響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓提取藍(lán)莓花色苷工藝及其活性研究

王鑫，韓茜宇，薛宏坤，于國(guó)萍

(1.大理大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671003；2.黑龍江國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，哈爾濱 150090；3.清華大學(xué) 工程物理系，粒子與輻射成像教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

藍(lán)莓(blueberry)果實(shí)體型小、呈誘人的藍(lán)色，是世界上最重要的漿果之一，主要種植在我國(guó)東北和西南地區(qū)。果實(shí)中富含花色苷、超氧化物歧化酶、多種維生素等活性成分[1]，大量研究表明花色苷具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤及增強(qiáng)視力等功效[2,3]，此外，花色苷顏色誘人，風(fēng)味獨(dú)特，通常作為天然的色素和食品添加劑，被廣泛用于飲料、奶制品及膨化食品行業(yè)。藍(lán)莓是天然花色苷色素的重要來源，如何快速、高效地從藍(lán)莓中提取花色苷是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

目前，藍(lán)莓花色苷提取以傳統(tǒng)溶劑提取為主，但由于該方法效率低、耗時(shí)長(zhǎng)，同時(shí)溶劑被大量消耗[4]，無法滿足高效提取花色苷的需求。近年來，越來越多的新型提取技術(shù)被廣泛用于花色苷的提取，如超聲、微波和酶制劑(纖維素酶、果膠酶和蛋白酶等)等提取技術(shù)，以上提取技術(shù)均可以有效改善花色苷的提取效率，但同時(shí)這些新技術(shù)對(duì)設(shè)備要求較高、提取條件苛刻，且提取成本較高，均存在一定的局限性。而超高壓提取技術(shù)作為物理提取方法更適用于熱敏性成分的提取，其原理是利用超高壓破壞離子鍵、疏水鍵及膜蛋白結(jié)構(gòu)，從而降低活性成分的傳質(zhì)阻力[5]；此外，超高壓能增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，加速目標(biāo)成分溶解[6]。對(duì)比傳統(tǒng)的提取技術(shù)，超高壓提取技術(shù)具有提取時(shí)間短、提取效率高、雜質(zhì)少、節(jié)能、安全等特點(diǎn)[7]。故超高壓提取技術(shù)被廣泛應(yīng)用于茶多酚、植物多糖和黃酮的提取[8-10]。在花色苷活性方面，已有研究表明藍(lán)莓經(jīng)提取后獲得的花色苷提取物能有效抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖。薛宏坤等[11]和劉奕琳等[12]分別研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓果渣花色苷提取物和藍(lán)靛果花色苷乙醇洗脫物均能抑制HepG2細(xì)胞的增殖。目前，采用超高壓提取技術(shù)從藍(lán)莓中提取花色苷的工藝及其提取物抗腫瘤作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。因此，本研究首先探究提取壓力、保壓時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比4個(gè)因素對(duì)藍(lán)莓花色苷含量的影響，并采用響應(yīng)面方法優(yōu)化其提取工藝參數(shù)；在此基礎(chǔ)上，探究藍(lán)莓花色苷提取物的體外活性及其機(jī)制，為藍(lán)莓中天然色素的開發(fā)提供了理論依據(jù)，同時(shí)拓展了天然色素在食品中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓：新鮮的藍(lán)莓于2018年7月下旬采摘于黑龍江省大興安嶺地區(qū)，樣品經(jīng)除雜、清洗，置于-20 ℃冰箱中冷凍。

肝癌HepG2細(xì)胞：上海信裕生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)：常州市恒譽(yù)化工有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)：北京全式金生物技術(shù)有限公司；MTT和DMEM完全培養(yǎng)基：北京百奧萊博科技有限公司；乙醇、過硫酸鉀、水楊酸和鹽酸：南京中淳生物科技有限公司；三氯乙酸、硫酸亞鐵和鐵氰化鉀：天津市金中化工原料銷售有限責(zé)任公司；矢車菊素-3-葡萄糖苷(純度≥98%)：美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EVOS M7000倒置顯微鏡 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；HPP600 MPa/30 L超高壓處理裝置 包頭科發(fā)高壓科技有限公司；DRYER真空冷凍干燥器 德國(guó)西門子公司；RE-6000AT型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海耀裕儀器設(shè)備有限公司；PRACTUM224-1CN分析天平 德國(guó)賽多利斯儀器有限公司；PHS-550雷磁pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器有限公司；JYL-Y912九陽破壁機(jī) 杭州九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓粉末的制備

