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    基因芯片篩選脂蛋白脂酶基因雜合敲除小鼠的差異表達(dá)基因 和通路

    2020-08-18 10:00:44陳寧欣韓亭亭胡耀敏
    關(guān)鍵詞:胰島通路小鼠

    陳寧欣,韓亭亭,鄭 爽,劉 偉,胡耀敏

    上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科,上海 200127

    隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人們生活水平的提高,罹患糖尿病的人群數(shù)量呈快速攀升的趨勢(shì)。2013 年全國(guó)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,我國(guó)18 歲及以上人群的糖尿病及糖尿病前期的患病率分別為10.9%和35.7%[1]。糖尿病的發(fā)生可增加各類(lèi)慢性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn),不僅會(huì)危害人們的生命健康,也給國(guó)家?guī)?lái)了較重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。因此,闡明糖尿病的發(fā)病機(jī)制對(duì)于該疾病的預(yù)防和治療具有重大意義。目前,脂毒性在2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的發(fā)生與發(fā)展中扮演重要角色。Banting 科學(xué)成就獎(jiǎng)獲得者M(jìn)cGarry 教授[2]提出,脂代謝障礙是T2DM的原發(fā)病理生理改變,T2DM 糖代謝紊亂的根源即為脂代謝異常,甚至還將T2DM 稱為“糖脂病”。流行病學(xué)研究調(diào)查結(jié)果顯示,高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia,HTG)是T2DM 發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是催化乳糜微粒(chylomicron,CM)和極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)中三酰甘油(triacylglycerol,TAG)水解的關(guān)鍵酶,其結(jié)構(gòu)和功能的異??梢l(fā)HTG[4]。本課題組的前期研究[5-6]發(fā)現(xiàn),Lpl 基因敲除的雜合(Lpl+/-)小鼠可通過(guò)HTG 直接誘發(fā)糖代謝異常;隨后,進(jìn)一步研究[7]發(fā)現(xiàn)Lpl+/-小鼠出現(xiàn)了胰島脂滴沉積,經(jīng)胰島β 細(xì)胞葡萄糖刺激后,其胰島素分泌能力出現(xiàn)明顯下降。繼而推測(cè),脂毒性可通過(guò)引起胰島β 細(xì)胞功能障礙來(lái)誘發(fā)糖代謝異常,但其具體的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。

    基因芯片具有高通量及高靈敏度的優(yōu)點(diǎn),能夠高效率地篩選正常組織和病理組織中差異表達(dá)的基因,有助于深入認(rèn)識(shí)疾病發(fā)生的分子機(jī)制,以達(dá)到對(duì)疾病的早期診斷及干預(yù)。本研究通過(guò)基因芯片篩選Lpl+/-小鼠和野生型(wild type,WT)C57BL/6 小鼠的胰島組織中的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),并利用生物信息學(xué)分析對(duì)這些基因進(jìn)行聚類(lèi)和功能富集分析,以期為尋找脂毒性介導(dǎo)T2DM 的發(fā)病過(guò)程中的新的分子機(jī)制提供參考和依據(jù)。

    1 對(duì)象和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

    40 周齡SPF 級(jí)雄性Lpl+/-小鼠及WT C57BL/6 小鼠由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供[生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2016-2018],體質(zhì)量為(25±5) g。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物房清潔級(jí)屏障系統(tǒng)中,使用許可證號(hào)為SYXK(滬)2011-2021。小鼠飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料,分籠喂養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水。飼養(yǎng)條件如下:照明周期為12 h/12 h,溫度為21 ℃,濕度為50%~55%。所有動(dòng)物相關(guān)操作均遵循國(guó)家及上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院有關(guān)動(dòng)物倫理規(guī)定及條例。

    膠原酶Ⅴ(Sigma,美國(guó)),1640 培養(yǎng)基(Gibco,美國(guó)),胎牛血清(Gibco,美國(guó)),TRIzol 試劑(Invitrogen,美國(guó)),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,日本),SYBR Premix Ex Taq 試劑盒(TaKaRa,日本)。

    1.2 研究方法

    1.2.1 胰島的分離及純化 麻醉后取小鼠仰臥位固定,顯微鏡下找到小鼠膽總管近肝門(mén)處,經(jīng)膽總管插管逆行注入0 ℃膠原酶Ⅴ消化液。待胰腺緩慢膨脹后,摘除整個(gè)胰腺,后經(jīng)膠原酶Ⅴ消化、密度梯度離心法分離胰島。于顯微鏡下手工挑選完整胰島,加入1640 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h 后更換培養(yǎng)基,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 微陣列芯片雜交與數(shù)據(jù)分析 微陣列芯片雜交實(shí)驗(yàn)委托上?;鬯闵锛夹g(shù)有限公司完成。使用STAR 軟件統(tǒng)計(jì)基因的原始序列計(jì)數(shù),使用R 語(yǔ)言中DESeq2 篩選Lpl+/-小鼠及WT 小鼠胰島組織中DEGs?;虮磉_(dá)的差異用P 值和差異倍數(shù)(fold change,F(xiàn)C)的對(duì)數(shù)(log2FC)表 示。將P<0.05 且|log2FC|>2 的 基 因 視 為DEGs。使用R 語(yǔ)言中的clusterProfiler 包對(duì)DEGs 進(jìn)行GO(Gene Ontology) 功 能 分 析 和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome)通路分析,分析結(jié)果以P<0.05 為入選標(biāo)準(zhǔn)。

