枯草芽孢桿菌發(fā)酵脫脂麥胚自由基清除率研究

王敏，侯銀臣，張明丹，劉亞楠，彭丹丹，劉娜*

(1.河南工業(yè)大學谷物資源轉(zhuǎn)化與利用省級重點實驗室，鄭州 450001；2.河南工業(yè)大學 生物工程學院，鄭州 450001；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 食品與生物工程學院，鄭州 450046)

近年來，隨著人們的營養(yǎng)需求越來越高，麥胚的營養(yǎng)成分及微量生理活性物質(zhì)越來越受到重視[1]，廣泛應用于焙烤食品、發(fā)酵飲料、豆制品、嬰幼兒食品和其他營養(yǎng)食品中[2,3]。

目前抗氧化活性研究是國內(nèi)外研究的熱點。自由基清除即抗氧化的研究、開發(fā)及利用成為了現(xiàn)代科學發(fā)展的必要趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，天然植物中有許多的化學物質(zhì)具有抗氧化活性，而這些天然的抗氧化劑分為植物源性抗氧化劑和動物源性抗氧化劑[4]。

有研究表明，發(fā)酵可以提高物質(zhì)的抗氧化活性。如張友維等[5]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生粕制備抗氧化肽，提高了DPPH自由基清除率；吳澤柱等[6]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米蛋白粉生產(chǎn)玉米肽，提高了抗氧化活性。張會等[7]研究表明，從米曲霉發(fā)酵的玉米胚芽粕中提取玉米胚芽蛋白，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后抗氧化能力增強。利用微生物發(fā)酵，發(fā)酵液中的多肽分子量主要集中在1000 Da以下，并且發(fā)酵液對多種自由基都有一定的清除能力[8]，這為提高小麥胚芽的抗氧化活性提供了新思路。本文以小麥胚芽為原料，DPPH自由基清除率為指標進行響應面優(yōu)化，選取最優(yōu)發(fā)酵工藝，為后續(xù)工業(yè)化利用麥胚制造具有抗氧化活性的制品提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥胚芽：由河南省鯤華生物技術(shù)有限公司提供；枯草芽孢桿菌：實驗室保藏菌種；DPPH：合肥博美生物科技有限責任公司；其他試劑：均為分析純。

1.2 試驗儀器

UV2600S雙光束紫外可見分光光度計 上海重逢科學儀器有限公司；GXZ-智能光照培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；QYC-200全溫培養(yǎng)搖床、電熱恒溫水浴鍋 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技有限公司；MJ-78A高壓滅菌鍋 施都凱儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化和培養(yǎng)

參照文獻[9]中的方法，將保藏完好的枯草芽孢桿菌在無菌狀態(tài)下接種于滅菌過的LB固體斜面培養(yǎng)基中，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h進行菌種活化。將活化后的枯草芽孢桿菌接入滅菌過的種子培養(yǎng)基(PDB培養(yǎng)基)中，在37 ℃、150 r/min的條件下，培養(yǎng)24 h。經(jīng)平板計數(shù)法測定菌種濃度為6×105CFU/mL[10]。

1.3.2 小麥胚芽培養(yǎng)液的制備

稱量20 g小麥胚粉置于500 mL的錐形瓶中，按料液比加入一定量的水，攪拌均勻，并對其進行高溫殺菌處理。冷卻至室溫加入活化后的枯草芽孢桿菌，置于37 ℃搖床上按照所需時間培養(yǎng)。

1.3.3 小麥胚芽發(fā)酵產(chǎn)物的單因素試驗

其他條件不變，以發(fā)酵時間、料液比和菌種接種量為自變量，小麥胚芽DPPH自由基清除率為因變量，確定麥胚發(fā)酵工藝最佳條件[11]。

1.3.4 小麥胚芽DPPH自由基清除率的響應面試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵時間、料液比和菌種接種量為3個因素，DPPH自由基清除率為響應值，進行三因素三水平試驗設(shè)計[12]。

