高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定羊肚菌(Morchella sextelata)菌絲中單核苷類化合物含量的研究

馬曉穎,呂立濤,曹 君,李 躍,王 紅

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,遼寧省食用菌優(yōu)質(zhì)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧沈陽(yáng) 110161)

羊肚菌(Morchella)是一種子囊菌,它味道鮮美,香味獨(dú)特,營(yíng)養(yǎng)豐富,保健功能全?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,羊肚菌有“四抗”“兩降”“一調(diào)節(jié)”的藥用功效,即抗射線、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞作用,降血壓、降血脂和調(diào)節(jié)免疫力的功效[1]。它既是宴會(huì)上的珍品,又是醫(yī)藥中久負(fù)盛名的良藥[2],具有很大的研究?jī)r(jià)值。羊肚菌中有很多功能性物質(zhì),包括多糖、氨基酸和一些核苷類化合物[1]。核苷類成分具有降血脂、預(yù)防血栓及血管疾病、維持細(xì)胞生命、免疫調(diào)節(jié)、改善腦細(xì)胞代謝以及調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)等多種生理活性[3-4]。核苷類多被用于抗腫瘤抗病毒的藥物中,核苷類是治療肝炎及艾滋病等病毒性疾病的首選藥物[5]。

目前被發(fā)現(xiàn)的“長(zhǎng)壽藥”煙酰胺單核苷酸(NMN)也是一種單核苷類化合物,有研究發(fā)現(xiàn),NMN能夠顯著改善小鼠的生理機(jī)能的衰退,可以增強(qiáng)能量代謝,改善胰島素敏感性和血漿中脂質(zhì)的分布情況,并且改善眼部功能[6]。在食用菌中,已經(jīng)報(bào)道的含有單核苷類化合物的有蟲草[7]、猴頭菇、香菇[8]等,研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌的主要成分有多糖、氨基酸、脂肪酸和一些無(wú)機(jī)元素和色素等[9],單核苷類化合物研究較少,核苷類化合物檢測(cè)方法有很多種,目前一般采用高效液相色譜的方法進(jìn)行測(cè)定[10-12],高效液相可以不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制,并且應(yīng)用范圍較廣;但是樣品分析時(shí)間長(zhǎng)、色譜柱易污染、分析運(yùn)營(yíng)成本高;毛細(xì)管電泳法的特點(diǎn)是樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單,同時(shí)可測(cè)定多個(gè)成分的含量,較高效液相法簡(jiǎn)便、快速;薄層色譜掃描法和紫外可見(jiàn)分光光度法的特點(diǎn)是儀器設(shè)備要求低,操作簡(jiǎn)便,但方法的靈敏度和重現(xiàn)性差[13]。且未見(jiàn)有關(guān)于高效毛細(xì)管電泳測(cè)定羊肚菌單核苷類化合物含量的報(bào)道。

本文以羊肚菌Morchellasextelata菌絲提取物為測(cè)定目標(biāo),利用高效毛細(xì)管-二極管陣列檢測(cè)器來(lái)測(cè)定其中的單核苷化合物(3-脫氧腺苷,腺苷,鳥苷,尿苷,肌苷)的種類和含量,該方法簡(jiǎn)單可靠,重復(fù)性好,不僅可用于羊肚菌中單核苷類化合物含量的測(cè)定,對(duì)其他樣品中的單核苷化合物的定性,定量檢測(cè)都有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌(Morchellasextelata) 來(lái)源于遼寧省農(nóng)科院食用菌研究所;野生羊肚菌Mes-6、Mes-9 采集于遼寧省沈陽(yáng)市康平縣;梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)和七妹羊肚菌(Morchellaseptimelata) 購(gòu)于四川農(nóng)科院;硼砂Na2B4O7、硼酸H3BO3、磷酸氫二鈉Na2HPO4、磷酸二氫鈉NaH2PO4色譜純,美國(guó)Amresco生物試劑公司;單核苷化合物標(biāo)準(zhǔn)品、十二烷基磺酸鈉 色譜純,北京索萊寶科技有限公司;β-環(huán)糊精 分析純,上海源葉生物科技有限公司;甲醇 色譜純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;試驗(yàn)用水 為超純水;馬鈴薯液體培養(yǎng)基:將200 g馬鈴薯去皮切碎,煮爛后取得土豆汁,加入20 g葡萄糖或者蔗糖,加入瓊脂15～20 g,加水至1000 mL,121 ℃滅菌即可。

