近紅外光譜法快速測定藜麥籽粒粗蛋白含量

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(1.攀枝花學院生物與化學工程學院,四川攀枝花 617000;2.四川省農業(yè)科學院生物技術核技術研究所,四川成都 610061;3.四川省農業(yè)科學院農產品加工研究所,四川成都 610066)

藜麥(Chenopodimquinoawilld.)又稱藜米、南美藜、昆諾阿藜等,為莧科(Amaranthaceae)藜亞科(Chenopodiaceae)藜屬(Chenopodium)一年生雙子葉植物,是一種原產南美洲的雜糧假谷類作物,近年來發(fā)展非常迅速[1-6]。聯(lián)合國糧農組織將藜麥視為可滿足人體基本營養(yǎng)需求的單體糧食作物,并將2013年設為國際藜麥年。美國航天局則將藜麥列為外太空空間的理想“太空糧食”[7]。藜麥的營養(yǎng)物質含量豐富,成分均衡,其蛋白質含量為12%～23% 左右,富含有人體必需的八種氨基酸且與世界衛(wèi)生組織發(fā)布的人體必需氨基酸攝入量高度吻合,同時藜麥蛋白質的凈消化率、凈利用率顯著高于其他谷物,是人類優(yōu)秀的蛋白質來源[8-12]。藜麥籽粒蛋白質含量是評價藜麥品質的主要指標之一,在食品加工、商品定級、品種選育等方面具有重要的參考價值,因此實現(xiàn)藜麥蛋白質含量快速檢測具有重要意義。目前測量谷物蛋白質含量的方法主要有凱氏定氮法,雙縮脲法,紫外吸收法等,這些方法步驟繁多,對操作人員要求較高,不利于對大量樣品進行快速檢測。

近紅外技術的研究與應用已成為近年來國內外發(fā)展最快的光譜分析技術,具有簡單、快速、無損、環(huán)保、分析成本低、重現(xiàn)性好、便于實現(xiàn)在線檢測的特點,已經成為現(xiàn)代無損檢測的代表和主要發(fā)展方向[13]。從20世紀60年代以來,近紅外技術開始用于谷物品質測定,目前已用于各種谷物籽粒分析包括小麥、玉米、大豆、燕麥、花生等多個作物,主要測試指標包括水分、蛋白質、脂肪、纖維、容重等[14]。王姣姣等[15]以190份豌豆為原料,建立了豌豆蛋白質、淀粉、脂肪和總多酚的快速檢測模型。王麗君等[16]利用傅里葉變換近紅外光譜技術掃描綠豆籽粒和粉末樣品,預測了綠豆籽粒及粉末中蛋白、淀粉和直鏈淀粉3種組分的含量,并將其運用到綠豆品質評價工作中。但關于藜麥粗蛋白含量的近紅外分析研究報道較少,曹曉寧等[17-19]建立了基于近紅外光譜技術的藜麥脂肪、纖維和淀粉的預測模型;石振興等[20-21]對藜麥粉的粗蛋白、粗脂肪和淀粉含量進行了近紅外研究,構建了近紅外預測模型,但二者均未對藜麥籽粒粗蛋白含量進行近紅外建模研究。2014年,Escuredo等[22]則通過近紅外光譜分析技術得到了藜麥中12種氨基酸快速測定的近紅外模型,預測效果較好。

本研究利用近紅外光譜分析技術對藜麥籽粒粗蛋白含量進行快速檢測研究,試圖建立穩(wěn)定性好、精確度高的藜麥籽粒粗蛋白含量近紅外分析模型,為高蛋白藜麥品種選育和栽培措施研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥種子(122份) 2018年10月收獲并自然風干的凈籽粒,來自于攀枝花市格薩拉鄉(xiāng)、阿壩州馬爾康市、西藏自治區(qū)日喀則市;濃硫酸、氫氧化鈉、硼酸、鹽酸、硫酸亞鐵銨 分析純,成都市科龍化工試劑廠;溴甲酚綠、甲基紅 分析純,美國Sigma公司;凱氏定氮高效催化劑片 無純度分級,賽諾利康生物技術(北京)有限公司。

Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀 丹麥福斯(FOSS)分析儀器公司;DT208消化爐 丹麥福斯(FOSS)分析儀器公司;ME104E電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DA7200二極管陣列近紅外光譜儀 瑞典波通(Perten)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 預處理方法 將122份樣本根據濃度范圍和分布均勻的原則,將其中的94份作為建模集,其余28份樣本作為驗證集。每個建模集樣本分為一式兩份,一份磨碎后過100目篩,用于粗蛋白含量化學值的測定;另一份完整籽粒用于近紅外光譜采集。每個驗證集樣本也分為一式兩份,一份磨碎后過100目篩,用于粗蛋白含量化學值的測定;另一份完整籽粒用模型預測蛋白含量進行外部驗證。

1.2.2 國標法測定藜麥籽粒粗蛋白含量 依據國標GB/T 5511-2008《谷物和豆類氮含量測定和粗蛋白質含量計算凱氏法》進行藜麥籽粒粗蛋白含量的測定,蛋白轉換系數6.25。每個藜麥樣品做3次重復。