1.3.5 抗氧化活性的評價

DPPH自由基清除率的測定方法參照文獻[13,14]進行。 吸取1 mL發(fā)酵液于100 mL容量瓶中稀釋100倍。吸取稀釋液2 mL加入試管中，再添加0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL，搖勻靜置30 min后，在517 nm處測定吸光值。

(1)

式中：A0為空白吸光值(2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL無水乙醇)；A試樣為樣品吸光值；A對照為對照組吸光值(2.0 mL無水乙醇樣品溶液與2.0 mL無水乙醇)。

發(fā)酵液稀釋100倍后，超氧陰離子自由基清除率的測定方法參照文獻[15]進行；羥基自由基清除率的測定方法參照文獻[16]進行；ABTS+自由基清除率的測定方法參照文獻[17]進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥胚芽發(fā)酵產(chǎn)物的單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對 DPPH 自由基清除率的影響

在溫度37 ℃，枯草芽孢桿菌接種量5%，發(fā)酵初始pH 6，料液比1∶10時，考察發(fā)酵時間對DPPH自由基清除率的影響，見圖1。

圖1 不同發(fā)酵時間對DPPH 自由基清除率的影響Fig.1 Effect of different fermentation time on the scavenging rates of DPPH free radical

由圖1可知，當發(fā)酵時間小于36 h時，DPPH自由基清除率變化緩慢。36～48 h時DPPH自由基清除率持續(xù)增加，在發(fā)酵48 h時DPPH自由基清除率達到最大值，為61.41%，比發(fā)酵前增加了37.93%。隨后DPPH自由基清除率又逐步減小。說明具有活性的肽被過度發(fā)酵成沒有活性的肽和氨基酸。故可以確定最優(yōu)發(fā)酵時間為48 h，此時DPPH自由基清除率最佳。

2.1.2 發(fā)酵中培養(yǎng)基料液比對 DPPH 自由基清除率的影響

在溫度37 ℃，枯草芽孢桿菌接種量5%，發(fā)酵初始pH 6，發(fā)酵時間48 h時，考察發(fā)酵培養(yǎng)基料液比對發(fā)酵麥胚DPPH自由基清除率的影響，見圖2。

圖2 發(fā)酵培養(yǎng)基料液比對 DPPH 自由基清除率的影響Fig.2 Effect of ratio of solid to liquid of fermentation medium on the scavenging rates of DPPH free radical

由圖2可知，當料液比為1∶11時，DPPH 自由基清除率達到最大值68.96%，水分的增加使枯草芽孢桿菌能更好地利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)。隨著料液比繼續(xù)增大，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝物質(zhì)的堆積，DPPH自由基清除率下降。因此，料液比1∶11時DPPH自由基清除率最佳。

2.1.3 不同接種量對 DPPH 自由基清除率的影響

在溫度37 ℃，發(fā)酵初始pH 6，料液比1∶10，發(fā)酵時間48 h時，考察不同接種量對發(fā)酵麥胚DPPH自由基清除率的影響，見圖3。

圖3 不同接種量對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of different inoculation amount on the scavenging rates of DPPH free radical

由圖3可知，當接種量為3%時，DPPH 自由基清除率達到最大，為65.25%。當菌種接種量大于3%時，發(fā)酵液中的DPPH自由基清除率反而下降，且降低幅度遠大于上升幅度?？赡苁怯捎诳莶菅挎邨U菌的大量存在，使一些原本具有活性的多肽被進一步水解成沒有活性的肽，因此應嚴格控制菌的添加量。當接種量為3%時DPPH自由基清除效果最佳。

2.2 小麥胚芽DPPH自由基清除回歸分析

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計原理，選取菌種接種量、發(fā)酵時間和料液比作為3個因素設(shè)計三因素三水平試驗，結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken試驗方案及結(jié)果Table 1 Box-Behnken test scheme and results

為了考察影響小麥胚芽DPPH自由基清除率的各因素之間的交互性，通過Design-Expert v8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行分析，擬合出的二次多項回歸方程為：