P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀 美國(guó)貝克曼公司;PHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁科技發(fā)展有限責(zé)任公司;ME204E電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;HQ5200超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;HZQ-QX全溫振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;GRX6熱空氣消毒箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;T25勻漿機(jī) 德國(guó)IKA集團(tuán);CascadaTM實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng) Pall corporation;微孔濾膜 水系和有機(jī)系孔徑0.22 μm,津隆設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配制 用精密天平分別稱取3-脫氧腺苷、腺苷、鳥苷、尿苷、肌苷適量,用50%甲醇溶解并定容配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液,上述溶液均用0.22 μm孔徑的有機(jī)濾膜濾過(guò),超聲除氣,置冰箱4 ℃避光保存。

1.2.2 羊肚菌菌絲提取物的提取方法確定 將羊肚菌Morchellasextelata菌種活化以1∶200比例接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中,25 ℃,180 r/min搖床培養(yǎng)7 d。將發(fā)酵液過(guò)濾后,菌絲體用無(wú)菌水沖洗3次,放入空氣消毒箱里60 ℃烘干得干菌絲體,稱取1 g放入50 mL離心管中,加入30 mL超純水,用勻漿機(jī)打勻;然后利用以下三種方式進(jìn)行提取:a超聲提取30 min;在水浴鍋中95 ℃加熱保溫提取2 h;b選取單獨(dú)超聲30 min;c單獨(dú)水浴鍋95 ℃加熱保溫提取2 h;三種方法進(jìn)行樣品的提取,通過(guò)比對(duì)不同提取方式下羊肚菌菌絲的指紋圖譜來(lái)確定實(shí)驗(yàn)提取方法。

1.2.3 電泳條件的確定 高效毛細(xì)管電泳DAD二極管檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)器工作環(huán)境要干燥,環(huán)境濕度不大于80%,溫度變化小,且檢測(cè)過(guò)程中儀器不要搖動(dòng),接通電泳后儀器要預(yù)熱30 min后使用。

1.2.3.1 紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 利用毛細(xì)管電泳DAD二極管檢測(cè)器對(duì)5種單核苷類化合物(3-脫氧腺苷、腺苷、鳥苷、尿苷、肌苷)進(jìn)行190～300 nm波長(zhǎng)下吸收值的測(cè)定,選擇最佳的試驗(yàn)波長(zhǎng)。

1.2.3.2 運(yùn)行電壓的確定 本試驗(yàn)考察15、18、20、25、30 kV作為運(yùn)行分離電壓對(duì)分離5種單核苷類化合物的影響,波長(zhǎng)為1.2.3.1中篩選出的最佳試驗(yàn)波長(zhǎng),運(yùn)行緩沖液為pH9.0的25 mmol/L硼砂緩沖液,壓力0.5 Psi進(jìn)樣10 s,運(yùn)行時(shí)間為60 min。

1.2.3.3 緩沖液pH的確定 本試驗(yàn)考察pH9.0、9.2、9.4和9.6的硼砂緩沖液為運(yùn)行緩沖液pH對(duì)分離5種單核苷類化合物的影響,波長(zhǎng)為1.2.3.1中篩選出的最佳試驗(yàn)波長(zhǎng),運(yùn)行緩沖液其他條件為25 mmol/L硼砂緩沖液,運(yùn)行電壓為20 kV,壓力0.5 Psi進(jìn)樣10 s,運(yùn)行時(shí)間為60 min。