在試驗(yàn)前，從冰箱中將冷凍的藍(lán)莓取出，室溫解凍3 h，然后將其打漿，將果漿置于真空冷凍干燥機(jī)干燥72 h，采用植物粉碎機(jī)將其粉粹，過40目篩，制成藍(lán)莓果粉，最后將果粉避光密封保存在-18 ℃冰箱中備用。

1.3.2 藍(lán)莓花色苷超高壓提取

將藍(lán)莓果粉(2.0000±0.0005) g置于真空包裝袋中，按照不同料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，使其充分混合，封口，然后置于超高壓設(shè)備中進(jìn)行提取，提取溫度為50 ℃，提取結(jié)束后，將萃取液置于離心機(jī)中以4000 r/min離心15 min，真空抽濾得上清液，將濾渣按上述方法重復(fù)提取2次，合并3次濾液，將濾液采用真空冷凍干燥機(jī)凍干，即獲得藍(lán)莓花色苷提取物粉末，置于-18 ℃冰箱中備用。

1.3.3 超高壓提取藍(lán)莓花色苷的單因素試驗(yàn)

將藍(lán)莓粉末樣品(2.0000±0.0005) g作為提取對(duì)象，考察不同提取壓力、保壓時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)藍(lán)莓粉末中花色苷含量的影響。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)定提取壓力100，150，200，250，300 MPa 5個(gè)水平；保壓時(shí)間2，4，6*，8，10 min 5個(gè)水平；乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%*、70%、80% 5個(gè)水平；料液比1∶10、1∶20、1∶30*、1∶40、1∶50 (g/mL)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次(注：“*”表示當(dāng)考察其他參數(shù)對(duì)花色苷含量影響時(shí)，用“*”標(biāo)記的因素保持恒定水平)。

1.3.4 響應(yīng)面法試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以提取壓力(X1)、保壓時(shí)間(X2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)和料液比(X4)為自變量，以花色苷含量(Y)為響應(yīng)值。依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，優(yōu)化超高壓提取藍(lán)莓花色苷的工藝。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 The factors and levels design of experiment

采用響應(yīng)面分析法得到二次回歸模型，見公式(1)：

(1)

式中：b0為截距回歸系數(shù)；bi為線性回歸系數(shù)；bii為二次項(xiàng)回歸系數(shù)；bij為交互項(xiàng)回歸系數(shù)；Xi，Xj為自變量。

1.3.5 藍(lán)莓花色苷含量的測(cè)定

參考于澤源等[13]的方法測(cè)定不同提取條件下藍(lán)莓中花色苷含量，具體操作：從1.3.2所得的樣品溶液中取出1 mL，然后分別加入9 mL pH 1.0 KCl緩沖液和9 mL pH 4.5 CH3COONa緩沖液，避光靜置1 h，分別在520 nm和700 nm處測(cè)定其吸光值，依據(jù)公式(2)計(jì)算藍(lán)莓中花色苷含量。

(2)

式中：c為藍(lán)莓中花色苷含量，mg/g；A為樣品的吸光值；DF為稀釋倍數(shù)；V為樣品提取液的體積，mL；Mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量(449.2)；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)(26900)；l為光程，1 cm；m為藍(lán)莓果粉的質(zhì)量，g。

1.3.6 藍(lán)莓花色苷提取物抗腫瘤活性

1.3.6.1 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)

將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、1%青霉素和鏈霉素)中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.6.2 MTT法測(cè)定藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

采用MTT法測(cè)定不同濃度的藍(lán)莓花色苷提取物(在上述最優(yōu)工藝條件下獲得的花色苷提取物)對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響。操作方法同文獻(xiàn)[3]，并依據(jù)公式(3)計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(%)=As/Ac×100。

(3)

式中：As為試驗(yàn)組的吸光度值；Ac為空白對(duì)照組的吸光度值。

1.3.6.3 藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

調(diào)整HepG2細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，以2 mL/皿接種于玻璃底小皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜，換為終質(zhì)量濃度為0，50，100，200 μg/mL藍(lán)莓花色苷提取物的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.6.4 藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

取對(duì)數(shù)期HepG2細(xì)胞密度調(diào)整為2.5×105個(gè)/孔，接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24 h，用不同濃度(0，50，100，200 μg/mL)的藍(lán)莓花色苷提取物干預(yù)48 h，移除培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用PBS洗2次，然后采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色法流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS 22.0軟件對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)，組間差異比較用Duncan檢測(cè)，P<0.05表示組間具有顯著性差異；采用Origin 9.0進(jìn)行繪圖，采用Design Expert ver8.0軟件設(shè)計(jì)組合試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)藍(lán)莓花色苷含量的影響