Y=71.89+1.96A+1.64B+3.40C-1.00AB-1.96AC-2.72BC-12.21A2-9.12B2-4.66C2。 (2)

由表2可知，F(xiàn)值為47.22，表示該模型有意義；P<0.0001，極顯著，表明該模型具有統(tǒng)計學意義；回歸方程的R2=0.9838，表明試驗擬合度較好，為98.38%；Adeq Precision(信噪比)為18.844(>4)，表明該模型可用于數(shù)據(jù)分析。0.8006的“RPred2”與0.9630的“ RAdj2”在合理范圍內(nèi)，表示方程的擬合性非常好，可用此模型對試驗進行分析[18,19]。

表2 發(fā)酵麥胚中DPPH自由基清除率的回歸模型方差分析Table 2 The regression model variance analysis of DPPH radical scavenging rates in fermented wheat germ

由圖4～圖6可知，所有響應面交互圖呈凸起狀，響應面可以直觀地反映各因素對響應值的影響。響應面交互圖坡度越大表明DPPH自由基清除率的變化越快，即更為顯著。此外，等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形與之相反。

圖4 料液比和發(fā)酵時間對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid and fermentation time on the scavenging rates of DPPH free radical

圖5 料液比和接種量對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of ratio of solid to liquid and inoculation amount on the scavenging rates of DPPH free radical

圖6 發(fā)酵時間和接種量對DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effects of fermentation time and inoculation amount on the scavenging rates of DPPH free radical

通過分析可知，DPPH自由基清除率隨著各因素先增加，達到最大值后減小或保持平衡。一次項料液比(A)、發(fā)酵時間(B)和接種量(C)都對DPPH自由基清除率有顯著性，且影響順序為接種量(C)>料液比(A)>發(fā)酵時間(B)。發(fā)酵時間(B)和菌種接種量(C)之間的交互性對發(fā)酵麥胚DPPH自由基清除率的影響有顯著性。通過響應面得出的最優(yōu)因素組合是料液比1∶11.7、發(fā)酵時間48.3 h、菌種接種量3.2%。

2.3 響應面驗證

通過響應面優(yōu)化得到的最優(yōu)因素組合是料液比1∶11.66、發(fā)酵時間48.25 h、菌種接種量3.22%，此條件下DPPH自由基清除率為68.13%?？紤]實際操作情況，將條件修定為料液比1∶11.7、發(fā)酵時間48.3 h、菌種接種量3.2%。為了驗證模型的準確性，在此條件下經(jīng)3次平行試驗，得到DPPH自由基清除率為69.54%，與理論值68.13%的相對誤差為0.997%(<5%)，所以響應面優(yōu)化得到的條件參數(shù)準確，具有可靠價值。

2.4 最優(yōu)因素組合測量結(jié)果

工藝優(yōu)化得出的最優(yōu)因素組合是料液比1∶11.7、發(fā)酵時間48.3 h、菌種接種量，此時DPPH自由基清除率為69.54%，較發(fā)酵前提高了46.07%。經(jīng)離心后取上清液做3個平行試驗，測量羥基自由基、超氧陰離子自由基和ABTS+自由基清除能力分別為14.44%、18.72%和68.74%。

3 結(jié)論

本文以自由基清除率為指標確定料液比、發(fā)酵時間和菌種接種量3個因素對小麥胚芽DPPH自由基清除率的影響。通過設(shè)計響應面得出DPPH自由基清除率的Box-Behnken，得出各因素對多肽制備的影響順序為接種量>料液比>發(fā)酵時間。確定枯草芽孢桿菌發(fā)酵小麥胚芽制備多肽的最優(yōu)發(fā)酵條件為料液比1∶11.7、發(fā)酵時間48.3 h、菌種接種量3.2%，在此條件下發(fā)酵麥胚的DPPH自由基清除率為69.54%，較發(fā)酵前提高了46.07%。羥基自由基、超氧陰離子自由基和ABTS+自由基清除率分別為14.44%、18.72%、68.74%。