1.2.3.4 緩沖液濃度的確定 實(shí)驗(yàn)考察10、20、30、50 mmol/L的硼砂緩沖液對(duì)分離5種單核苷類化合物的影響,波長(zhǎng)為1.2.3.1中篩選出的最佳試驗(yàn)波長(zhǎng)運(yùn)行緩沖液其他條件為pH9.0硼砂緩沖液,運(yùn)行電壓為20 kV,壓力0.5 Psi進(jìn)樣10 s,運(yùn)行時(shí)間為60 min。

1.2.3.5 活性添加劑的確定 分別考察0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL濃度的β-環(huán)糊精對(duì)分離5種單核苷類化合物的影響,將β-環(huán)糊精加入到緩沖液中(樣品中稀釋一倍的緩沖液同樣添加),波長(zhǎng)為1.2.3.1中篩選出的最佳試驗(yàn)波長(zhǎng),運(yùn)行緩沖液為pH9.0的25 mmol/L硼砂緩沖液,運(yùn)行電壓為20 kV,壓力0.5Psi進(jìn)樣10s,運(yùn)行時(shí)間為60 min。

1.2.3.6 進(jìn)樣時(shí)間的確定 試驗(yàn)分別考察5、8、10、15 s進(jìn)樣時(shí)間對(duì)分離5種單核苷類化合物的影響,波長(zhǎng)為1.2.3.1中篩選出的最佳試驗(yàn)波長(zhǎng),運(yùn)行緩沖液為pH9.0的25 mmol/L硼砂緩沖液,運(yùn)行電壓為20 kV,運(yùn)行時(shí)間為60 min。

1.2.4 方法精密度、穩(wěn)定性 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制成0.05 mg/mL連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定3次,記錄遷移時(shí)間和峰面積,計(jì)算出峰時(shí)間和峰面積的RSD值，確定方法的精密度;分別取50 μL的5種標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg/mL混合到一起,在室溫下放置0、2、4、6、8 h后,在最佳電泳條件下分別進(jìn)樣,每次3個(gè)重復(fù),計(jì)算遷移時(shí)間和面積的RSD值確定方法的穩(wěn)定性。

1.2.5 羊肚菌(Morchellasextelata)樣品的測(cè)定 高效毛細(xì)管電泳對(duì)羊肚菌(Morchellasextelata)中單核苷類化合物的測(cè)定采用內(nèi)標(biāo)法(5種標(biāo)準(zhǔn)品混合物),將5種標(biāo)準(zhǔn)品(1 mg/mL)各吸取40 μL配制成混合標(biāo)樣,再分別加入等比例的處理好的羊肚菌菌絲提取物中,剩下的用緩沖液定容到200 μL,將混合標(biāo)樣、羊肚菌菌絲提取物以及羊肚菌菌絲提取物加混標(biāo)分別進(jìn)樣,每一種樣品進(jìn)樣3次。按優(yōu)化得出的最優(yōu)電泳條件進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 羊肚菌其他菌種中單核苷化合物的測(cè)定 本試驗(yàn)所選擇的羊肚菌菌種為六妹羊肚菌(Morchellasextelata),是目前較為常用的人工栽培羊肚菌的菌種,抗雜能力強(qiáng),產(chǎn)量高,菌種穩(wěn)定性好。實(shí)驗(yàn)也收集了一些其他羊肚菌品種,有一部分是野生的,一部分是人工可栽培的。野生羊肚菌Mes-6、Mes-9、梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)和七妹羊肚菌(Morchellaseptimelata)菌絲按照最優(yōu)提取方法處理,對(duì)它們進(jìn)行處理后,用最優(yōu)電泳條件進(jìn)行樣品的分離,測(cè)定它們的單核苷含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌菌絲樣品提取方法的確定

