番石榴葉炮制品質(zhì)量標準研究

莫單丹 周小雷 唐炳蘭 周雅琴 孫國雄 谷筱玉*

1.廣西藥用植物園/廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530023；2.廣西藥物不良反應監(jiān)測中心，廣西 南寧 530023

番石榴葉為桃金娘科植物番石榴PsidiumguajavaLinn.的葉。中醫(yī)認為具有收斂止瀉、消炎止血之功，用于久痢、泄瀉、創(chuàng)傷出血、皮膚濕疹、瘙癢、熱痱、牙痛。壯藥認為具有調(diào)谷道、收斂止瀉、止血的功效，用于阿意咪(痢疾)、啊肉甜(糖尿病)、能唅能累(濕疹)、諾嚎噠(牙周炎)。炒番石榴葉收斂止瀉作用增強，用于單純性消化不良泄瀉,民間多用米炒番石榴葉治療腹瀉[1-4]。質(zhì)量標準收載在《廣西壯族自治區(qū)壯藥藥材質(zhì)量標準》(二卷)中，其炮制項下只記載炒番石榴葉為加大米適量共炒至米變黃色，未規(guī)范炮制輔料的量及炮制品的質(zhì)量標準，本課題組前期對番石榴葉炮制品制備工藝進行研究選出最佳炮制工藝，本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，對番石榴葉炮制品進行顯微特征、薄層色譜鑒別，并測定其水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的含量，采用HPLC對有效成分槲皮素[5-8]進行含量測定，為番石榴葉炮制品質(zhì)量標準的制訂提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 數(shù)顯恒溫水浴鍋(邦西儀器科技(上海)有限公司，型號：HH-6)；電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司，型號：FA2004)；電子分析天平(CP2250D，Sartorius)；1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；超純水儀(美國Millipore Milli-Q Academic)；DZTW調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；炒藥機(山東青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司，型號：CY-50)；LEICA生物顯微(DM2000 LEICA/Germany)；硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司)。

1.2 試藥 番石榴葉采自廣西平樂、靖西、平南等地，經(jīng)廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室趙以民高級工程師、黃寶優(yōu)高級工程師和宋志軍副研究員鑒定為桃金娘科植物番石榴PsidiumguajavaLinn.的葉，共10批(見表1)。番石榴葉炮制品為將番石榴葉鮮品，除去雜質(zhì)，按番石榴：粳米為3∶1的比例粳米置炒藥機中共炒。在400 ℃條件下炒制20 min，粳米炒至焦黃色，取出，得番石榴葉炮制品飲片。實驗中以番石榴葉(FSLY1)對應的制品(Z1)為對照藥材。槲皮素對照品購自中國藥品生物制品鑒定所，批號：100081-201610，甲醇、磷酸、乙腈均為色譜純，乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇為分析純。

表1 番石榴葉樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微特征 本品粉末棕黃色。淀粉粒單粒多見，橢圓形，直徑4～8 μm，草酸鈣簇晶直徑35～40 μm，方晶、棕色塊多見，直徑8～20 μm。導管以螺紋導管為主，直徑30～70 μm，石細胞數(shù)量較少，棕黃色。非腺毛隨處可見，直徑10～20 μm，表皮細胞呈多邊形，氣孔為平軸式，木栓細胞棕黃色。如圖1所示。

1.淀粉粒 2.簇晶 3.方晶 4.氣孔 5.導管 6.棕色塊 7.木栓細胞 8.表皮細胞 9.纖維 10.非腺毛 11.石細胞圖1 番石榴葉炮制品粉末顯微特征圖

2.2 薄層鑒別 取本品粉末2 g(粉末過2號篩)，置具塞錐形瓶中，加入95%乙醇50 mL ，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，以石油醚萃取2次，每次10 mL，合并石油醚提取液，蒸干，殘渣加入甲醇2 mL溶解作為供試品溶液。另取番石榴葉炮制品對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版通則0502)試驗，吸取對照藥材、各批供試品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇 (20∶10∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃電熱板上加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，如圖2所示。

注：1～3：對照藥材(FSLY-Z1)4～12：樣品 (FSLY-Z2～FSLY-Z12)圖2 番石榴葉炮制品TLC

2.3 檢查 將上述10批番石榴葉炮制品根據(jù)《中華人民共和國藥典》[9]方法進行水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物的檢查。

2.3.1 水分 根據(jù)中國藥典2015 年版第四部通則0832水分測定法項下烘干法進行測定。分別對上述10批藥材進行水分測定，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，10批番石榴葉炮制品水分測定結(jié)果為4.16%～10.1%。根據(jù)測定結(jié)果，考慮南方氣候較潮濕，結(jié)合儲藏過程中對水分控制的要求，暫定番石榴葉炮制品水分含量不得超過12%。

2.3.2 總灰分 根據(jù)中國藥典2015 年版第四部通則2302 灰分測定法項下總灰分測定法進行測定。分別對上述批10制品進行總灰分測定，結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示，10批番石榴葉炮制品總灰分測定結(jié)果為5.12%～6.40%。根據(jù)測定結(jié)果，暫定番石榴葉炮制品總灰分含量不得超過7.0%。

2.3.3 酸不溶性灰分 根據(jù)中國藥典2015年版第四部通則2302灰分測定法項下酸不溶性灰分測定法進行測定。分別對上述10批制品進行酸不溶性灰分測定，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，10批番石榴葉酸不溶性灰分測定結(jié)果為 0.02%～0.20%。暫定番石榴葉炮制品酸不溶性灰分含量不得超過0.3%。

