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      發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥生長(zhǎng)、免疫、抗氧化能力以及腸道菌群影響

      2020-08-16 23:52:58趙云龍葉梅燕王嘉婧張東鳴
      中國(guó)畜牧雜志 2020年8期
      關(guān)鍵詞:環(huán)菌發(fā)酵飼料菌門

      趙云龍,葉梅燕,王嘉婧,于 婷,張東鳴

      (1.通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,吉林通化 134000;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118)

      洛氏鱥(Phoxinus lagowskiiDybowski)也叫柳根子,屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、雅羅魚亞科(Leuciscinae)、鱥屬(Phoxinus),是一種小型雜食性冷水魚,肉質(zhì)細(xì)嫩、美味又營(yíng)養(yǎng),在小型魚類中頗具優(yōu)勢(shì),深受消費(fèi)者青睞。目前,北方地區(qū)洛氏鱥的人工養(yǎng)殖面積越來越大,前景喜人。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)向綠色產(chǎn)業(yè)發(fā)展,對(duì)水產(chǎn)品的安全、無污染、無殘留的要求日益嚴(yán)格,微生物發(fā)酵飼料越來越受到重視,與傳統(tǒng)飼料相比,其優(yōu)勢(shì)在于可降低植物蛋白抗?fàn)I養(yǎng)因子含量,改善蛋白質(zhì)品質(zhì),提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。

      蜜環(huán)菌(Armillaria mellea)屬于蘑菇目(Agaricales)、泡頭菌科(Physalacriaceae)、蜜環(huán)菌屬(Armillaria),具有極高營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值、能降低致病菌的入侵、調(diào)節(jié)免疫及抗氧化能力等多種效用,在藥品、保健品、功能食品等領(lǐng)域中廣泛的應(yīng)用[2],但尚未見在魚類飼料領(lǐng)域中應(yīng)用。因此,為了對(duì)蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果進(jìn)行科學(xué)評(píng)估,本試驗(yàn)從生長(zhǎng)性能、免疫、抗氧化能力以及腸道菌群等方面入手,探討蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥生長(zhǎng)性能及生理功能的影響,為蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用和新型水產(chǎn)飼料資源的開發(fā)提供理論依據(jù)和參考。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)飼料 4種發(fā)酵飼料原料組成及營(yíng)養(yǎng)成分如表1所示。豆粕為蛋白質(zhì)源,豆油和麥麩為脂肪源,青菜為維生素源?;A(chǔ)飼料中分別添加0、6、12、18 mL/kg蜜環(huán)菌菌液。原料進(jìn)行粉碎后,按配方的各原料比例稱重充分混勻,滅菌后在超凈臺(tái)上接入蜜環(huán)菌菌液,密封后在暗處發(fā)酵48 h(20℃)后,制成長(zhǎng)度約3~4 mm的顆粒料,置于陰涼處風(fēng)干,放入4℃的冰箱保存。蜜環(huán)菌菌液是以馬鈴薯、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、葡萄糖、蠶蛹粉和維生素B1作為底物,接種蜜環(huán)菌發(fā)酵而成。

      1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 經(jīng)過1周馴養(yǎng)后,將360尾外觀正常、健康活潑、初始體重量為(20.85±2.04)g、體長(zhǎng)為(118.7±9.7)mm的洛氏鱥,隨機(jī)分成4組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)30尾洛氏鱥,置于養(yǎng)殖容器(聚乙烯塑料水族箱,規(guī)格為75 cm×60 cm×50 cm)。

      表1 基礎(chǔ)飼料原料組成及營(yíng)養(yǎng)成分

      養(yǎng)殖期間按洛氏鱥平均體重的1% 投喂,每天08:00和17:00投喂。每隔1周測(cè)1次洛氏鱥的總重以調(diào)整投喂量。養(yǎng)殖用水先經(jīng)曝氣,每周換水1次(全部)。養(yǎng)殖期間水質(zhì)條件為(18±2)℃、pH 7.0~7.5、溶解氧含量大于5.0 mg/L、氨氮含量小于0.01 mg/L、硫化物小于0.05 mg/L。養(yǎng)殖13周后,停止喂食,24 h后收集樣品。

