酶解技術(shù)提取動(dòng)物組織中的膠原蛋白及其肽的研究進(jìn)展

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(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所,江蘇南京210014)

膠原蛋白(簡(jiǎn)稱膠原)一般存在于哺乳動(dòng)物的肌腱、韌帶、軟骨、皮膚與一些結(jié)締組織中,其具備獨(dú)特的三股超螺旋生物構(gòu)造,是一類理化性質(zhì)穩(wěn)定的功能性蛋白質(zhì)[1]。目前工業(yè)上制備膠原大都是從牛、豬這些陸生哺乳動(dòng)物的皮、骨等部位提取[2]。膠原蛋白肽(簡(jiǎn)稱膠原肽)是分子量比膠原更小的蛋白質(zhì),有較強(qiáng)的消化吸收性,因此有利于人體小腸的消化與吸收[3]。膠原的特殊理化性質(zhì)與生物結(jié)構(gòu),使其具有很高的營(yíng)養(yǎng)特性與加工性能,所以有關(guān)膠原方面的研究正在被越來(lái)越多的研究者青睞。

目前膠原及膠原肽提取的方法有:酸提取法、堿提取法、熱水浸提法、中性鹽水解法、酶解提取法等[4],每個(gè)方法都各有其優(yōu)缺點(diǎn)。迄今為止,酶解提取法是應(yīng)用最廣泛、較為溫和、且能較好地保留樣品的生物活性的方法[5]。膠原及膠原肽的需求量在逐年增長(zhǎng),所以關(guān)于膠原及膠原肽提取技術(shù)的優(yōu)化和原材料的安全性,最終產(chǎn)物的純度和提取率等問(wèn)題將成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。為了加強(qiáng)人們對(duì)于膠原及膠原肽的了解,并為后期研究者提供相關(guān)資料,本文對(duì)酶法提取膠原及膠原肽的研究進(jìn)行相關(guān)綜述。

1 膠原及膠原肽的性質(zhì)和功能

1.1 膠原性質(zhì)及功能

膠原是一種乳白色、不透明、無(wú)支鏈的功能性纖維蛋白質(zhì),它并不是特指某一個(gè)蛋白質(zhì)的名稱,而是一個(gè)龐大的蛋白質(zhì)家族的統(tǒng)稱,膠原的生物結(jié)構(gòu)因原材料的種類、族系及組織的不同而各異。如今膠原的提取已經(jīng)從陸生哺乳動(dòng)物逐步轉(zhuǎn)向海洋水產(chǎn)生物[6],Raftery等[7]通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到三文魚皮(海洋)中提取的膠原可替代從牛腱(哺乳動(dòng)物)中提取的膠原,且三文魚皮中提取的膠原有利于傷口愈合和皮膚修復(fù),海洋膠原的深入研究與綜合利用,不僅有助于緩解海洋廢棄?mèng)~料對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的負(fù)擔(dān),還可增加膠原提取技術(shù)的原材料種類。

表1 常見(jiàn)膠原種類Table 1 Common types of collagen

蛋白質(zhì)一般是雙螺旋結(jié)構(gòu),而膠原是三螺旋結(jié)構(gòu),其氨基酸組成主要是甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸,其中羥脯氨酸是膠原的特色氨基酸[8]。特殊的結(jié)構(gòu)造就膠原有異于其它蛋白質(zhì)的性質(zhì),包括低免疫原性、生物相容性、止血性和可生物降解性等[9],普遍的加工溫度和短暫的加熱時(shí)間均不能使其分解,從而消化吸收較為困難、人體利用率低,但水解后吸收利用率可得到大幅度提高,且有助于食品中其它蛋白質(zhì)的吸收。目前膠原方面的研究日趨增多,且國(guó)內(nèi)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)也逐漸成熟,已發(fā)現(xiàn)了至少27種的膠原類型,膠原種類名稱因分類標(biāo)準(zhǔn)不同而異。根據(jù)它們?cè)隗w內(nèi)的分布特點(diǎn),可將膠原分成間質(zhì)型膠原、基底膜膠原和細(xì)胞外周膠原[10-11];根據(jù)膠原蛋白功能的不同,通常把Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ、XXIV、XXVII型膠原稱為成纖維膠原,其余的稱為非成纖維膠原,見(jiàn)表1[12-13]。

