新鮮周期不同精子來源對(duì)子代先天性心臟缺陷風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列研究的meta分析

劉巧媛

【摘要】 目的 ?評(píng)價(jià)輔助生殖技術(shù)（ART）對(duì)子代先天性心臟缺陷（CHD）發(fā)生的影響。 方法 ?計(jì)算機(jī)檢索Cochrane Library、PubMed、EMbase、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)、維普和萬方，檢索時(shí)間從建庫至2017年12月，并輔助其他檢索方式，納入開展新鮮周期下體外受精（IVF）和卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）和卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）助孕妊娠后子代先天性心臟缺陷（CHD）狀況比較的隊(duì)列研究，進(jìn)行方法學(xué)的質(zhì)量評(píng)估，使用RevMan 5.3進(jìn)行Meta分析，并根據(jù)異質(zhì)性進(jìn)行敏感性分析和發(fā)表偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。 結(jié)果 ?共納入7個(gè)高質(zhì)量隊(duì)列研究，分別來自法國、丹麥、中國、瑞典和挪威，出生兒共61997例。Meta分析結(jié)果顯示：（1）新鮮移植周期ICSI組子代CHD發(fā)生率顯著高于IVF組，OR=2.07[95%CI（1.28，3.37）] （P<0.05）。（2） 新鮮周期下附睪睪丸來源精子組對(duì)比ICSI組子代CHD發(fā)生率比較無顯著性差異，OR=0.73[95%CI（0.36，1.45）]（P>0.05）。（3）新鮮周期睪丸來源精子組相比睪丸附睪來源精子組子代CHD發(fā)生率比較無顯著性差異，OR=0.85[95%CI（0.2，3.71）]（P>0.05） 。 結(jié)論 新鮮周期中ICSI助孕子代CHD的發(fā)生率明顯高于IVF助孕，新鮮周期下附睪睪丸來源精子組對(duì)比ICSI組沒有增加先心病風(fēng)險(xiǎn)，睪丸來源精子相比睪丸附睪來源精子不增加先心病風(fēng)險(xiǎn)。提示不同來源的精子可能不是造成新鮮周期下ICSI組對(duì)比IVF組子代先天性心臟病風(fēng)險(xiǎn)較高的原因，但尚需更進(jìn)一步的研究加以分析探討。

【關(guān)鍵詞】卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）;睪丸穿刺取精術(shù)（TESA）;附睪穿刺取精術(shù)（PESA）;先天性心臟缺陷（CHD）;隊(duì)列研究;Meta

自1978年7月25日首例試管嬰兒在英國誕生后，輔助生殖技術(shù)（ART）為越來越多的不孕不育患者解決了生育問題，全世界已有超過540萬兒童在ART后出生。然而其安全性仍存在爭(zhēng)議，其出生子代的出生缺陷問題引起越來越多人關(guān)注。先天性心臟缺陷（CHD）是最常見的出生缺陷，我國CHD的發(fā)生率高達(dá)14.2‰，且呈逐年上升趨勢(shì)。有Meta分析研究表明ART子代CHD風(fēng)險(xiǎn)高于自然受孕的子代[1]。但是缺少針對(duì)不同ART對(duì)CHD影響的系統(tǒng)Meta分析。本研究采用Meta分析的方法比較新鮮周期下ICSI和IVF對(duì)子代CHD的影響，探討其中不同精子來源對(duì)子代CHD的影響，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)ART的子代安全性和促進(jìn)優(yōu)生優(yōu)育提供一定參考。

資料與方法

一、檢索策略

通過計(jì)算機(jī)檢索Cochrane Library、PubMed、Medline、EMbase等外文數(shù)據(jù)庫以及維普（VIP）、中國知網(wǎng)（CNKI）、萬方等國內(nèi)數(shù)據(jù)庫，檢索時(shí)間從建庫至2017年12月，并通過人工閱讀檢索參考文獻(xiàn)以避免文獻(xiàn)漏檢。發(fā)表研究的語言限制為中文和英文。英文檢索式以PubMed為例：#1：MeSH“assisted reproductive technology”[Title/Abstract];#2：MeSH“congenital malformations”[Title/Abstract];#3：MeSH“cohort studies”，結(jié)果：#1 And #2 And #3。所有檢索采用主題詞[MEDLINE （MeSH），EMbase （EMTREE）]與自由詞相結(jié)合的方式，所有檢索策略通過多次預(yù)檢索后確定。檢索對(duì)象限制為人類，文獻(xiàn)類型限于隊(duì)列研究（cohort studies）或病例對(duì)照（case-control studies）研究。

二、文獻(xiàn)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入所有ART與子代CHD關(guān)系的隊(duì)列研究，語種限于中英文，未限人群。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）采用隊(duì)列研究設(shè)計(jì);（2）暴露因素為接受IVF或ICSI治療并新鮮周期移植;（3）研究對(duì)象為接受IVF或ICSI治療并新鮮周期移植后出生的嬰兒;（4）觀察終點(diǎn)為出生時(shí)所有類型CHD。