在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)羊肚菌菌絲提取方法進(jìn)行了優(yōu)化,采用60 ℃烘干得干菌絲體,稱取1 g放入50 mL離心管中,加入30 mL超純水,用勻漿機(jī)打勻,然后利用三種方法進(jìn)行樣品的提取,通過(guò)比對(duì)不同提取方式下羊肚菌菌絲的指紋圖譜來(lái)確定實(shí)驗(yàn)提取方法。結(jié)果如圖1所示,單獨(dú)超聲和單獨(dú)水浴的提取方法使得毛細(xì)管電泳的指紋圖譜不完整,可能是由于提取不徹底導(dǎo)致,所以選擇先超聲后水浴的方法為最后的提取方法。

圖1 不同提取方法對(duì)羊肚菌指紋圖譜的影響 Fig.1 Effects of different extraction methodson the fingerprint of Morchella注:a超聲提取30 min,在水浴鍋中95 ℃加熱保溫2 h;b選取單獨(dú)超聲30 min;c單獨(dú)水浴鍋95 ℃加熱保溫2 h。

2.2 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)得:3-脫氧腺苷190～219 nm吸收值最高;腺苷是190～223 nm和247～275 nm;鳥苷是190～228 nm和237～285 nm;尿苷是190～218 nm;肌苷是190～214 nm。且3-脫氧腺苷在190～212 nm間有一個(gè)干擾峰,所以選擇214 nm為試驗(yàn)的運(yùn)行波長(zhǎng)(圖2)。

圖2 5種標(biāo)準(zhǔn)品214 nm下的吸收?qǐng)D譜Fig.2 Absorption spectra of five standards at 214 nm注:A:3-脫氧腺苷;B:腺苷;C:鳥苷;D:尿苷;E:肌苷；圖3～圖5，圖8同。

2.3 運(yùn)行電壓對(duì)樣品分離效果的影響

在毛細(xì)管電泳中,分離電壓對(duì)樣品的分離度和遷移時(shí)間有很大的影響。要盡可能選用比較高的電壓,以達(dá)到樣品分離的最佳狀態(tài),但是電壓越高各個(gè)物質(zhì)的距離越近,這樣遷移時(shí)間比較近的物質(zhì)就容易分不開,所以根據(jù)分離的物質(zhì)不同,選取的分離電壓需要優(yōu)化,以達(dá)到最佳的分離效果。圖3表明:隨著電壓的增高,5種單核苷類的遷移時(shí)間都向前移動(dòng),分離的順序?yàn)?-脫氧腺苷、腺苷、鳥苷、尿苷和肌苷。其中15 kV和18 kV分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng),20 kV以上均可達(dá)到20 min內(nèi)分離5種單核苷化合物的目的,但是30 kV鳥苷和尿苷的分離度過(guò)低,所以選擇25 kV為本試驗(yàn)的分離電壓。

圖3 不同分離電壓對(duì)5種單核苷化合物分離的影響Fig.3 The effect of different separation voltageson the separation of five mononucleosides

2.4 緩沖液pH對(duì)樣品分離的影響

緩沖液的酸堿性對(duì)物質(zhì)的分離有很大的影響,經(jīng)過(guò)緩沖液pH的優(yōu)化,即使有相近等電點(diǎn)的物質(zhì)也可以得到分離[14]。圖4表明,pH越大,5種標(biāo)準(zhǔn)品分得越開,在pH9.0時(shí)鳥苷和尿苷和腺苷都未得到很好的分離,pH9.2時(shí)鳥苷和尿苷也未得到分離,pH9.4和pH9.6時(shí)5種標(biāo)準(zhǔn)品的分離度較好,但是pH9.6時(shí)5種物質(zhì)的分離總時(shí)間大于20 min。所以選擇pH9.4為試驗(yàn)緩沖液pH。

圖4 不同緩沖液pH對(duì)5種單核苷化合物分離的影響Fig.4 The effect of pH in different buffers on theseparation of five kinds of mononucleoside compounds