1.2 膠原肽的性質(zhì)及功能

根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31645-2018規(guī)定富含膠原的新鮮動(dòng)物組織在水解到一定程度后,分子量在10 kDa以下時(shí),稱為膠原肽[14]。膠原肽是由膠原衍生出來(lái)的物質(zhì),也稱為水解膠原,其擁有膠原所有的性質(zhì),還有多于膠原的特性:易透皮、抗氧化、抑菌、無(wú)凝膠屬性和降血壓;它與其它蛋白多肽的顯著區(qū)別在于脯氨酸和羥脯氨酸的含量明顯居高[15]。Cosgrove等[16]通過(guò)研究美國(guó)中年婦女膳食營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入量與皮膚老化的關(guān)系,可得膠原肽具有延緩皮膚衰老,維持皮膚彈性,改善皮膚狀態(tài)等奇效。膠原肽不僅局限于美容護(hù)膚方面的使用,還在醫(yī)療器械、醫(yī)學(xué)藥品、食品(包含保健品)等行業(yè)有一席之地,榮稱為“皮膚的軟黃金”,可加速骨骼正常發(fā)育,提高骨骼堅(jiān)固性,減少骨質(zhì)增生的幾率,學(xué)者還在不斷挖掘它的潛在價(jià)值[17-18]。

2 酶提膠原的原材料

2.1 原材料的種類

膠原向來(lái)都是“工業(yè)寵兒”,深受廣大消費(fèi)者的青睞,許多研究者也因其功能強(qiáng)大而投身研究中。為了得到安全性和純度都高的膠原,同時(shí)能提高提取效率,研究者正在不斷探索,尋找適宜的生物材料,因此有關(guān)酶提膠原的原材料種類正在擴(kuò)充中。目前常用于酶提膠原的原材料主要有以下幾種:食用陸生哺乳動(dòng)物皮膚、骨骼、內(nèi)臟;可食水生動(dòng)物魚皮、魚鱗、魚骨、魚肉等(海洋生物相對(duì)于陸生哺乳動(dòng)物具有明顯的優(yōu)勢(shì),原料來(lái)源豐富低廉,魚皮、骨頭、鰭、頭、內(nèi)臟、鱗片等魚類加工廢棄物“變廢為寶”);家禽副產(chǎn)物的綜合利用:雞、鴨、鵝的骨頭、皮、毛和蛋殼膜;生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)應(yīng)用中常用原材料有豬皮、鼠皮、鴨皮、蛙皮、鳥腳、牛跟腱等[19-20]。

膠原在不同種類的生物組織中分布位置是不同的,且長(zhǎng)度也與原材料密切相關(guān)。以前工業(yè)中使用的膠原多是從牛、豬等陸生哺乳動(dòng)物的皮膚中獲得[21],如今隨著研究技術(shù)的提高與不斷的創(chuàng)新,已逐漸將研究方向轉(zhuǎn)向水生動(dòng)物領(lǐng)域[22]。由于我國(guó)海洋占地面積很大,海洋資源相對(duì)較雄厚,因此在水產(chǎn)品加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生繁雜大量的下腳料,比如魚頭、魚皮、魚鱗、魚骨等,這些廢棄物大約占魚體總量的50%～70%,能將其“變廢為寶”是一項(xiàng)意義非凡的工程[23-24]。

2.2 原材料的預(yù)處理過(guò)程

從生物體中進(jìn)行酶提膠原,所用到的生物材料中的脂肪、鈣質(zhì)、非膠原成分與其它雜質(zhì)的存在會(huì)影響膠原的純度,降低膠原的整體提取率[25]。因此在對(duì)生物材料進(jìn)行酶提膠原的工藝之前,必須對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理過(guò)程。不同種類的生物材料,其所用到的預(yù)處理工藝過(guò)程和試劑均不相同,主要有以下幾個(gè)類別:

2.2.1 動(dòng)物骨

2.2.1.1 脫脂 相關(guān)資料顯示脫脂不徹底的原材料(脂肪含量大于1%)會(huì)引起膠原產(chǎn)品的腥味較重,保質(zhì)期大大縮短,影響成品的風(fēng)味和質(zhì)量[26]。劉麗莉等[27]通過(guò)將流動(dòng)水清洗后的碎骨料采用有機(jī)溶劑靜置浸泡脫脂和乙醚低溫回流脫脂這兩種常用方法進(jìn)行脫脂,發(fā)現(xiàn)使用第一種方法(正己烷、石油醚及乙醚三種溶劑)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),雖然脂肪的殘油率下降幅度較大,但總耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)48 h,而采用乙醚低溫回流脫脂,脫脂效果相當(dāng)明顯,可以使殘油率降低至0.05%,因此最終選擇低溫乙醚回流脫脂方法。

