total flavonoids,TFDM)能明顯降低自噬蛋白 LC3和Beclin1的表達(dá)抗心肌缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與TFDM調(diào)控AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制細(xì)胞自噬水平有關(guān)[8-10]。因此，通過(guò)研究TFDM預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷中的自噬作用，為香青蘭總黃酮防治MIRI提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體重230～280 g，新疆地方病研究所提供。合格證號(hào)：新醫(yī)動(dòng)字第2004-0006號(hào)。實(shí)驗(yàn)操作均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑

香青蘭總黃酮提取物(TFDM，由新疆自治區(qū)藥物研究所提供，純度為57%，20141008)；烏拉坦麻醉藥(武漢遠(yuǎn)城科技公司，20151106)；Rapamycin(APExBIO，10 mg，DMSO溶解)；Compound C(APExBIO，5 mg，DMSO溶解)；LY294002(APExBIO，5 mg，DMSO溶解)；Anti-AMPKα 1 + α 2 (abcam,ab80039)；Anti-p-AMPK α 1 + α 2 (abcam,ab133448)；Anti-mTOR (CST,#2972)；Anti-p-mTOR (CST,#2971)；Anti-AKT (abcam,ab179463)；Anti-p-AKT (abcam,ab81283)；Anti-Bcl-2 (abcam,ab59348)；Anti-LC3 (abcam,ab48394)；Anti-Beclin1 (abcam,ab207612)；Anti-GAPDH(武漢三鷹，60004-1-lg)。

1.3 主要儀器

HX-300呼吸裝置(成都泰盟科技公司)；XL-200低速離心儀器(海門(mén)其林貝爾儀器廠)；Pico-17臺(tái)式低溫離心機(jī)(USA)；立式-80 ℃冰箱(青島海爾儀器有限公司)；EM-UC6超薄型切片儀器(美國(guó)徠卡公司)；千分之一電子天平(奧豪斯上海貿(mào)易公司)；VE-180垂直電泳及電轉(zhuǎn)儀(上海天能)；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)；脫色搖床儀(海門(mén)其林貝爾公司)；恒溫電熱培養(yǎng)箱(上海齊欣儀器公司)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥

48只雄性SD大鼠，隨機(jī)劃分為6組。①假手術(shù)組(Sham)，生理鹽水灌胃；②模型組(IR)，生理鹽水灌胃；③香青蘭總黃酮給藥組(TFDM)，香青蘭總黃酮60 mg·kg-1·d-1灌胃；④香青蘭總黃酮聯(lián)合mTOR抑制劑Rapamycin組(TFR)，再灌注前30 min腹腔注射2 mg·kg-1的雷帕霉素；⑤香青蘭總黃酮聯(lián)合AMPK抑制劑Compound C組(TFC)，再灌注前30 min腹腔注射500 μg·kg-1的Compound C；⑥香青蘭總黃酮聯(lián)合PI3K抑制劑LY294002組(TFL)，再灌注前30 min腹腔注射300 μg·kg-1的LY294002。

注：手術(shù)前7 d及再灌注前10 min給與香青蘭總黃酮預(yù)處理，再灌注前10 min給藥是通過(guò)腹腔注射的方式。

1.4.2 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的建立及取材[11-12]

將大鼠用 25% 烏拉坦(5 mL·kg-1)麻醉后，仰臥位固定。首先進(jìn)行氣管插管，開(kāi)胸后，立刻連接呼吸機(jī)。自制掏環(huán)將心臟掏出，迅速結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎完成后立刻讓心臟回位。缺血 30 min 后，剪斷結(jié)扎線(xiàn)，再灌注2 h。再灌注結(jié)束后，迅速剪取心臟，將其置于冰生理鹽水中，輕柔洗凈心腔內(nèi)血液，取左心室壁組織-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 大鼠肌梗死面積的測(cè)定

1%的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2、3、5-Triphenyte-trazolium chloride，TTC)染色法測(cè)定心肌梗死面積。再灌注結(jié)束后，各組大鼠心臟于 -80 ℃ 冰凍1 h后，平行切成 5～6片1～2 mm的薄片，然后將切片置于 1% TTC 染液中，37 ℃ 避光染色30 min，使之與 TTC 染液充分接觸，PBS 沖洗切片 3 次后，將切片置于 10% 甲醛溶液中固定 12 h，增強(qiáng)顏色對(duì)比。非梗死心肌組織呈現(xiàn)磚紅色，梗死心肌組織呈現(xiàn)灰白色。采集圖像，用圖像分析軟件 Image J 進(jìn)行處理。

IS為梗死面積(infarct size)，AAR為心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)面積(area at risk)。心肌梗死面積(IS/AAR)/%=(梗死面積之和/全心面積)×100%。