    1.2.3 RNA 抽提及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 將離體培養(yǎng)的胰島組織收集于離心管中,低速離心獲得沉淀。向其中加入磷酸鹽緩沖液漂洗后,立即加入總RNA 抽提試劑TRIzol,并依照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作提取總RNA。而后,采用超微量分光光度計(jì)對(duì)RNA 濃度進(jìn)行測(cè)定,分裝后凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。采用?shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative realtime PCR,qPCR)對(duì)DEGs 中與胰島β 細(xì)胞功能最密切相關(guān)的基因進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū),將相關(guān)試劑與0.5 μg 總RNA 混合均勻(總體積為10 μL,加入RNA 體積根據(jù)濃度計(jì)算)進(jìn)行反應(yīng),條件如下:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 5 min。而后使用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒,將1 μL cDNA 與相關(guān)試劑混合配置10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行qPCR 反應(yīng),條件如下:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,共20 個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,Gapdh)為內(nèi)參,基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次分析(即設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔)。Gremlin 1(Grem1)、骨形態(tài)形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,Bmp-2)、Bmp-4 及Gapdh 引物均由上海冠泰生物科技有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1。

    表1 qPCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

    Continued Tab

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用GraphPad Prism 7.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。qPCR 數(shù)據(jù)用±s 表示,采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 篩選DEGs

    本研究采用R 語(yǔ)言中DESeq2 對(duì)Lpl+/-小鼠及WT 小鼠胰島組織中的DEGs 進(jìn)行篩選,并采用火山圖和聚類(lèi)熱圖進(jìn)行分析。結(jié)果顯示共篩選出187 個(gè)DEGs,上調(diào)基因6 個(gè)、下調(diào)基因181 個(gè)(圖1、2);其中,表達(dá)差異最為顯著的前10 個(gè)基因見(jiàn)表2。

    圖1 Lpl+/-小鼠與WT 小鼠DEGs 的火山圖分析Fig 1 Volcano plot of DEGs between Lpl+/- mice and WT mice

    圖2 Lpl+/-小鼠與WT 小鼠DEGs 的聚類(lèi)熱圖Fig 2 Heat map of DEGs between Lpl+/- mice and WT mice

    表2 DEGs 中排名前10 的基因列表Tab 2 Top 10 genes of DEGs

    2.2 GO 功能分析

    本研究采用R 語(yǔ)言中的clusterProfiler 包進(jìn)行GO 功能分析,以P<0.05 進(jìn)行篩選,結(jié)果(圖3)顯示DEGs主要富集在與T 細(xì)胞、B 細(xì)胞等免疫細(xì)胞激活和侵襲以及細(xì)胞黏附相關(guān)的生物過(guò)程,同時(shí)與細(xì)胞質(zhì)膜蛋白等細(xì)胞組成和細(xì)胞因子受體活性調(diào)節(jié)等生物功能密切相關(guān)。

    圖3 DEGs 的GO 功能分析Fig 3 GO function analysis of DEGs

    2.3 KEGG 通路分析

    隨后,本研究使用KEGG 對(duì)DEGs 進(jìn)行通路富集分析,結(jié)果(圖4)顯示這些基因主要富集在免疫細(xì)胞增殖分化、炎癥信號(hào)通路、血管形成和細(xì)胞黏附相關(guān)通路上,且與Lpl+/-小鼠的胰島β 細(xì)胞功能障礙相關(guān)。

    圖4 DEGs 的KEGG 通路分析Fig 4 KEGG pathway analysis of DEGs

    2.4 關(guān)鍵基因的表達(dá)驗(yàn)證

    在上述羅列的前10 個(gè)DEGs 中,Grem1 編碼的蛋白gremlin 1 為BMP 拮抗劑家族的成員[8],該蛋白可通過(guò)與BMP-2、BMP-4 蛋白的直接結(jié)合阻斷BMP 作用的信號(hào)通路。研究[9]發(fā)現(xiàn),BMP 可參與胚胎期胰腺生長(zhǎng)、增殖及分化的調(diào)節(jié),與胰島β 細(xì)胞功能有密切關(guān)系。基于此,本研究選擇Grem1 進(jìn)行驗(yàn)證;結(jié)果(圖5)顯示,與WT小鼠相比,Lpl+/-小鼠胰島組織中Grem1 的表達(dá)量下降了75%,而B(niǎo)mp-2 及Bmp-4 的表達(dá)量則增加了1 倍甚至 更多。