2.2.1.2 脫鈣 動(dòng)物骨骼組織是一種堅(jiān)硬的結(jié)締組織,在脫鈣過(guò)程中,選取的方法要保證充分除去鈣質(zhì),且盡量減少脫鈣液對(duì)組織和細(xì)胞成分的損害,使用頻率較高的方法有[28]:螯合劑脫鈣,利用有機(jī)螯合劑能與金屬離子結(jié)合的特點(diǎn),被用作脫鈣劑,其中10%與13%EDTA脫鈣液因配制簡(jiǎn)便和操作快捷而廣泛運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)中;單純酸或復(fù)合酸脫鈣,使用的酸有鹽酸(15%～20%)、甲酸(5%～50%)、硝酸(8%～10%)、硫酸和三氯乙酸,其中硝酸與甲酸是工業(yè)生產(chǎn)者的偏愛(ài);有相關(guān)研究表明當(dāng)超聲波輔助脫鈣技術(shù)超聲波功率為220 W、超聲波頻率為25 kHz、超聲波處理時(shí)間為0～6 h為最佳處理?xiàng)l件;低溫-微波脫鈣技術(shù)的關(guān)鍵控制點(diǎn)在于溫度和微波參數(shù),實(shí)驗(yàn)溫度需控制在15 ℃左右,使用的微波是一種高頻電磁波,頻率為300～300000 MHz,波長(zhǎng)為1 mm～1 m[29-30]。

2.2.2 動(dòng)物皮

2.2.2.1 脫脂 動(dòng)物皮脫脂方法主要包含四種:酶解法:王萌萌[31]以林蛙皮為原料,用濃度為5%的脂肪酶進(jìn)行脫脂,脫脂效果顯著,最終提取的膠原結(jié)構(gòu)完整,膠原提取率最高達(dá)到80.1%;復(fù)合鹽溶液與脂肪酶聯(lián)合脫脂法:馬艷等[32]將脂肪酶、NaHCO3與NaCl復(fù)合鹽溶液成功應(yīng)用于雞翅脫脂研究中,分別進(jìn)行了三組實(shí)驗(yàn)(堿性脂肪酶作用、復(fù)合鹽溶液作用、酶+理化方法作用),發(fā)現(xiàn)使用復(fù)合鹽溶液與脂肪酶聯(lián)合脫脂的效果較好,脫脂率可達(dá)到70.88%;脫脂液法:脫脂液是由Na2CO3配成的濃度為5%～10%的溶液,容易制備但需提前配制備用;有機(jī)溶劑萃取法(正己烷等)。

2.2.2.2 去除皮中的非膠原及色素成分 一定濃度的NaCl溶液和異丙醇溶液可有效去除原料中雜蛋白成分,劉霞等[33]將新鮮豬皮去掉皮下脂肪后,用10%的NaCl在室溫條件下浸泡12 h以除去鹽溶性蛋白,結(jié)果表明酶提豬皮膠原顯現(xiàn)較好的結(jié)構(gòu)完整性;動(dòng)物皮中的色素成分的去除也是前處理的必要步驟,一般在室溫條件下使用NaOH浸泡幾小時(shí)可除去。

2.2.3 水產(chǎn)動(dòng)物的皮、骨、鱗、肌肉等 膠原廣泛存在于水產(chǎn)動(dòng)物的皮、骨、鱗、肌肉等部位,魚鱗和魚皮中膠原含量豐富,魚鱗膠原占魚鱗總蛋白的10%～40%,且其脂質(zhì)含量較少;魚肉中的膠原含量匱乏,研究顯示只占總蛋白的3%[34]。水產(chǎn)動(dòng)物除了膠原,還含有少量非膠原成分和脂肪。從其中提取膠原的研究正在如火如荼地進(jìn)行,它的預(yù)處理工藝也在不斷摸索和優(yōu)化中。