      1.3 采樣與分析

      1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo) 參考鐘小群等[3]測(cè)定方法。

      成活率(SR)=Nt/N0×100%

      增重率(WGR)=(Wt-W0)/W0×100%

      特定生長(zhǎng)率(SGR,%/d)=(lnWt-lnW0)/T×100

      飼料系數(shù)(FCE)=F/(Wt-W0)

      肥滿度(CF,g/cm3)=Wt/L3×100

      式中,N0為初始魚尾數(shù),Nt為末魚尾數(shù),W0為試驗(yàn)開始時(shí)魚體總重(g),Wt為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚體總重(g),F(xiàn)為攝食量(g),T為養(yǎng)殖時(shí)間(d),L為末時(shí)魚的體長(zhǎng)(cm)。

      1.3.2 免疫和抗氧化指標(biāo) 樣品測(cè)定數(shù)量為3尾/ 箱。解剖取肝臟,用吸水紙將采集的肝臟擦干,精準(zhǔn)稱取組織,冰浴條件下,按體積(mL):質(zhì)量(g)為9:1的比例加入9倍體積生理鹽水,使用玻璃研磨器磨碎,裝進(jìn)離心管,4℃ 2 500 r/min離心10 min,取上清液。采用南京建成生物工程研究所試劑盒,測(cè)定肝臟溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)和總抗氧化能力(T-AOC),具體方法參照試劑盒說明書。

      1.3.3 腸道微生物菌群 9尾/組(每箱3尾,混合)。每箱隨機(jī)采集3尾魚在無菌操作臺(tái)中取出腸道部分;用無菌鑷子擠出內(nèi)容物后,將腸道剪開并用塑料刮板刮取腸道黏膜,將3尾魚的腸道內(nèi)容物和腸道黏膜樣品混合存放于1.5 mL無菌Eppendorf管中并置于液氮中保存,共計(jì)12個(gè)樣。根據(jù)16S rRNA基因V3~V4區(qū)序列,選擇測(cè)序引物為341F:(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R:(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物在上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司通過Illumina PE250測(cè)序。通過比對(duì)Silva核糖體數(shù)據(jù)庫(kù),以97%相似性水平為標(biāo)準(zhǔn)劃分可操作分類單元(OUT),并采用RDP classifier貝葉斯算法進(jìn)行分類學(xué)分析,在門(Phylum)和屬(Genus)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣品的群落組成,利用Mothur軟件和R語(yǔ)言工具分別進(jìn)行多樣性分析、物種組成和結(jié)構(gòu)分析等。

      1.4 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA),利用Duncan′s法進(jìn)行多重比較,顯著水平為P<0.05。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 不同濃度蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥生長(zhǎng)指標(biāo)的影響如表2所示,4組洛氏鱥均無死亡,隨著蜜環(huán)菌菌液添加量的增加,洛氏鱥的WGR、SGR和CF均呈先升高后降低趨勢(shì),F(xiàn)CE則呈先降低后升高趨勢(shì),其中6、12、18 mL/kg蜜環(huán)菌組CF與0 mL蜜環(huán)菌組存在顯著差異。6、12 mL/kg蜜環(huán)菌組在WGR、SGR、FCE和CF表現(xiàn)較優(yōu),然而18 mL/kg蜜環(huán)菌組在WGR、SGR和FCE表現(xiàn)最差。

      表2 不同濃度蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

      2.2 不同濃度蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥免疫和抗氧化指標(biāo)的影響 由表3可見,洛氏鱥肝臟LZM活性隨著蜜環(huán)菌菌液添加量的增加而升高,6、12、18 mL/kg蜜環(huán)菌組顯著高于0 mL/kg蜜環(huán)菌組,且3組之間存在顯著差異。洛氏鱥肝臟的SOD活性隨著蜜環(huán)菌菌液添加量的增加而升高,6、12、18 mL/kg蜜環(huán)菌組顯著高于0 mL/kg蜜環(huán)菌組,但6、12 mL/kg蜜環(huán)菌組不存在顯著差異。洛氏鱥肝臟T-AOC隨著蜜環(huán)菌菌液添加量的增加而呈先上升后下降的趨勢(shì),12 mL/kg蜜環(huán)菌組最大,與0 mL/kg蜜環(huán)菌組間存在顯著差異,但與6、18 mL/kg蜜環(huán)菌組無顯著差異。