1.2.3 紅外光譜采集 將藜麥籽粒樣品均勻裝入φ75 mm的樣品盤中,再用直尺刮平藜麥表面和盤口齊平。使用近紅外分析儀以5 nm的分辨率掃描60次,樣品及環(huán)境溫度均為26 ℃,光譜掃描范圍為950～1650 nm,得掃描光譜圖。每個樣品重復掃描2次,每次掃描均重新裝樣,獲得平均光譜曲線。

1.3 數據處理

參考楊勇等[23]的方法,用Unscrambler10.4軟件對得到的藜麥籽粒光譜進行預處理并使用偏最小二乘法(PLS)建立模型。模型的預測效果根據校正決定系數(R2)、校正均方根誤差(RMSEC)、交叉驗證決定系數(R2)和預測均方根誤差(RMSEP)進行綜合評測,以得到最優(yōu)的近紅外模型組合。

表1 建模集和驗證集籽粒粗蛋白含量Table 1 Kernel crude protein content of quinoa samples used for calibration and validation

2 結果與分析

2.1 藜麥籽粒粗蛋白測試結果統(tǒng)計

由建模集和預測集藜麥樣品籽粒粗蛋白的分布情況(表1)可知,122份樣品中,建模集的94個樣品中,粗蛋白含量變異范圍為11.3%～22.7%,平均含量為14.9%,驗證集的28個樣品中,粗蛋白含量變異范圍為10.2%～20.9%,平均含量為15.3%。與前人研究結果相比,分布范圍更廣[21,24],分布較為均勻,具有較好的代表性。

表2 各種光譜預處理方法所得模型的評價參數Table 2 Evaluation parameters of models obtained by various spectral pretreatment methods

2.2 藜麥籽粒的近紅外光譜

每份藜麥粉末掃描3次,采用Unscrambler 10.4軟件的主成份分析(PCA,principal component analysis)法和光譜圖去除了化學異常值樣本1份和光譜異常值樣本4份。如圖1所示,參試樣品在波長950～1650 nm范圍內均有明顯的吸收峰,其中不同樣本在950～1130 nm區(qū)間的近紅外光譜較分散,而在1130～1650 nm區(qū)間則十分接近。有文獻報道[25-27],950～1250 nm處于C-H等鍵的多級倍頻區(qū),光譜圖較散;而1250～1650 nm區(qū)間,則是C-H鍵、O-H鍵和C-O鍵的一級倍頻和組合頻區(qū),信號強,能反映出樣品的性質和關聯(lián);和蛋白質相關的N-H鍵吸收峰位于1034和1500 nm。所有樣品的圖譜變化趨勢基本相似,不同藜麥中的營養(yǎng)成分含量的高低差異,使得每份樣品在同一吸收峰的吸光度略有不同,可以通過建立數學模型來反映近紅外光譜和成分含量之間的關系。

圖1 去除異常光譜值后的藜麥籽粒原始光譜圖Fig.1 The original spectra of quinoa except anomalous spectral

2.3 光譜模型的建立

比較了9種光譜預處理方法(表2),結果表明SG(Savitzky-Golay,濾波擬合法)+SNV(Standard Normal Variate,標準正態(tài)變量)的校正和交叉驗證決定系數最高,校正和預測均方根誤差最低,說明該方法所建的模型為最佳。

粗蛋白含量模型交叉檢驗得到預測值和實際值的散點圖,校正集決定系數(R2)為0.9380,被測組分濃度分析誤差(RMSEP)為0.4823,說明預測值和真實值差距較小,模型效果較好(圖2)。石振興等[20]利用藜麥粉末建立了藜麥蛋白含量的近紅外檢測模型,其決定系數和分析誤差分別為0.9191和0.598,略差于本研究結果,且本研究以籽粒為檢測對象,比前者的粉末更加便利。

圖2 藜麥籽粒蛋白含量校正模型(A)和交叉驗證模型(B)Fig.2 A:Corrected model for quinoa grain protein content;B:The cross-validated model for quinoa grain protein content

2.4 外部檢驗

為了進一步驗證藜麥近紅外模型的準確性,用28份樣品進行外部檢驗。在DA7200近紅外光譜儀上掃描并通過模型計算被測樣品的籽粒粗蛋白含量預測值,然后用DPS7.05軟件對預測值和國標法測定值進行比較,結果如圖3所示。28份藜麥樣品的籽粒粗蛋白含量國標法測定值和模型預測值之間具有極顯著的相關性(R2=0.9416)。經單因素方差分析表明,國標法測定值和模型預測值之間無顯著差異(P=0.7095),說明模型可靠性較好。

圖3 藜麥籽粒粗蛋白模型的外部檢驗結果Fig.3 External verification results of quinoakernel crude protein content using PLS model

3 結論

在950～1650 nm波長的近紅外范圍中,采用SG+SNV進行光譜預處理后,利用PLS建立藜麥籽粒近紅外光譜粗蛋白測定模型,模型決定系數值為0.9380,均方誤差為0.4823。經驗證,該模型可靠性較好,能夠較準確的預測藜麥籽粒的粗蛋白含量,為優(yōu)質藜麥品種的選育提供技術支撐。