目前水產(chǎn)生物的脫脂技術(shù)主要可分為四種:物理法(壓榨法、離心法、超聲波法、超臨界二氧化碳萃取法和乳化法)、化學(xué)法(有機(jī)溶劑萃取法和堿皂化法)、酶法和復(fù)合法[35]。丁浩宸等[36]用有機(jī)溶劑乙醇對(duì)南極磷蝦肉糜進(jìn)行脫脂試驗(yàn),得到南極磷蝦肉糜的脫脂率為97.76%,在有些情況下,將有機(jī)溶劑進(jìn)行復(fù)配使用,會(huì)得到更好的脫脂效果;化學(xué)法中的堿性皂化法多用于工廠生產(chǎn),但有研究顯示此方法加入堿性物質(zhì)量如果過(guò)多,會(huì)導(dǎo)致魚類組織破壞和蛋白質(zhì)變性[37];許慶陵等[38]使用酶法對(duì)鰱魚肉進(jìn)行脫脂,最終脫脂率達(dá)到98.11%,酶法作用條件較為溫和,可有效地去除脂肪。方法之間無(wú)優(yōu)劣之分,在實(shí)際的生產(chǎn)中,需要綜合考慮原料的種類、作用時(shí)間、作用部位、成本等因素,選擇合適的脫脂方法。除去水產(chǎn)生物中的雜蛋白的方法主要有三種:攪拌浸泡處理法、超聲波輔助分離法、浸灰法。攪拌浸泡處理法需要不停攪拌,耗時(shí)耗力耗能,且會(huì)產(chǎn)生大量的廢水,不利于后期膠原蛋白的提取,幾乎已被淘汰;浸灰法相比于其他方法來(lái)說(shuō),耗時(shí)較長(zhǎng),但這種方法可最大限度地去除魚皮中的脂肪和雜蛋白。超聲波輔助堿法,在低溫下能提高效率,使得魚類組織中的雜蛋白快速分離,達(dá)到較好的除雜效果[39-40]。綜合以上,在條件允許的情況下,超聲波輔助堿法是比較有效,且有利于保護(hù)產(chǎn)物生物活性的方法。

3 膠原及膠原蛋白肽的檢測(cè)

在對(duì)酶提膠原技術(shù)進(jìn)行大量研究的同時(shí),也應(yīng)對(duì)酶提產(chǎn)物-膠原和酶解膠原產(chǎn)物-膠原肽的性質(zhì)方面做一些相應(yīng)的研究。對(duì)于膠原和膠原蛋白肽的性質(zhì)檢測(cè)是重要的步驟,這樣才能保證最終產(chǎn)物符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)比國(guó)內(nèi)與國(guó)際的膠原檢測(cè)項(xiàng)目相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),可得物理性能檢測(cè)基本相同,但對(duì)膠原的生化特性的檢測(cè)方面,國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)要相對(duì)嚴(yán)格許多。

3.1 膠原性質(zhì)檢測(cè)

3.1.1 純度檢測(cè) 目前的實(shí)驗(yàn)中多采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來(lái)測(cè)定膠原的純度及分子量。也可通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定膠原中羥脯氨酸含量來(lái)計(jì)算所提取的膠原純度,羥脯氨酸僅存在于膠原、彈性蛋白、伸展蛋白中,約占氨基酸含量13%,可以通過(guò)測(cè)定膠原中羥脯氨酸含量來(lái)間接得到膠原的分子量,以確定膠原的純度。張艷艷等[41]采用雞胸軟骨為原料,以酶法提取其中的膠原,通過(guò)SDS-PAGE電泳,結(jié)果顯示膠原含有一條較粗的α帶和一條較細(xì)的β帶,氨基酸分析得羥脯氨酸為99殘基/1000氨基酸殘基,因此證明提取到的膠原為純度較高、且活性較強(qiáng)的II型膠原。

3.1.2 結(jié)構(gòu)完整性檢測(cè) 從動(dòng)物體中提取膠原所用的方法不同,那么所得膠原的種類有可能會(huì)不同。膠原有一個(gè)很重要的指標(biāo)是其結(jié)構(gòu)的完整性,萬(wàn)剛濤等[42]以紅鰭東方鲀魚為原料,分別采用酸提取法和酶提取法來(lái)提取其皮中的膠原,將所得膠原分別經(jīng)紫外光譜分析、傅里葉紅外光譜分析和SDS-PAGE電泳測(cè)定,確定兩種提取方法得到的膠原均符合Ⅰ型膠原蛋白的特征,結(jié)構(gòu)具有完整性。