1.4.4 大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)檢查

蘇木精 & 伊紅(Hematoxylin & eosin，H & E)染色法觀察心肌組織病理學(xué)形態(tài)變化，蘇木精將核酸染為紫藍(lán)色；紅色為伊紅染色。取心尖及左心室壁進(jìn)行石蠟包埋，切片。將樣本過(guò)二甲苯及梯度酒精進(jìn)行脫蠟及水化，蘇木精染色3 min，1%鹽酸酒精分化30 s，0.5%伊紅染色10～15 s，然后依次過(guò)梯度酒精和二甲苯進(jìn)行脫水，通風(fēng)櫥中晾干，用中性樹(shù)膠封片，待中性樹(shù)膠凝固后，顯微鏡下觀察拍照(×200)。

1.4.5 大鼠心肌組織自噬蛋白表達(dá)的測(cè)定

再灌注結(jié)束后，取心肌組織80 mg，用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白，將蛋白在10%SDS-PAGE上分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(美國(guó)密理博)。將膜用TBST或BSA在25 ℃封閉1 h，在4 ℃與一抗孵育過(guò)夜(GAPDH、LC3、Beclin1、 Bcl-2、mTOR、P-mTOR、AMPKα1 +α2、p-AMPKα1 +α2、AKT和p-AKT的稀釋比例分別為1∶5000、1∶500、1∶2000、1∶2000、1∶000、1∶1000、1∶2000、1∶2000、 1∶1000、 1∶1000)，然后在25 ℃與HRP偶聯(lián)的二抗孵育1 h。最后，通過(guò)Image J軟件(美國(guó)馬里蘭州國(guó)立衛(wèi)生研究院)對(duì)條帶進(jìn)行分析。GAPDH被用作內(nèi)部參考。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響

正常心肌組織染色呈現(xiàn)磚紅色，而心肌梗死組織多為蒼白色。結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組心肌梗死面積顯著升高(P<0.001)。與模型組相比，TFDM組心肌梗死面積明顯減少(P<0.001)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與TFDM組相比，香青蘭總黃酮聯(lián)合mTOR抑制劑、AMPK抑制劑及PI3K抑制劑組均使心肌梗死面積明顯增加(P<0.001)，說(shuō)明香青蘭總黃酮對(duì)心肌的保護(hù)作用被抑制劑所抵消(圖1)。

TFR：TFDM聯(lián)合mTOR抑制劑Rapamycin組；TFC：TFDM聯(lián)合AMPK抑制劑Compound C組；TFL：TFDM聯(lián)合PI3K抑制劑LY294002組。 與sham組相比，***P<0.001；與I/R組相比，###P<0.001；與TFDM組相比，&&&P<0.001。圖1 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響

2.2 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)的影響

假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，界限清晰，呈束狀分布，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，分布勻稱(chēng)；模型組心肌纖維排列紊亂，橫向條紋消失，心肌細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)，細(xì)胞腫脹破裂，壞死，細(xì)胞核變形移位；香青蘭總黃酮明顯改善了上述癥狀，而香青蘭總黃酮聯(lián)合mTOR抑制劑、AMPK抑制劑及PI3K抑制劑組，香青蘭總黃酮的保護(hù)效應(yīng)消失，表明抑制劑均可以不同程度的抑制香青蘭總黃酮的保護(hù)效應(yīng)(圖2)。

TFR：TFDM聯(lián)合mTOR抑制劑Rapamycin組；TFC：TFDM聯(lián)合AMPK抑制劑Compound C組；TFL：TFDM聯(lián)合PI3K抑制劑LY294002組。圖2 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌病理學(xué)形態(tài)的影響(HE染色×200)

2.3 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌LC3、Beclin1以及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

與Sham組相比，模型組LC3以及Beclin1的蛋白水平明顯升高，Bcl-2的蛋白水平明顯降低，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與模型組相比，TFDM組LC3(P<0.05)以及Beclin1(P<0.01)的蛋白水平降低，Bcl-2的蛋白水平升高(P<0.05)；與TFDM組相比，TFDM聯(lián)合mTOR抑制劑Rapamycin組LC3(P<0.01)的蛋白水平降低，TFDM聯(lián)合mTOR抑制劑、AMPK抑制劑以及PI3K抑制劑組Beclin1蛋白水平均不同程度的升高(P<0.05)，Bcl-2的蛋白水平明顯降低。

說(shuō)明香青蘭總黃酮可抑制大鼠心肌LC3以及Beclin1蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞自噬水平，提高抗凋亡能力保護(hù)心肌。但是，香青蘭總黃酮對(duì)心肌的保護(hù)作用均被抑制劑所抵消，表明mTOR、AMPK以及AKT參與香青蘭總黃酮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用(圖3)。

TFR：TFDM聯(lián)合mTOR抑制劑Rapamycin組；TFC：TFDM聯(lián)合AMPK抑制劑Compound C組；TFL：TFDM聯(lián)合PI3K抑制劑LY294002組。 與sham組相比，***P<0.001；與I/R組相比，#P<0.05，##P<0.01；與TFDM組相比，&P<0.05，&&P<0.01。圖3 香青蘭總黃酮對(duì)LC3、Beclin1及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