文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）同人群重復(fù)研究;（2）CHD患者接受ART治療的研究;（3）ART與其他出生缺陷的相關(guān)研究;（4）重要資料報(bào)告不全且聯(lián)系作者未回復(fù)者。

三、研究質(zhì)量評(píng)價(jià)

采用Newcastle-Ottawa scale （NOS）量表對(duì)入選文獻(xiàn)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)價(jià)內(nèi)容包括：（1）暴露隊(duì)列的代表性：①能夠很真實(shí)地代表社區(qū)人群的平均或基本可以代表社區(qū)人群的平均 （1分）;②選取特殊人群或沒有說明隊(duì)列的來源（0分）。（2）非暴露隊(duì)列的選擇：①來自暴露隊(duì)列的同一社區(qū)（1分）;②與暴露隊(duì)列的來源不同或沒有說明非暴露隊(duì)列的來源（0分）。（3）暴露的確定：①可靠的記錄或結(jié)構(gòu)化調(diào)查（1分）;②書面的自我報(bào)告或無描述（0分）。（4）研究開始前沒有研究對(duì)象發(fā)生結(jié)局事件（1分）。（5）可比性：①研究控制了最重要的因素（1分）;②控制了其他重要的混雜因素（1分）。（6）結(jié)局事件的評(píng)估：①獨(dú)立的、盲法的評(píng)估或鑒定或聯(lián)動(dòng)數(shù)據(jù)（1分）;②自我報(bào)告或無描述（0分）。（7）為觀察到結(jié)局發(fā)生，隨訪充分（1分）。（8）隨訪的完整性：全部隨訪或少數(shù)失訪或?qū)κгL進(jìn)行了描述（1分）。

四、資料提取

由3位研究者按照納入與排除標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立篩選文獻(xiàn)，采用事先設(shè)計(jì)的資料提取表提取信息，包括研究項(xiàng)目時(shí)間、地點(diǎn)，納入者的一般特征，接受ART類型，結(jié)局類型與隨訪時(shí)間，并逐一交叉核對(duì)。如存在分歧，則通過討論解決;如研究報(bào)告的資料不全，則進(jìn)一步與該研究作者聯(lián)系獲取，若最終未獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，則剔除該項(xiàng)研究。

五、數(shù)據(jù)分析

采用Cochrane協(xié)作網(wǎng)提供的RevMan5.3統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)7篇最終納入研究的文獻(xiàn)進(jìn)行Meta 分析，并根據(jù)周期類型及CHD類型進(jìn)行亞組分析。首先采用Cochrane Q檢驗(yàn)及I2檢驗(yàn)對(duì)研究間異質(zhì)性進(jìn)行檢驗(yàn)，若P≥0.1說明研究間同質(zhì)性較好，反之則具有異質(zhì)性;根據(jù)I2值進(jìn)一步按照25%、50%、75%將異質(zhì)性劃分為低、中、高3個(gè)等級(jí)。若研究間同質(zhì)性較好，則采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并，反之則選擇隨機(jī)效應(yīng)模型，并對(duì)其異質(zhì)性來源進(jìn)行分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)可能出現(xiàn)的異質(zhì)性因素進(jìn)行亞組分析，并采用敏感性分析來分析檢驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。同時(shí)采用漏斗圖判斷發(fā)表偏倚。

結(jié) ?果

一、文獻(xiàn)檢索結(jié)果

初檢相關(guān)文獻(xiàn)1 039篇，其中英文942篇，中文97篇。經(jīng)過剔除重復(fù)文獻(xiàn)并閱讀文題和摘要后剔除明顯不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的805篇，然后通過閱讀全文，進(jìn)一步排除不符合納入標(biāo)準(zhǔn)及無法提取數(shù)據(jù)的研究227篇，最終納入7篇隊(duì)列研究[2-8]進(jìn)行Meta分析，出生兒共61997例。其中4篇[3， 6-8]對(duì)不同來源的精子做了細(xì)分。文獻(xiàn)篩選流程見圖1。

二、納入研究的基本特征

納入研究包括7篇研究[2-8]不同ART與CHD關(guān)系的英文文獻(xiàn)，其中4篇[3， 6-8]研究了不同來源精子與CHD的關(guān)系。納入的7篇研究均為隊(duì)列研究，其中2篇[5， 7]為前瞻性隊(duì)列研究，5篇為回顧性隊(duì)列研究。各研究特征見表1。

三、納入研究的方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)