3.1.3 溶解性檢測(cè) 酶提膠原的溶解性是其重要的功能特性之一,影響因素復(fù)雜繁多,需要測(cè)定水溶性和酸溶性,可用氮溶解指數(shù)(nitrogen solubility index,NSI)來(lái)表示。有研究表明采用酶解技術(shù)提取膠原,其溶解性和乳化性會(huì)得到顯著的提高,胡建平等[43]以魚鱗為原料,利用胃蛋白酶在酸性(乙酸、鹽酸、檸檬酸)條件下酶解得到膠原,對(duì)其進(jìn)行性質(zhì)檢測(cè),可得出膠原的溶解性均很好。曾慶祝等[44]通過(guò)比較不同方法從魷魚皮中提到的膠原的水溶性和酸溶性,結(jié)論為熱水法和酶法提到的膠原的水溶性和酸溶性均好于酸法。

3.1.4 降低抗原性 低抗原性是膠原的特性之一。李曉輝等[45]關(guān)于超高壓及酶解兩種方法處理虹鱒魚過(guò)敏原Ⅰ型膠原蛋白的對(duì)比實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明經(jīng)超高壓處理后,Ⅰ型膠原抗原性隨著壓力的升高呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì),超高壓處理?xiàng)l件最優(yōu)化時(shí)得到的Ⅰ型膠原抗原性降低42.66%;采用胰蛋白酶可使Ⅰ型膠原抗原性消減97.69%。表明使用酶處理膠原對(duì)降低抗原性更為有效。

3.2 膠原肽性質(zhì)

膠原肽的吸油性、乳化性、吸水性、保水性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性是其用于工業(yè)生產(chǎn)中需要衡量的重要特性。如膠原肽的吸水性與保水性可應(yīng)用于女性美容、醫(yī)美治療、化妝品行業(yè);膠原肽的乳化性和起泡性可用做啤酒、罐頭、起泡性飲料等。

3.2.1 吸油性 膠原肽的吸油性是其特性之一。賈冬英等[45]總結(jié)不同研究者的實(shí)驗(yàn)成果,將膠原肽、大豆脫脂粉、大豆?jié)饪s蛋白及大豆分離蛋白四種蛋白質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)行吸油性對(duì)比,可得出均是用離心法測(cè)得的吸油性,膠原肽的吸油性為1.37 mL/g,大豆脫脂粉的吸油性為0.80 mL/g,大豆?jié)饪s蛋白的吸油性為1.01 mL/g,大豆分離蛋白的吸油性為1.20 mL/g。當(dāng)然不同研究者的操作可能存在差異,如所用油脂類別、離心時(shí)間和溫度等,但由結(jié)果可看出膠原肽的吸油性明顯更高。

3.2.2 乳化性 膠原肽的乳化性目前實(shí)驗(yàn)中多使用離心法測(cè)定。瞿葉輝等[46]對(duì)馬面魚骨膠原多肽粉功能性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)研究,比較不同分子量多肽及酪蛋白磷酸多肽乳化性能隨離心轉(zhuǎn)速的變化，發(fā)現(xiàn)小分子多肽的乳化性降低,大分子多肽及酪蛋白磷酸多肽的乳化性幾乎沒(méi)有發(fā)生變化。因此測(cè)定膠原肽的乳化性時(shí),應(yīng)當(dāng)將離心轉(zhuǎn)速控制在一定的范圍內(nèi),轉(zhuǎn)速不宜過(guò)高。

3.2.3 水合性質(zhì) 包含吸水性和保水性兩種特性。有相關(guān)研究表明酶法提取的膠原的吸水性大于熱力法提取,但是熱力法提取的膠原的保水性大于酶法提取[47]。關(guān)于膠原肽的吸水性和保水性要選用一個(gè)物質(zhì)(酪蛋白、甘油)進(jìn)行對(duì)比,然后用測(cè)定水分含量的方法測(cè)定得出膠原肽的水合性質(zhì)。

3.2.4 起泡性及泡沫穩(wěn)定性 起泡性是指膠原肽產(chǎn)生泡沫的能力,泡沫穩(wěn)定性則是泡沫保持穩(wěn)定的能力。起泡性在以往實(shí)驗(yàn)中多是采用均質(zhì)設(shè)備,設(shè)定的時(shí)間與轉(zhuǎn)速和原料息息相關(guān),由均質(zhì)停止時(shí)泡沫的體積可得出起泡性。泡沫穩(wěn)定性則是需要在相同條件下測(cè)量多組起泡性的值,衡量泡沫穩(wěn)定性。