2.4 香青蘭總黃酮對(duì)大鼠心肌mTOR、AMPK及AKT蛋白表達(dá)的影響

與Sham組相比，模型組p-mTOR(P<0.01)、p-AMPK(P<0.001以及p-AKT(P<0.01)蛋白水平明顯降低；與模型組相比，香青蘭總黃酮升高了p-mTOR(P<0.05)、p-AMPK(P<0.001)以及p-AKT(P<0.05)蛋白水平；與TFDM組相比，TFDM聯(lián)合mTOR抑制劑組p-mTOR蛋白表達(dá)下降(P<0.05)，TFDM聯(lián)合AMPK抑制劑組p-AMPK表達(dá)下降(P<0.001)，TFDM聯(lián)合PI3K抑制劑組p-AKT表達(dá)下降(P<0.01)，說(shuō)明抑制劑的使用是成功的。抑制劑組p-mTOR、p-AMPK和p-AKT的表達(dá)均不同程度的降低，其中TFDM聯(lián)合AMPK抑制劑組p-mTOR水平升高，與TFDM相比無(wú)顯著性差異，表明香青蘭總黃酮能調(diào)控AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平(圖4)。

TFR：TFDM聯(lián)合mTOR抑制劑Rapamycin組；TFC：TFDM聯(lián)合AMPK抑制劑Compound C組；TFL：TFDM聯(lián)合PI3K抑制劑LY294002組。 與sham組相比，**P<0.01，***P<0.001；與I/R組相比，#P<0.05，###P<0.001；與TFDM組相比，&P<0.05，&&P<0.01，&&P<0.001。圖4 香青蘭總黃酮對(duì)mTOR、AMPK及AKT蛋白表達(dá)的影響

3 討論

大鼠在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中，心肌組織明顯受損，其中心肌梗死面積是評(píng)價(jià)心肌損傷的重要指標(biāo)[7，13]，本研究采用香青蘭總黃酮持續(xù)給藥7天，結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支缺血30 min，再灌注2 h建立心肌缺血再灌注損傷模型。結(jié)果顯示，與模型組相比，香青蘭總黃酮能顯著降低大鼠心肌梗死面積。組織病理學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明香青蘭總黃酮能明顯改善大鼠心肌組織病理學(xué)損傷，對(duì)MIRI大鼠具有明顯的保護(hù)作用。香青蘭總黃酮聯(lián)合mTOR抑制劑、AMPK抑制劑及PI3K抑制劑組，香青蘭總黃酮的保護(hù)作用被抑制，香青蘭總黃酮對(duì)MIRI的保護(hù)作用與AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

自噬是以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬體為標(biāo)志的細(xì)胞自我消化過(guò)程，多種自噬相關(guān)基因參與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。LC3及Beclin1是自噬過(guò)程中重要的蛋白，隨著自噬程度的不斷加重而升高。其中，LC3是自噬標(biāo)志性分子，Beclin1可以介導(dǎo)自噬體膜的形成。Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，隨著心肌損傷的加重而不斷降低[14-15]。因此，降低LC3及Beclin1蛋白表達(dá)，升高Bcl-2蛋白表達(dá)是保護(hù)心肌缺血再灌注損傷重要手段。結(jié)果顯示，與模型組相比，香青蘭總黃酮降低了LC3II/LC3I的比值及Beclin1蛋白表達(dá)，上調(diào)了Bcl-2蛋白的表達(dá)，表明香青蘭總黃酮可抑制細(xì)胞自噬，減弱細(xì)胞凋亡。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)一直被認(rèn)為是自噬的負(fù)調(diào)控因子，在MIRI誘導(dǎo)的自噬過(guò)程中，mTOR 的活性隨自噬的加重而不斷減少。mTOR是AMPK和AKT下游蛋白[16-18]，AMPK/mTOR及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路為自噬調(diào)控中的抑制性通路，在自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，研究自噬與AMPK/mTOR及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在MIRI過(guò)程中的作用機(jī)制具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，模型組中心肌細(xì)胞內(nèi)p-mTOR、p-AMPK及p-AKT蛋白表達(dá)明顯降低，香青蘭總黃酮升高了p-mTOR、p-AMPK及p-AKT蛋白表達(dá)。然而，TFDM聯(lián)合mTOR抑制劑、AMPK抑制劑組及PI3K抑制劑組p-mTOR、p-AMPK和p-AKT的表達(dá)均不同程度的降低，提示抑制劑干預(yù)后AMPK/mTOR及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的表達(dá)被抑制，自噬增強(qiáng)，香青蘭總黃酮對(duì)心肌的保護(hù)作用被抑制劑所抵消。其中TFDM聯(lián)合AMPK抑制劑組p-mTOR的表達(dá)升高，但與TFDM相比無(wú)顯著性差異，表明對(duì)mTOR的調(diào)控過(guò)程中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可能占主導(dǎo)地位。

本研究結(jié)果提示，香青蘭總黃酮可以通過(guò)激活A(yù)MPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制自噬，減弱細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)缺血心肌。mTOR是自噬通路的調(diào)控中心，在本研究中，我們僅研究了AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在MIRI的重要作用，它不是香青蘭總黃酮發(fā)揮心肌保護(hù)的唯一機(jī)制，因此，未來(lái)有更多的工作需要進(jìn)一步研究。