      表3 不同濃度蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥免疫和抗氧化指標(biāo)的影響

      2.3 不同濃度蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥腸道菌群物種組成和結(jié)構(gòu)的影響 由洛氏鱥腸道樣品門水平聚類樹與柱狀圖組合分析圖可知(圖1),6、12 mL/kg蜜環(huán)菌組之間群落結(jié)構(gòu)相似度最高,其次18 0 mL/kg蜜環(huán)菌組最低。飼喂發(fā)酵飼料后洛氏鱥腸道菌群門水平結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,主要涉及變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)。在0~18 mL/kg蜜環(huán)菌組4組洛氏鱥腸道中,變形菌門均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),但蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料飼喂使其豐度降低(90.84%~ 73.13%),之后擬桿菌門(2.43%~ 10.11%)和厚壁菌門(2.30%~ 12.78%)豐度增加,放線菌門豐度降低(3.28%~2.18%)。在屬的分類水平上(圖2),4組洛氏鱥腸道樣品共涉及298個(gè)屬,其中0、6、12、18 mL/kg蜜環(huán)菌組分別涉及179、180、210、142個(gè)屬,鞘氨酸單胞菌屬(Sphingomonas)、Caulobacteraceae_uncultured屬和固氮螺菌屬(Azospirillum)是4組洛氏鱥腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌屬。與0 mL/kg蜜環(huán)菌組相比,6、12、18 mL/kg蜜環(huán)菌組飼喂發(fā)酵飼料后洛氏鱥腸道菌群屬水平結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,鞘氨酸單胞菌屬(39.46%~20.30%)、Caulobacteraceae_uncultured屬(17.30%~7.01%)豐度逐漸下降,而固氮螺菌屬(4.27%~15.45%)逐漸增大。

      3 討論

      3.1 發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥生長(zhǎng)影響 20世紀(jì)60年代初期就有學(xué)者將微生物添加到飼料中,發(fā)酵后的飼料具有適口性強(qiáng)、消化吸收利用率高等特點(diǎn)[4],且天然的醇香味具有很好的誘食作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明,添加蜜環(huán)菌發(fā)酵的飼料對(duì)洛氏鱥的WGR和AGR、FCE以及CE均有利。原因可能是經(jīng)過發(fā)酵后,豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子得到有效降解,同時(shí)部分大分子蛋白被降解成魚類可直接消化吸收的小分子蛋白、小肽和氨基酸,飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得以改善,進(jìn)而提高了動(dòng)物機(jī)體的利用率[5]。

      3.2 發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥免疫和抗氧化能力的影響 魚類生活在水中,為特殊生境,因此在抵抗病害方面,與特異性免疫機(jī)制相比,非特異性免疫機(jī)制更為重要[6]。LZM具有較強(qiáng)抗菌、抑菌功能[7],破壞病原菌細(xì)胞壁[8],在魚類啟動(dòng)免疫保護(hù)機(jī)制時(shí)發(fā)揮重要作用。SOD普遍存在于細(xì)胞漿及線粒體基質(zhì)中,是一種能清除活性氧自由基的重要抗氧化酶類,能加強(qiáng)免疫能力[9]。T-AOC包括抗氧化酶和非酶促抗氧化2部分,作用主要是消除活性氧自由基避免引發(fā)脂質(zhì)過氧化、分解過氧化物阻斷過氧化鏈和除去起催化作用的金屬離子等,是魚類抗氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志性指標(biāo)[10]。肝臟是洛氏鱥的代謝活動(dòng)中心,免疫和抗氧化能力變化直接關(guān)系到整個(gè)機(jī)體的功能。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,12 mL/kg蜜環(huán)菌組發(fā)酵飼料可顯著提高洛氏鱥肝臟LZM和SOD活性,提高T-AOC,說明蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥肝臟的免疫和抗氧化功能起到了積極的調(diào)控作用,可刺激機(jī)體的非特異性反應(yīng),進(jìn)而提高免疫和抗氧化機(jī)能。一方面可能是蜜環(huán)菌發(fā)酵使基礎(chǔ)飼料中的小分子蛋白、肽類和游離氨基酸含量相對(duì)較高,增強(qiáng)了機(jī)體的非特異性免疫力;另一方面可能是蜜環(huán)菌大量繁殖,被利用后增強(qiáng)了機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫機(jī)能。