3.3 酶提技術(shù)產(chǎn)物純化

可用于膠原的純化方法包含鹽析法、離心法、電泳法、透析法和色譜法,其中鹽析法、離心法和電泳法這三種方法是最常用的。實(shí)際生產(chǎn)中比較建議采用兩種及以上方法混合使用,單使用一種方法對(duì)膠原無(wú)法達(dá)到完全的分離純化。鹽析法一般采用高濃度NaCl;離心法常選用制備型低溫超速離心機(jī);電泳法多采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE),該法既可用于膠原蛋白的分離純化,還可用來(lái)測(cè)定膠原蛋白分子的相對(duì)分子質(zhì)量。有研究者[48]用破碎、酶解、鹽析三步法提純蘇尼特羊骨骼I型膠原蛋白,先去除骨頭中的非膠原物質(zhì),然后向沉淀中加入10%的胃蛋白酶,在4 ℃的條件下消化24 h,以14000 r/min離心40 min。棄沉淀向上清液中加NaCl,使它終濃度達(dá)到0.9 mol/L,靜置過(guò)夜,再離心,得到沉淀Ⅰ型膠原蛋白,從而達(dá)到純化的目的。通過(guò)SDS-PAGE法進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)物,由電泳圖可清晰得出是SDS-PAGE純度級(jí)別的Ⅰ型膠原蛋白,所以可得通過(guò)此方法的酶提產(chǎn)物純度相對(duì)較高。

4 酶提膠原優(yōu)化工藝及輔助技術(shù)

4.1 酶的種類

酶的選擇對(duì)于膠原的提取是至關(guān)重要的,目前完全工業(yè)化的酶主要是微生物酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶及復(fù)合酶)、植物蛋白酶(菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶及木瓜蛋白酶)、動(dòng)物蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、動(dòng)物蛋白水解酶)和風(fēng)味復(fù)合酶。孟昌偉等[49]把鮰魚骨作為原料,用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)其進(jìn)行分步酶解制備骨膠原肽,探究這兩種酶的最佳酶提工藝條件。實(shí)際生產(chǎn)中,比較常用到的是胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶。微生物蛋白酶與動(dòng)物蛋白酶和植物蛋白酶相比有溶解性好、活力高的特點(diǎn)，且對(duì)蛋白質(zhì)作用強(qiáng)烈,適合對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行較深程度的水解。酶提膠原技術(shù)所選取的酶要具有專一性,針對(duì)不同的底物,需要選擇合適的酶,且其不會(huì)隨著反應(yīng)的進(jìn)行變性而產(chǎn)生異味。當(dāng)發(fā)現(xiàn)使用單一酶無(wú)法達(dá)到預(yù)期效果,那么則要考慮采用復(fù)合酶系的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[50]。

4.2 其它因素

酶解提取膠原的過(guò)程中,為了得到純度更高的膠原和提高整體的提取效率,還有一些因素也在考慮范圍內(nèi)。酶的種類選取是第一步且是最為重要的一步,但酶的添加量、酶解溫度、酶解pH、酶解時(shí)間、料水比等因素也必須嚴(yán)格控制。王萌萌等[51]在林蛙皮膠原蛋白的提取過(guò)程中,直接選定了胃蛋白酶作為本次實(shí)驗(yàn)的酶,然后采用單因素法控制實(shí)驗(yàn)條件,設(shè)計(jì)了一個(gè)四因素三水平的實(shí)驗(yàn),選定酶用量、作用時(shí)間、pH、料液比四個(gè)因素,最終通過(guò)結(jié)果分析得出用胃蛋白酶水解林蛙皮制備膠原蛋白的最佳酶解工藝條件為:加酶量0.3%、酶解時(shí)間36 h、料液比1∶50 g/mL、pH2.0,在此條件下膠原蛋白提取率最高達(dá)到80.1%。關(guān)于酶的選擇是一個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵性因素,所以往往需要先選定3～4個(gè)酶,然后通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最為適合的酶,酶的選擇和酶的價(jià)格及所要作用的原材料密切相關(guān)。任萌等[52]研究了關(guān)于酶法提取雞蛋殼膜膠原蛋白的工藝,先選定了胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，對(duì)它們進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析,并考察了pH、時(shí)間、酶用量對(duì)蛋殼中膠原蛋白提取率的影響,最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用木瓜蛋白酶、pH4.0、酶用量6%、酶解時(shí)間5 h條件為最優(yōu)工藝路線,膠原蛋白平均提取率為0.91%。