超高壓提取藍(lán)莓花色苷的單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 提取壓力(A)、保壓時(shí)間(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)和料液比(D)對(duì)藍(lán)莓花色苷含量的影響Fig.1 Effects of extraction pressure (A), pressure-holding time (B), ethanol volume fraction (C) and solid-to-liquid ratio (D) on the yield of anthocyanins from blueberry注：在誤差線上的不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

由圖1中A可知，當(dāng)提取壓力低于200 MPa時(shí)，藍(lán)莓花色苷含量隨著提取壓力的增加呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)(P<0.05)，當(dāng)提取壓力為200 MPa時(shí)，花色苷含量達(dá)到最大值(4.61±0.05) mg/g。其原因是高壓破壞了離子鍵、疏水鍵和細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，傳質(zhì)阻力降低[14]，有利于藍(lán)莓細(xì)胞中的花色苷擴(kuò)散到周圍溶劑中；此外，升高的壓力能提高花色苷的傳質(zhì)系數(shù)和溶解度，故花色苷提取率增加。但當(dāng)壓力超過200 MPa時(shí)，繼續(xù)增加提取壓力，花色苷含量呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)(P<0.05)。其原因可能是過高的提取壓力破壞了花色苷結(jié)構(gòu)，降低了花色苷含量，同時(shí)過高的壓力還會(huì)給提取設(shè)備增加負(fù)擔(dān)[15]，綜合考慮，選擇提取壓力150，200，250 MPa作為后續(xù)組合試驗(yàn)的因素水平。

由圖1中B可知，當(dāng)保壓時(shí)間在2～6 min時(shí)，隨著保壓時(shí)間延長(zhǎng)，花色苷含量呈顯著增加趨勢(shì)(P<0.05)，當(dāng)保壓時(shí)間在6 min時(shí)，花色苷含量達(dá)到最大值(4.47±0.07) mg/g。其原因是在萃取初期藍(lán)莓細(xì)胞內(nèi)外的濃度梯度較大，濃度梯度作為傳質(zhì)的驅(qū)動(dòng)力，較大的濃度梯度有利于細(xì)胞內(nèi)的花色苷大量擴(kuò)散到溶劑中，使得花色苷含量顯著增加。當(dāng)保壓時(shí)間超過6 min時(shí)，花色苷含量隨著保壓時(shí)間延長(zhǎng)無顯著變化(P>0.05)。其原因是隨著保壓時(shí)間延長(zhǎng)，內(nèi)外濃度梯度趨近于零，故花色苷含量無顯著變化。綜合考慮，選擇保壓時(shí)間4，6，8 min作為后續(xù)組合試驗(yàn)的因素水平。

由圖1中C可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，花色苷含量顯著增加(P<0.05)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%時(shí)，花色苷含量達(dá)到最大值(4.71±0.06) mg/g。其原因是60%乙醇極性與花色苷極性相似，依據(jù)相似相容原理，此時(shí)花色苷溶解度最大，花色苷含量最大[16]。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%時(shí)，過高的乙醇使雜質(zhì)的溶出量增加，從而降低了花色苷的溶出量，進(jìn)而導(dǎo)致花色苷含量降低；此外，高體積分?jǐn)?shù)的乙醇會(huì)破壞花色苷的結(jié)構(gòu)[17]。故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%作為后續(xù)組合試驗(yàn)的因素水平。

由圖1中D可知，花色苷含量隨著料液比增加呈現(xiàn)先顯著增加后顯著降低的趨勢(shì)(P<0.05)。其原因是在萃取初期，隨著料液比增加，固液界面濃度梯度較大，有利于花色苷擴(kuò)散到溶液中。隨后如果繼續(xù)增加料液比，過多的溶劑會(huì)引起雜質(zhì)的溶解，從而降低花色苷的溶解度[18]。另外，過多的溶劑會(huì)增加對(duì)花色苷的分離純化難度。因此綜合考慮，選擇料液比1∶20、1∶30、1∶40 (g/mL)作為后續(xù)組合試驗(yàn)的因素水平。

2.2 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模型建立與顯著性檢驗(yàn)