      3.3 發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥腸道菌群影響 洛氏鱥腸道優(yōu)勢(shì)菌群中排前5位的門分別是變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和梭桿菌門。這5門在異育銀鯽[11]、羅非魚[12]和草魚[13]的腸道優(yōu)勢(shì)菌群中都有不同程度的檢出;也是魚類腸道中主要的好氧、兼性厭氧和專性厭氧菌類群[14-15]。魚類腸道微生物的構(gòu)成不僅與宿主的特性密切相關(guān),還與飲食和生活環(huán)境的多樣性相關(guān)[16],如Ray等[17]和Liu等[18]均利用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)研究羅非魚腸道菌群,前者結(jié)果顯示優(yōu)勢(shì)菌群為梭桿菌門、擬桿菌門和變形菌門,而后者則顯示優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和放線菌門。變形菌門是細(xì)菌中最大的一門,普遍存在于海洋生物腸道之中,是羅非魚腐敗過程中的優(yōu)勢(shì)菌門[19],其含量過高會(huì)破壞腸道微生態(tài)環(huán)境,增加機(jī)體患病可能性[20];在厭氧條件下,某些變形菌與動(dòng)物形成共生關(guān)系,參與環(huán)境中的碳和硫循環(huán)[21]。擬桿菌門與DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等有機(jī)物的轉(zhuǎn)換密切相關(guān),并參與糖類、膽汁酸和類固醇代謝[22]。厚壁菌門在宿主腸道中被認(rèn)為是促進(jìn)纖維素分解[23]和幫助多糖發(fā)酵[24]的重要菌群。放線菌門屬于條件致病菌,某些營(yíng)腐生生活菌可分泌許多胞外酶和次生代謝產(chǎn)物等物質(zhì)參與自然界氮素循環(huán),而某些放線菌為致病菌,可在機(jī)體免疫能力低時(shí)侵染機(jī)體,產(chǎn)生慢性或亞急性疾病[25-26]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,12 mL/kg蜜環(huán)菌組發(fā)酵飼料中變形菌門和放線菌門豐度降低,厚壁菌門和擬桿菌門豐度提高。鞘氨酸單胞菌屬微生物能夠被動(dòng)物T細(xì)胞識(shí)別,使動(dòng)物免疫力降低,進(jìn)而感染各種疾病[27],Caulobacteraceae_uncultured屬細(xì)菌在無氮環(huán)境中豐度較高[28],而固氮螺菌屬細(xì)菌則是一類介于自生固氮和共生固氮之間的微生物。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,12 mL/kg蜜環(huán)菌組發(fā)酵飼料使鞘氨酸單胞菌屬和Caulobacteraceae_uncultured屬豐度逐漸下降,固氮螺菌屬逐漸增大。這表明蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料可以優(yōu)化腸道菌群豐度,增強(qiáng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換和吸收,有利于洛氏鱥健康??赡苁抢妹郗h(huán)菌發(fā)酵其菌體蛋白質(zhì)提高了基礎(chǔ)飼料生態(tài)質(zhì)量。

      4 結(jié)論

      本試驗(yàn)在基礎(chǔ)飼料中添加12 mL/kg蜜環(huán)菌菌液,發(fā)酵48 h(20℃)制成蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料飼喂效果最好,可提高洛氏鱥生長(zhǎng)性能、免疫和抗氧化能力,改變腸道菌群豐度,促進(jìn)有益菌繁殖,但不改變腸道細(xì)菌親緣關(guān)系。因此,進(jìn)一步研究蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用十分必要,為新型水產(chǎn)飼料資源的開發(fā)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)和參考。

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