    圖5 qPCR 檢測(cè)WT 小鼠和Lpl+/-小鼠胰島組織中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平Fig 5 Expression levels of key genes in the islet tissues of WT mice and Lpl+/- mice

    3 討論

    胰島β 細(xì)胞功能異常是導(dǎo)致T2DM 的核心病理生理基礎(chǔ)之一,同時(shí)脂代謝紊亂在其發(fā)病過(guò)程中亦發(fā)揮著重要作用。脂毒性是指血中的游離脂肪酸(free fatty acid,F(xiàn)FA)水平長(zhǎng)期較高,而超過(guò)了脂肪組織的儲(chǔ)存能力及各組織對(duì)FFA 的氧化能力,使得過(guò)多的FFA 以TAG 的形式沉積在非脂肪組織,從而造成對(duì)該組織的損傷[2]。FFA 的長(zhǎng)期作用可誘導(dǎo)β 細(xì)胞凋亡、引起β 細(xì)胞壞死,以減少β 細(xì)胞數(shù)目。研究[6]發(fā)現(xiàn),呈現(xiàn)HTG 的Lpl+/-小鼠的脂代謝障礙在發(fā)生時(shí)間的順序上優(yōu)先于糖代謝紊亂,可以很好地模擬HTG 引發(fā)T2DM 的病理生理過(guò)程。本課題組的前期研究[7]表明,Lpl+/-小鼠出現(xiàn)胰島脂滴沉積、胰島β 細(xì)胞團(tuán)體積減小同時(shí)細(xì)胞凋亡增加,Lpl+/-小鼠胰島細(xì)胞經(jīng)葡萄糖刺激后胰島素的分泌能力明顯下降,而這些結(jié)果亦在體外高脂模型(棕櫚酸刺激的胰島β 細(xì)胞)中得到了進(jìn)一步證實(shí)。為了探討可能的分子機(jī)制,本研究將Lpl+/-小鼠及WT 小鼠的胰島進(jìn)行分離并純化,利用基因芯片篩選小鼠胰島中的DEGs,并采用生物信息學(xué)方法對(duì)這些基因進(jìn)行聚類(lèi)分析和功能富集,選擇關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。

    在表達(dá)差異最為顯著的前10 個(gè)基因中,Ighe、Ighg1、Ighg2b、Igkv9-120 是免疫反應(yīng)中抗原結(jié)合、免疫球蛋白產(chǎn)生及免疫球蛋白受體結(jié)合相關(guān)的分子;Ifi202b 參與黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)炎癥體激活的負(fù)向調(diào)控,且有研究[10]表明該基因還參與了小鼠脂肪干細(xì)胞的脂肪生成;有研究者發(fā)現(xiàn),Ubd 在老化和慢性疾病中具有免疫代謝調(diào)節(jié)作用,還可介導(dǎo)慢性腎臟疾病中核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的激活從而促進(jìn)腎小管間質(zhì)炎癥的發(fā)生與發(fā)展[11-12];Mmp12 與動(dòng)脈硬化相關(guān),還可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平來(lái)調(diào)節(jié)小鼠的炎癥反應(yīng)[13];Cxcl9 在皮炎的小鼠模型中表達(dá)顯著升高,且與炎癥的嚴(yán)重程度相關(guān),同時(shí)也參與了某些自身免疫疾病的發(fā)生[14];Gimap3 可與核酸及GTP 相結(jié)合,與T 細(xì)胞發(fā)生和存活相關(guān)。針對(duì)以上基因,目前暫無(wú)相關(guān)證據(jù)表明其與胰島β 細(xì)胞功能或T2DM 存在相關(guān)性。但值得注意的是,Grem1 編碼合成的gremlin 1 屬于BMP 拮抗劑家族的重要成員,可阻斷下游BMP 信號(hào)通路。BMP 是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族的一員,包括大量保守結(jié)構(gòu)區(qū)域的分泌信號(hào)分子,可在控制胚胎發(fā)育及分化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,還參與胚胎期胰腺生長(zhǎng)、增殖及分化的調(diào)節(jié)[9]。有研究[15]表明,促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)可能通過(guò)激活BMP-2 誘導(dǎo)胰島β 細(xì)胞的凋亡及功能障礙。而B(niǎo)MP-2 和BMP-4 的表達(dá)則能夠?qū)σ葝uβ 細(xì)胞的增殖及分泌功能產(chǎn)生抑制作用[16]。Sakhneny 等[17]研究發(fā)現(xiàn),胰島β 細(xì)胞可表達(dá)BMP-4 的受體,且BMP-4 與β 細(xì)胞功能相關(guān)。上述研究均提示,BMP 信號(hào)通路可能在糖尿病胰島功能異常中扮演著重要角色。因此,本研究利用qPCR 對(duì)基因芯片的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),Lpl+/-小鼠胰島組織中Grem1 的表達(dá)量較WT 小鼠顯著下降,而B(niǎo)mp-2 及Bmp-4 的表達(dá)量則明顯增加;繼而推測(cè),gremlin 1 及其下游BMPs 信號(hào)通路可能參與了由脂毒性介導(dǎo)的胰島β 細(xì)胞功能障礙的發(fā)生及發(fā)展。此外,還有研究[18-19]表明Grem1 可能與T2DM 患者的蛋白尿及糖尿病腎病的發(fā)生相關(guān)。