采用響應(yīng)面優(yōu)化超高壓提取藍(lán)莓花色苷工藝參數(shù)，所得的試驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。以花色苷含量(Y)為響應(yīng)值，對(duì)試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到藍(lán)莓花色苷含量對(duì)提取壓力(X1)、保壓時(shí)間(X2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)和料液比(X4)的回歸方程，見公式(4)。

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

續(xù) 表

Y=4.80+0.036X1-0.043X2+0.10X3-0.14X4+0.022X1X2+0.025X1X3+0.040X1X4-0.028X2X3+0.035X2X4-0.018X3X4-0.58X12-0.32X22-0.12X32-0.22X42。

(4)

對(duì)回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 超高壓提取藍(lán)莓花色苷回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)報(bào)告Table 3 Significance test report of regression model coefficients of ultra-high pressure extraction of anthocyanins from blueberry

由表3可知，所得的回歸模型決定系數(shù)R2=0.9984，F(xiàn)值為642.13，P值小于0.0001，表明所得模型極顯著。該模型的失擬項(xiàng)P值=0.8842>0.05。上述數(shù)據(jù)分析表明該模型對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合充分，可靠性較好。利用該模型可較好地描述各試驗(yàn)因素與響應(yīng)值的真實(shí)關(guān)系，并且利用該模型可以優(yōu)化超高壓提取藍(lán)莓花色苷的最佳工藝條件。

依據(jù)F值大小可以判斷各試驗(yàn)因素對(duì)花色苷含量影響的程度，F(xiàn)值越大，表明該試驗(yàn)因素對(duì)提取效果的影響越顯著。由表3可知，F(xiàn)(X1)=46.68、F(X2)=68.26、F(X3)=363.51和F(X4)=738.14，即各試驗(yàn)因素對(duì)藍(lán)莓花色苷含量的影響大小為料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>保壓時(shí)間>提取壓力，且4個(gè)因素對(duì)花色苷含量的影響均達(dá)到極顯著的水平。

采用響應(yīng)面的坡度陡峭程度來衡量試驗(yàn)因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響強(qiáng)弱，響應(yīng)曲面相對(duì)平緩，說明該因素交互作用對(duì)花色苷含量影響作用較小。各試驗(yàn)因素交互作用對(duì)藍(lán)莓花色苷含量的影響見圖2。

圖2 各試驗(yàn)因素對(duì)藍(lán)莓花色苷含量的交互影響Fig.2 Interaction effects of experimental factors on the yield of anthocyanins from blueberry

由表3中方差分析的結(jié)果可知，X1X4、X2X4和X2X3極顯著影響花色苷含量(P<0.01)；X1X3和X1X2顯著影響花色苷含量(P<0.05)；X3X4對(duì)花色苷含量的影響不顯著(P>0.05)。由圖2中A，B和C可知，隨著提取壓力增加，花色苷含量呈先顯著增加后顯著降低的趨勢(shì)，當(dāng)提取壓力在175～225 MPa范圍內(nèi)，花色苷含量取得極大值。由圖2中A，D和E可知，花色苷含量隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先顯著增加后顯著降低的趨勢(shì)，當(dāng)保壓時(shí)間在5～7 min范圍內(nèi)，花色苷含量取得極大值。由圖2中B，D和F可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷含量的變化趨勢(shì)較平緩。由圖2中C，E和F可知，隨著料液比增加，花色苷含量呈現(xiàn)先顯著增加后顯著降低的趨勢(shì)，當(dāng)料液比在1∶25～1∶35(g/mL)范圍內(nèi)，花色苷含量取得極大值。綜上可知，各因素交互作用對(duì)藍(lán)莓花色苷含量影響順序?yàn)閄1X4>X2X4>X2X3>X1X3>X1X2>X3X4。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design Expert軟件對(duì)公式(4)的回歸方程進(jìn)行分析，得到最佳提取條件：提取壓力187.28 MPa、保壓時(shí)間5.91 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)56.75%、料液比1∶29.35 (g/mL)，花色苷含量的理論值為5.02 mg/g，為驗(yàn)證該方法的可靠性，考慮實(shí)際情況，將最佳工藝參數(shù)修正為：提取壓力187 MPa、保壓時(shí)間6 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)57%、料液比1∶29 (g/mL)，在此條件下進(jìn)行超高壓提取藍(lán)莓花色苷的驗(yàn)證試驗(yàn)，所得花色苷含量的試驗(yàn)值為(5.16±0.12) mg/g，理論值和試驗(yàn)值相對(duì)誤差為2.79%。說明模型可以較好地模擬和預(yù)測(cè)超高壓提取藍(lán)莓花色苷含量，也進(jìn)一步證明了采用響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓提取藍(lán)莓花色苷提取參數(shù)的可行性。