4.3 酶提膠原及膠原肽的輔助技術(shù)

隨著酶制劑工業(yè)和食品產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,國(guó)內(nèi)外學(xué)者也在逐步探索有關(guān)各種酶應(yīng)用的機(jī)理及它們?cè)谑称犯鞔箢I(lǐng)域的使用。人們發(fā)現(xiàn)酶提技術(shù)反應(yīng)溫度低,反應(yīng)速率快,無(wú)環(huán)境污染,蛋白純度高,理化性質(zhì)穩(wěn)定且易于人體的消化,是近年來(lái)國(guó)際上普遍認(rèn)可的最先進(jìn)的生產(chǎn)方法,但酶解技術(shù)也存在一定的缺陷,所以動(dòng)物膠原的提取一般采用復(fù)合法,通過(guò)一些輔助技術(shù)與酶法結(jié)合,可有效提高膠原蛋白提取率和膠原及膠原肽的純度。

4.3.1 超聲波輔助技術(shù) 超聲波是一種在酶提技術(shù)前提下,通過(guò)外加物理場(chǎng)來(lái)提取原材料中的膠原的方法。超聲時(shí)間對(duì)于超聲波處理技術(shù)起決定性的作用,張曉潔等[53]用超聲輔助提取兔皮膠原并研究其理化性質(zhì),得出結(jié)論在超聲功率45%(總功率650 W),頻率20 kHz,超聲時(shí)間25 min條件下,其提取率比相同條件下常規(guī)酶解提高20%。超聲波技術(shù)是一種快速且能較好粉碎樣品的物理輔助方法,有利于提高后期酶提的效率及酶提產(chǎn)物的得率。

4.3.2 超高壓輔助技術(shù) 超高壓技術(shù)可用于輔助酶法進(jìn)行動(dòng)物骨的膠原提取,屬于一種非熱力加工技術(shù),通過(guò)控制時(shí)間、壓力、溫度,能夠降低膠原的抗原性,基本不改變所選用酶的pH。李曉輝等[54]將超高壓處理的樣品和未經(jīng)超高壓處理的樣品進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn),得出壓力的升高對(duì)于虹鱒魚I型膠原的分子質(zhì)量基本沒(méi)有影響,而且有助于降低膠原的抗原性。

4.3.3 微波輔助技術(shù) 微波技術(shù)是利用微波對(duì)細(xì)胞的輻射作用、破壁功效和較強(qiáng)的局部加熱作用,可以將膠原的三維螺旋結(jié)構(gòu)松散化,為后續(xù)酶解反應(yīng)提供更多的酶解位點(diǎn),使得膠原更易溶出。馮遠(yuǎn)[55]關(guān)于微波輔助酶法提取草魚魚鱗膠原的工藝研究,分析了微波處理時(shí)間對(duì)草魚魚鱗膠原酶解法提取的輔助效果，實(shí)驗(yàn)中得出微波處理20、40、60 s草魚魚鱗膠原提取率與單獨(dú)使用酶解法比較均得到了提高,且提取的時(shí)間也明顯縮短。實(shí)驗(yàn)所得到的最適工藝條件是:微波功率400 W、微波溫度50 ℃、處理40 s、而后酶解2 h,膠原蛋白的提取率可高達(dá)55.47%。微波處理時(shí)間可影響膠原提取率,過(guò)短會(huì)導(dǎo)致破壁效果不佳,過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致膠原提取不完全或大量損失[55]。

4.3.4 微射流輔助技術(shù) 微射流是一種高壓均質(zhì)技術(shù),是在超高壓的壓力作用下,對(duì)流體混合物料進(jìn)行強(qiáng)烈剪切、壓力瞬間釋放、高頻振蕩等綜合機(jī)械力,從而達(dá)到較優(yōu)的超微化、微乳化和均一化效果。目前使用的多是動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù),但該技術(shù)并沒(méi)有大量投入使用,仍然在不斷嘗試當(dāng)中,這是一種特殊形式的超高壓均質(zhì)技術(shù),它可對(duì)蛋白酶的活性及構(gòu)象產(chǎn)生影響,從而提高酶的活性[56]。