    通過(guò)對(duì)DEGs 進(jìn)行GO 功能分析和KEGG 通路分析,發(fā)現(xiàn)DEGs 參與了免疫細(xì)胞增殖分化、炎癥信號(hào)通路、血管形成和細(xì)胞黏附相關(guān)通路。已經(jīng)有研究[20]證實(shí)了脂毒性誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在胰島功能障礙中的作用,即在高脂喂養(yǎng)的小鼠中,胰島組織中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著增加;還有研究[21]發(fā)現(xiàn)胰島β 細(xì)胞內(nèi)的脂肪細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子及趨化因子,通過(guò)激活炎癥信號(hào)通路導(dǎo)致β 細(xì)胞功能障礙。本課題組最新的研究[7]結(jié)果也證實(shí),在Lpl+/-小鼠血清中和棕櫚酸刺激的胰島β 細(xì)胞上清液中,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 及巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibition factor,MIF)的水平明顯上升,Lpl+/-小鼠胰島組織上清液中MIF 的表達(dá)也顯著增加,同時(shí)Lpl+/-小鼠胰島組織和棕櫚酸刺激的胰島β 細(xì)胞中NF-κB 抑制因子(inhibitor of nuclear factor-κB,IκB) /NF-κB 炎 癥 信 號(hào)通路被激活,且與β 細(xì)胞功能障礙密切相關(guān)。而另有研究[22]發(fā)現(xiàn),F(xiàn)FA 可招募外周循環(huán)中的炎癥型單核細(xì)胞至胰島組織中并轉(zhuǎn)化為M1 型巨噬細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對(duì)胰島組織中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的上調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞功能 障礙。

    本研究GO 功能分析還發(fā)現(xiàn),DEGs 主要富集在T 細(xì)胞、B 細(xì)胞等免疫細(xì)胞激活的生物過(guò)程,同時(shí)亦有越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注自身免疫在糖尿病發(fā)病過(guò)程中的作用。自身免疫是一種多因素參與的對(duì)自身構(gòu)成成分產(chǎn)生免疫反應(yīng)的過(guò)程,主要特點(diǎn)是自身耐受的缺失以及B 細(xì)胞和T細(xì)胞慢性的過(guò)度反應(yīng)。研究[23]顯示,T2DM 患者胰島中的促炎細(xì)胞因子被激活,可引發(fā)免疫反應(yīng)導(dǎo)致胰島功能異常,這種由炎癥導(dǎo)致的組織損傷會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)自身免疫反應(yīng),從而形成惡性循環(huán);且在T2DM 患者的胰島中可觀察到免疫細(xì)胞的交替和免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。此外,M1 型巨噬細(xì)胞可分泌大量的促炎因子包括IL-12、TNF-α、IL-1、IL-6 等以及趨化因子以參與炎癥反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞功能障礙的發(fā)生。而B(niǎo) 細(xì)胞與T 細(xì)胞的直接作用對(duì)胰島β 細(xì)胞功能的影響尚缺乏相關(guān)證據(jù)。因此,更加深入地探索自身免疫在T2DM 發(fā)生與發(fā)展中的作用和相關(guān)機(jī)制,或?qū)⒂兄谠谂R床上對(duì)糖尿病的分型和治療提供參考。

    綜上所述,本研究通過(guò)基因芯片篩選WT 小鼠及Lpl+/-小鼠的DEGs,并針對(duì)這些基因開(kāi)展相關(guān)功能及通路分析,發(fā)現(xiàn)DEGs 主要富集于自身免疫和炎癥信號(hào)通路,同時(shí)脂毒性導(dǎo)致的Grem1 表達(dá)下調(diào)可能與胰島β 細(xì)胞功能障礙的發(fā)生密切相關(guān)。該結(jié)果或?qū)檫M(jìn)一步理解和認(rèn)識(shí)脂毒性導(dǎo)致T2DM 的發(fā)病機(jī)制提供參考,同時(shí)也將為后續(xù)的T2DM 病因研究提供新的方向。

    參·考·文·獻(xiàn)

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