2.5 緩沖液濃度對(duì)樣品分離的影響

緩沖液濃度會(huì)影響溶液的黏度,高濃度的硼酸鹽會(huì)增大樣品的分離度,但濃度過(guò)大,電流過(guò)大,焦耳熱效應(yīng)增加會(huì)使得樣品中各個(gè)物質(zhì)的峰變寬,延長(zhǎng)時(shí)間變長(zhǎng),從而降低了樣品的分離效率[15-16]。圖5表明,10、20 mmol/L硼砂緩沖液作為分離運(yùn)行緩沖液時(shí)腺苷、鳥苷和尿苷沒(méi)有分來(lái),除腺苷外,鳥苷和尿苷系統(tǒng)均未顯示遷移時(shí)間,30 mmol/L硼砂緩沖液鳥苷和尿苷的分離度沒(méi)有50 mmol/L的硼砂緩沖液高,因此選擇50 mmol/L為運(yùn)行緩沖液濃度。

圖5 不同緩沖液濃度對(duì)5種單核苷化合物分離的影響Fig.5 The effects of different buffer concentrationson the separation of five mononucleoside compounds

2.6 β-環(huán)糊精添加量對(duì)樣品分離的影響

為了不同的分離分析目的,經(jīng)常需要在緩沖溶液中加入不同的添加劑,表面活性劑可起到改變電滲流,溶解疏水性溶質(zhì)等作用[17]。圖6表明,在添加的4種不同濃度的β-環(huán)糊精的緩沖液中,5種單核苷類化合物不同濃度的β-環(huán)糊精添加到緩沖液中后標(biāo)準(zhǔn)品的電泳圖譜的遷移時(shí)間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),但是在分離羊肚菌菌絲體提取物樣品中,添加1.0 mg/mLβ-環(huán)糊精的樣品分離效果好于其他濃度,所以選取1.0 mg/mLβ-環(huán)糊精作為試驗(yàn)添加劑(見(jiàn)圖7)。

圖6 β-環(huán)糊精添加量對(duì)5種單核苷類化合物分離的影響Fig.6 The effect of β-cyclodextrin additionon the separation of 5 mononucleoside compounds

圖7 緩沖液添加 1.0 mg/mL β-環(huán)糊精的羊肚菌菌絲指紋圖譜(a)和未添加β-環(huán)糊精的羊肚菌菌絲指紋圖譜(b)Fig.7 Hypha fingerprint of Morchella with 1.0 mg/mLβ-cyclodextrin in buffer solution(a)and hypha fingerprint ofMorchella without β-cyclodextrin in buffer solution(b)

2.7 進(jìn)樣時(shí)間對(duì)樣品分離的影響

在毛細(xì)管電泳對(duì)物質(zhì)分離的過(guò)程中,物質(zhì)的濃度對(duì)樣品的分離和峰型有很大的影響,而樣品的進(jìn)樣濃度與處理方法,所選溶劑的溶解度和進(jìn)樣時(shí)間都有關(guān)系,所以在樣品分離時(shí),對(duì)進(jìn)樣時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化可以減少在其他方面的工作量[18-19]。圖8表明,不同的進(jìn)樣時(shí)間對(duì)5種標(biāo)準(zhǔn)品的分離時(shí)間沒(méi)有較明顯的影響,但是隨著進(jìn)樣時(shí)間增大,5種單核苷化合物的峰寬均變寬(見(jiàn)圖9),影響分離效率。而當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間為5 s時(shí),鳥苷和尿苷沒(méi)有完全分離,所以選擇8 s為試驗(yàn)進(jìn)樣時(shí)間。

圖8 不同進(jìn)樣時(shí)間對(duì)5種單核苷化合物分離的影響 Fig.8 Effect of different injection timeon the separation of five mononucleosides

圖9 不同進(jìn)樣時(shí)間對(duì)5種標(biāo)準(zhǔn)品峰寬的影響Fig.9 Effect of different injection timeon peak width of five standard products