4.3.5 高壓脈沖電場(chǎng)輔助技術(shù) 高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)是隸屬于高壓電場(chǎng)技術(shù),是一種非熱處理技術(shù),通過(guò)高壓脈沖電源在兩個(gè)電極之間形成脈沖電場(chǎng),然后對(duì)兩電極間的物料反復(fù)施加高電壓的短脈沖進(jìn)行處理。姜薇等[57]使用高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)輔助胃蛋白酶的方法提取鹿托盤膠原蛋白,本次實(shí)驗(yàn)的最佳提取條件為:胃蛋白酶添加量2%、脈沖數(shù)8、電場(chǎng)強(qiáng)度20 kV/cm,該條件下鹿托盤膠原的提取率可達(dá)73.27%,與普通酶法相比,高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取膠原的得率提高了10.34%,且較為省時(shí)。

5 膠原及膠原肽的應(yīng)用

5.1 膠原的應(yīng)用

膠原屬于一種自然界中的可再生資源,酶法制備的膠原具有良好的穩(wěn)定性和低抗原型,目前在食品、美容、醫(yī)學(xué)行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。膠原以一種添加劑的形式加入飲料、乳制品及其他食品中,優(yōu)化食品的功效。利用膠原成膜性的特點(diǎn),可用作食品的(肉類、魚類等)保護(hù)膜和肉食品標(biāo)簽;酶提膠原與人體皮膚的膠原結(jié)構(gòu)相像,具有一定的表面活性和生物相容性,添加膠原的美容產(chǎn)品應(yīng)用于人體多是通過(guò)外用、口服、針劑輸入的方法;膠原是一種天然的生物醫(yī)學(xué)材料,將其運(yùn)用于燒燙傷患者的損傷皮膚組織上,有利于傷口的愈合,已應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域[58-60]。

5.2 膠原肽的應(yīng)用

當(dāng)前國(guó)內(nèi)的膠原肽產(chǎn)品類型主要以沖泡粉劑為主,其次是口服液,然后是護(hù)膚產(chǎn)品,如面膜、乳液、保濕霜等,與國(guó)外多元化的產(chǎn)品相比,國(guó)內(nèi)開發(fā)則顯得過(guò)于單一。膠原肽能降低血甘油三酯和膽固醇,且能激活脂肪酶的活性,因此可應(yīng)用于功能性食品(營(yíng)養(yǎng)保健品和減肥類食品)的研發(fā)當(dāng)中[61]。膠原肽[62]不僅可直接用作基料來(lái)生產(chǎn)各種飲料、食品、美容產(chǎn)品,還可用于面包、糕點(diǎn)及冰淇淋中的發(fā)泡劑、穩(wěn)定劑、乳化劑。人體與膠原肽之間有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系,其能抑制血壓上升、提高骨骼強(qiáng)度和降低骨質(zhì)增生的幾率、維持胃部的正常機(jī)能[63]。因此膠原肽的應(yīng)用與開發(fā)還需科研工作者們進(jìn)一步擴(kuò)展。

6 結(jié)語(yǔ)

酶法提取膠原相對(duì)于酸法浸提、堿提法、熱水提法而言,較為溫和且效率更高,產(chǎn)物的活性保留程度更好,但總體成本略高,在工業(yè)生產(chǎn)中仍不能大規(guī)模地使用,因此本文在盡量降低成本且不影響生產(chǎn)效率的前提下,綜述了如何對(duì)酶提工藝進(jìn)行優(yōu)化處理。

如今膠原及膠原肽的應(yīng)用逐漸普及化,所以提取膠原的原材料的范圍還需進(jìn)一步擴(kuò)大,未來(lái)膠原及其肽提取技術(shù)的發(fā)展方向應(yīng)與高新技術(shù)聯(lián)系在一起,膠原的純度和安全性也應(yīng)當(dāng)引起強(qiáng)烈重視。國(guó)內(nèi)的膠原行業(yè)依然處于起步階段,應(yīng)多進(jìn)行國(guó)際交流,優(yōu)化相關(guān)技術(shù)。為了膠原產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展,國(guó)家應(yīng)出臺(tái)相關(guān)法律法規(guī)來(lái)規(guī)范膠原及其肽產(chǎn)品市場(chǎng),企業(yè)應(yīng)當(dāng)遵守行業(yè)規(guī)則來(lái)加工膠原及膠原肽產(chǎn)品,研究者應(yīng)當(dāng)探索新技術(shù)提高膠原及膠原肽的得率。