2.3.4 浸出物 以70%乙醇作溶劑，根據(jù)中國藥典2015年版第四部通則 2201醇溶性浸出物測定法項下熱浸法進行測定。分別對上述10批制品進行浸出物含量測定，結(jié)果見表2，結(jié)果表明，10批番石榴葉炮制品浸出物含量測定結(jié)果為26.21%～32.56%。根據(jù)測定結(jié)果，暫定番石榴葉炮制品藥材浸出物含量不得少于26.0%。

表2 番石榴葉炮制品水分、灰分、浸出物及槲皮素含量 (n=3，%)

2.4 含量測定[10-13]

2.4.1 色譜條件 色譜柱為迪馬C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.5磷酸的0.1三乙胺溶液(25∶75)；檢測波長為372 nm ;流速為1.0 mL/ min;柱溫為30 ℃；進樣量為12 μL。葛根素的理論塔板數(shù)不低于5000。如圖3所示。

2.4.2 對照品溶液的制備 取槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制得每1 mL含槲皮素99 μg的溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取番石榴葉炮制品粉末(過4號篩)1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇溶液80 mL,加熱回流提取2 h，濾過，合并濾液，蒸干，殘渣用色譜甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過濾即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察 取4.2項制得的對照品溶液，按上述色譜條件分別精密進樣1、3、5、7、9、11 μL測定峰面積，以峰面積(Y)對進樣量(X)進行線性回歸。得回歸方程為Y= 5799.3X+20.47,r=0.9999(n=6)。結(jié)果表明，槲皮素進樣量在0.099～1.089 μg的范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

注：A.槲皮素對照品的HPLC圖； B.番石榴葉炮制品的HPLC圖圖3 番石榴葉炮制品的HPLC圖

2.4.5 精密度試驗 精密吸取取同一對照品溶液,按照上述色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄色譜圖。結(jié)果槲皮素峰面積的RSD為1.14%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別于配制后 0、2、4、6、8、12 h進樣測定，記錄色譜圖。以槲皮素峰面積計算，結(jié)果的RSD為1.23%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.7 重復性試驗 取同一批樣品粉末，按供試品溶液制備方法平行制備6份，依法測定,記錄色譜圖。結(jié)果的RSD為1.99%(n=6),表明方法有良好的重現(xiàn)性。

2.4.8 加樣回收試驗 取已知槲皮素含量的番石榴葉炮制品(FSLY-Z5)粉末0.5 g，精密稱定，平行6份，分別精密加入與其含有等量的槲皮素對照品，按供試品制備方法制備供試液，按上述色譜條件測定槲皮素的含量，結(jié)果見表3。計算槲皮素平均回收率為98.61%，RSD為1.56%。表明方法的回收率良好。

表3 番石榴葉炮制品中槲皮素加樣回收試驗結(jié)果 (n=6)

2.4.9 樣品含量測定 按照上述供試品溶液制備方法和色譜條件，對上述10批番石榴葉炮制品中的槲皮素進行含量測定。結(jié)果含量在0.056%～0.130%之間，平均含量為0.0625%。該制品中槲皮素的含量限度建議以干燥炮制品計不得少于0.05%。

3 討論

實驗分別取番石榴葉95%乙醇提取物、石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇等萃取物的溶液進行點樣，以石油醚-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇不同比例為展開劑進行多次試驗和篩選，發(fā)現(xiàn)取石油醚萃取物溶液點樣，以石油醚：三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇(20∶10∶1∶1)作為展開劑，斑點比較清晰，分離度較好，可用于番石榴葉炮制品的薄層鑒別分析。

在色譜條件的摸索當中，選擇了甲醇-0.5%磷酸溶液、甲醇-0.5%磷酸的0.1%三乙胺溶液、乙腈-0.5%磷酸的0.2%三乙胺；乙腈-0.5%磷酸的0.1%三乙胺溶液等不同濃度作為流動相進行多次試驗和篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.5%磷酸的0.1%三乙胺溶液(25∶75)為流動相，目標峰明顯，對稱因子好。同時考察了220～500 nm范圍內(nèi)槲皮素的吸收光譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在372 nm處有強吸收峰，故選擇372 nm為檢測波長。

由于樣品的采收、加工和貯藏等因素，番石榴葉炮制品各樣品之間的水分、總灰分、浸出物和含量測定結(jié)果有一定的差異。根據(jù)測定結(jié)果，考慮南方氣候較潮濕，結(jié)合儲藏過程中對水分控制的要求，建議番石榴葉炮制品藥材水分、總灰分及酸不溶性灰分分別不得過12%、7%、0.3%，醇溶性浸出物應不少于26.0%，已有研究[5]表明番石榴葉苷類部位的止瀉作用與其槲皮素苷類含量呈相關(guān)性,其藥效受槲皮素苷類的含量變化影響,本研究選擇槲皮素含量作為質(zhì)量控制指標，番石榴葉炮制品中的槲皮素進行含量測定結(jié)果在0.056%～0.130%之間，含量平均為0.0625%。根據(jù)樣品含量檢測結(jié)果，考慮炮制品原料藥產(chǎn)地、炮制加工等因素的影響，暫按含量平均值的80%擬定番石榴葉炮制品中槲皮素的含量應不少于0.05%

4 結(jié)論

本實驗描述了番石榴葉炮制品的顯微特征，并研究了其薄層鑒別方法，制定了番石榴葉炮制品水分、總灰分、酸不溶性灰分及醇溶性浸出物限度，建立了番石榴葉炮制品中槲皮素的含量測定方法并進行驗證，暫定番石榴葉炮制品藥材水分、總灰分及酸不溶性灰分分別不得過12%、7%、0.3%，醇溶性浸出物應不少于26.0%；番石榴葉炮制品中槲皮素的含量應不少于0.05%。本研究所建立的方法準確可靠，為番石榴葉炮制品的質(zhì)量評估、監(jiān)管等提供科學依據(jù)。