2.8 方法的精密度的測(cè)定

操作方法參照[20-21],取標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制成0.05 mg/mL連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定3次,記錄遷移時(shí)間和峰面積,計(jì)算3-脫氧腺苷遷移時(shí)間RSD為0.167%,峰面積的RSD為2.78%;腺苷遷移時(shí)間RSD為0.083%,峰面積的RSD為1.40%;鳥苷遷移時(shí)間RSD為0.61%,峰面積的RSD為2.9%;尿苷遷移時(shí)間RSD為0.66%,峰面積的RSD為2.72%;肌苷遷移時(shí)間RSD為0.89%,峰面積的RSD為1.96%。5種標(biāo)準(zhǔn)品的遷移時(shí)間RSD均小于0.89%,峰面積RSD均小于2.9%。

2.9 方法穩(wěn)定性的測(cè)定

操作方法參照[22-23],分別取50 μL的5種標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg/mL混合到一起,在室溫下放置0、2、4、6、8 h后,在最佳電泳條件下分別進(jìn)樣,每次3個(gè)重復(fù),計(jì)算3-脫氧腺苷遷移時(shí)間RSD為0.5%,峰面積的RSD為3.84%;腺苷遷移時(shí)間RSD為0.53%,峰面積的RSD為2.62%;鳥苷遷移時(shí)間RSD為0.51%,峰面積的RSD為2.87%;尿苷遷移時(shí)間RSD為0.56%,峰面積的RSD為4.06%;肌苷遷移時(shí)間RSD為0.61%,峰面積的RSD為4.73%。表明方法的精密性較好。5種標(biāo)準(zhǔn)品的遷移時(shí)間RSD均小于0.61%,峰面積RSD均小于4.73%。表明標(biāo)準(zhǔn)品在8 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.10 羊肚菌Morchella sextelata中核苷類化合物的測(cè)定

2.10.1 定性分析 操作方法參照文獻(xiàn)[24-25],圖10結(jié)果表明,3-脫氧腺苷、腺苷和尿苷出峰時(shí)間能與羊肚菌菌絲提取物中的幾個(gè)單峰出峰時(shí)間相一致。再進(jìn)一步確定將這3種標(biāo)準(zhǔn)品混合后加入樣品中,如圖11所示,加入混合標(biāo)樣后的樣品色譜峰的個(gè)數(shù)沒(méi)有增加,有相應(yīng)的幾個(gè)峰的峰面積明顯加大,進(jìn)一步確定了羊肚菌菌絲中含有3-脫氧腺苷、腺苷和尿苷。

圖10 羊肚菌菌絲體提取物色譜圖(a)和5種單核苷類化合物(b)Fig.10 The chromatogram of mycelium extractfrom Morchella chinensis(a)and fivekinds of mononucleoside compounds(b)

圖11 羊肚菌菌絲體提取物(a)和羊肚菌菌絲體提取物加3-脫氧腺苷、腺苷和尿苷(b)Fig.11 Morchella mycelium extract(a)and Morchella myceliumextract plus 3-deoxyadenosine,adenosine,uridine(b)

2.10.2 定量測(cè)定

2.10.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將3種單核苷類化合物(3-脫氧腺苷、腺苷、尿苷)用50%甲醇配成1 mg/mL的母液,根據(jù)毛細(xì)管電泳中的定量計(jì)算方法,將3種單核苷類化合物標(biāo)準(zhǔn)品用緩沖液配成不同濃度分別進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定。記錄峰面積積分值,以對(duì)照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸方程的建立[26]。結(jié)果表明(見(jiàn)表1):決定系數(shù)R2的范圍為0.9992～0.9997。

2.10.2.2 實(shí)際樣品的定量測(cè)定 利用3種單核苷類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線,將樣品中3-脫氧腺苷、腺苷、尿苷的峰面積分別帶入方程,并乘以提取液體的體積得到羊肚菌中3-脫氧腺苷含量為4.38 mg/g、腺苷含量為6.6 mg/g、尿苷含量為7.8 mg/g。

表1 羊肚菌中核苷類化合物的含量Table 1 Contents of nucleosides in Morchella

表2 樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)(n=3)Table 2 The recovery test of sample added standard(n=3)