2.3 藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

不同濃度藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的劑量效應(yīng)Fig.3 Dose effect of blueberry anthocyanin extracts on inhibition of HepG2 cells’ growth注：不同小寫、大寫字母分別表示不同樣品間、不同劑量差異顯著(P<0.05)。

由圖3可知，在24，48，72 h后，HepG2細(xì)胞存活率均隨著藍(lán)莓花色苷提取物濃度增加呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)(P<0.05)。當(dāng)藍(lán)莓花色苷提取物濃度在50 μg/mL時(shí)，處理24，48，72 h后，HepG2細(xì)胞存活率分別為(95.35±1.59)%、(90.18±2.36)%、(88.83±3.04)%；當(dāng)藍(lán)莓花色苷提取物濃度在200 μg/mL時(shí)，處理24，48，72 h后，HepG2細(xì)胞存活率分別為(65.27±1.62)%、(48.19±1.96)%、(47.18±2.34)%，在24，48，72 h后，后者較前者HepG2細(xì)胞存活率分別降低了31.55%、46.56%、46.89%。

結(jié)果表明，藍(lán)莓花色苷提取物能顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖，且濃度越大，抑制效果越顯著，表現(xiàn)出顯著的劑量效應(yīng)。當(dāng)藍(lán)莓花色苷提取物濃度一定時(shí)，24 h后HepG2細(xì)胞存活率顯著高于48 h和72 h(P<0.05)，而48 h和72 h后，HepG2細(xì)胞存活率無顯著差別(P>0.05)，因此，后續(xù)試驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)選擇48 h。

2.4 倒置顯微鏡觀察藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

不同質(zhì)量濃度藍(lán)莓花色苷提取物(0，50，100，200 μg/mL)作用48 h后HepG2細(xì)胞形態(tài)變化結(jié)果見圖4。

圖4 不同質(zhì)量濃度的藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Fig.4 Effects of blueberry anthocyanin extracts with different concentration on morphology of HepG2 cells

由圖4可知，當(dāng)藍(lán)莓花色苷提取物濃度為0 μg/mL時(shí)，細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞緊密相連，細(xì)胞數(shù)目較多。當(dāng)采用藍(lán)莓花色苷提取物干預(yù)HepG2細(xì)胞時(shí)，隨著藍(lán)莓花色苷提取物濃度增加，HepG2細(xì)胞數(shù)目顯著降低，且細(xì)胞體積減小，大多數(shù)細(xì)胞由開始的菱形變成橢圓形，同時(shí)伴隨凋亡小體的產(chǎn)生。

2.5 藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

不同質(zhì)量濃度藍(lán)莓花色苷提取物(0，50，100，200 μg/mL)干預(yù)HepG2細(xì)胞48 h后癌細(xì)胞凋亡情況見圖5。

圖5 藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of blueberry anthocyanin extracts on apoptosis of HepG2 cells注：A為流式檢測(cè)藍(lán)莓花色苷提取物處理HepG2細(xì)胞48 h凋亡；B為流式檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析。

目前，大量的研究已經(jīng)證實(shí)藍(lán)莓花色苷提取物具有顯著的抗氧化能力[19]，同時(shí)又能顯著抑制癌細(xì)胞的增殖，加速癌細(xì)胞的凋亡[20]。因此，本試驗(yàn)在MTT的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響。由圖5可知，當(dāng)藍(lán)莓花色苷提取物濃度為50，100，200 μg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞凋亡率分別為(5.76±0.43)%、(28.60±0.81)%和(40.40±1.27)%。結(jié)果表明，藍(lán)莓花色苷提取物能顯著提高HepG2細(xì)胞凋亡率，且藍(lán)莓花色苷提取物濃度越大，HepG2細(xì)胞凋亡率越高，呈劑量效應(yīng)。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法對(duì)藍(lán)莓花色苷超高壓提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確立最優(yōu)的工藝參數(shù)組合為：提取壓力187 MPa、保壓時(shí)間6 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)57%、料液比1∶29 (g/mL)，在此條件下花色苷含量為(5.16±0.12) mg/g。體外抗腫瘤活性表明藍(lán)莓花色苷提取物能顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖，加速其凋亡。本研究結(jié)果為天然色素的快速提取提供了一種有效的手段，同時(shí)為開發(fā)功能性的食品添加劑提供了理論基礎(chǔ)。