2.11 回收率的測(cè)定

在羊肚菌菌絲體中測(cè)得的3種單核苷化合物濃度基礎(chǔ)上添加低、中、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,按照最佳優(yōu)化條件進(jìn)樣測(cè)定,每一個(gè)樣品進(jìn)樣3次[27]。將測(cè)得的峰面積帶入到標(biāo)準(zhǔn)方程中,得出的濃度再除以理論濃度,得到回收率。表2表明,3種單核苷類化合物的回收率在95.5%～100.8%之間,且RSD小于4.9%。表明該方法適用于羊肚菌菌絲中3種單核苷類化合物的測(cè)定。

2.12 羊肚菌其他菌種中單核苷化合物的測(cè)定

結(jié)果如圖12所示,3-脫氧腺苷中六妹含量最高,Mes-6含量最低;腺苷是Mes-6含量最高,梯棱羊肚菌含量最低;尿苷是Mes-6含量最高,梯棱羊肚菌含量最低。Mes-6菌絲體中腺苷含量是梯棱羊肚菌的4.92倍,尿苷含量是梯棱羊肚菌的5.92倍。

圖12 不同品種的羊肚菌菌絲中單核苷類化合物的測(cè)定Fig.12 Determination of mononucleoside compoundsin hyphae of different species of Morchella

3 結(jié)論

利用二極管陣列檢測(cè)器建立了5種單核苷類化合物的高效毛細(xì)管電泳圖譜,對(duì)樣品提取方法和電泳條件進(jìn)行了優(yōu)化,最終確定了以用菌粉按照1∶30加水先超聲后水浴的方法提取樣品的提取方法,以及最佳電泳條件為pH為9.4的50 mmol/L硼砂緩沖液以及1.0 mg/mL的β-環(huán)糊精為運(yùn)行緩沖液,分離電壓為25 kV,進(jìn)樣時(shí)間為8 s。再以羊肚菌菌絲提取物為樣品進(jìn)行5種單核苷類化合物的測(cè)定,結(jié)果表明羊肚菌Morchellasextelata菌絲中含有3-脫氧腺苷、腺苷以及尿苷。并與其他不同種類的羊肚菌菌絲提取物進(jìn)行單核苷類化合物的含量的比對(duì)。野生羊肚菌Mes-6和Mes-9采集于遼寧省,為黃色系品種,目前人工栽培仍然不穩(wěn)定。3-脫氧腺苷參與人體的免疫調(diào)節(jié)作用,可增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力[28]。而腺苷可在凝血和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮介導(dǎo)的作用[29]。尿苷是藥物合成的中間體,阻斷癌細(xì)胞合成,修復(fù)受損基因等作用[30]。雖然野生羊肚菌Mes-6人工栽培不穩(wěn)定,但是利用其菌絲體中的活性成分,將它應(yīng)用到制藥行業(yè),也可成為羊肚菌發(fā)展的一條新途徑。

目前測(cè)定單核苷類化合物通常用高效液相的方法[31],但是液相的流動(dòng)相會(huì)用到大量的有機(jī)溶劑,樣品的需求量也較高。高效毛細(xì)管電泳分離模式中溶質(zhì)基于各自電泳遷移速率的不同而進(jìn)行分離,組分在電泳中的流出順序與組分的質(zhì)荷比有關(guān),不同質(zhì)荷比的組分具有不同的遷移速度,因而物質(zhì)得到分離。所有液相色譜的分離模式,包括正相、反相、離子交換、親和、篩分等都可以在毛細(xì)管電泳中找到相應(yīng)的模式[32]。本文利用對(duì)毛細(xì)管電泳中5種單核苷類物質(zhì)分離需要的不同參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,得到分離效果較好的方法,除了本文涉及的羊肚菌菌絲體內(nèi)的相關(guān)物質(zhì)的測(cè)定,還可以應(yīng)用到其他的樣品的測(cè)定中去。并且高效毛細(xì)管電泳還具有分離效率高、分析速度快、樣品和試劑用量少等特點(diǎn),是一種更為環(huán)保、無(wú)害、便捷的檢測(cè)方法,可以廣泛的應(yīng)用在各種領(lǐng)域中去。