由3位研究員獨(dú)立進(jìn)行文獻(xiàn)檢索并提取資料。篩選研究的方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)采用 Newcastle-Ottawa scale（NOS）量表[5，7]進(jìn)行評(píng)估，具體包括研究人群選擇、可比性、結(jié)果評(píng)價(jià)3個(gè)部分共8個(gè)條目。采用星級(jí)系統(tǒng)的半量化原則，滿分為9顆星（9分），7篇研究質(zhì)量評(píng)分≥8分，均為高質(zhì)量隊(duì)列研究?；祀s因素設(shè)定為女方年齡、病因、不孕年限、多胎妊娠等。各研究質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果見表2。

四、Meta分析結(jié)果

1. 新鮮周期下IVF和ICSI對(duì)子代CHD發(fā)生的影響：對(duì)其中3項(xiàng)包括新鮮周期下IVF和ICSI對(duì)CHD風(fēng)險(xiǎn)的影響隊(duì)列研究[2， 4， 5]進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)I=0%且P=0.99，表明納入的3項(xiàng)研究無異質(zhì)性，采用固定效應(yīng)模型。Meta分析結(jié)果如圖3，OR=2.07[95%CI（1.28，3.37）]且Z=2.35（P=0.003），提示新鮮周期時(shí)ICSI組比IVF組子代有更高的CHD發(fā)生率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2. ?新鮮周期不同精子來源對(duì)先天性心臟病風(fēng)險(xiǎn)的影響

通過對(duì)2篇研究[3， 7]新鮮周期下附睪睪丸來源精子組對(duì)比ICSI組對(duì)子代先天性心臟病影響的隊(duì)列研究進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)I=0且P=0.35表明無異質(zhì)性，所以應(yīng)用固定效應(yīng)模型，OR值為0.73（0.36，1.45）且Z=0.91（P=0.36）說明兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明新鮮周期下附睪睪丸來源精子組對(duì)比ICSI組沒有增加先心病風(fēng)險(xiǎn)。

通過對(duì)2篇[6， 8]新鮮周期睪丸來源精子組相比睪丸附睪來源精子組對(duì)先天性心臟病影響的高質(zhì)量隊(duì)列研究進(jìn)行異質(zhì)性分析I=0且P=0.76（P>0.1）提示無異質(zhì)性，用固定效應(yīng)模型，OR=0.85（0.2，3.71）且Z=0.21（P=0.83）提示兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，睪丸來源精子相比睪丸附睪來源精子不增加先心病風(fēng)險(xiǎn)。

五、發(fā)表偏倚分析

采用RevMan5.2軟件繪制7項(xiàng)研究的漏斗圖。圖形顯示，左右對(duì)稱且呈倒漏斗形，提示不存在發(fā)表偏倚（圖5）。

2.5 發(fā)表偏倚

討 ?論

本Meta分析納入了7篇[2-8]關(guān)于不同ART對(duì)CHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的隊(duì)列研究，其中有4篇[3， 6-8]涉及不同精子來源的隊(duì)列研究，分別來自法國、丹麥、中國、瑞典和挪威，出生兒共61997例。我們通過對(duì)新鮮周期下ICSI與IVF的隊(duì)列研究進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)新鮮周期中ICSI組比IVF組子代CHD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著提高OR=2.07[95%CI（1.28，3.37）]（P<0.05）。相比IVF，ICSI主要適用于男性因素不育。男性不育往往伴有較高的精子染色體異常率。畸形精子癥的精子有較高的DNA斷裂率。少弱精伴有基因異常引起胚胎致死性。少畸形精子伴有染色質(zhì)及DNA異常及高水平甲基化。嚴(yán)重男性因素可導(dǎo)致胚胎染色體異常幾率升高。且有文獻(xiàn)報(bào)道男性遺傳缺陷的傳遞無法被囊胚培養(yǎng)阻斷[9]。相比對(duì)照組梗阻性與非梗阻性無精子癥患者胚胎PGS結(jié)果顯示非整倍體率均大大增高。精子染色體異常與DNA斷裂與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)。DNA斷裂與胚胎質(zhì)量顯著相關(guān)。同時(shí)男性不育不但與染色體的“量”異常相關(guān)，還與染色體“質(zhì)”異常相關(guān)。由于男性不孕患者伴有較高的Y染色體微缺失， ICSI治療后的男性后代出現(xiàn)Y染色體微缺失率相對(duì)較高。

然而我們對(duì)新鮮周期下不同精子來源的隊(duì)列研究進(jìn)行了進(jìn)一步的亞組分析，發(fā)現(xiàn)新鮮周期下下附睪睪丸來源精子組對(duì)比ICSI組沒有增加先心病風(fēng)險(xiǎn)（P>0.05），且睪丸來源精子相比睪丸附睪來源精子也不增加先心病風(fēng)險(xiǎn)（P>0.05），提示不同來源的精子可能不是造成新鮮周期下ICSI組對(duì)比IVF組子代先天性心臟病風(fēng)險(xiǎn)較高的原因。這與早前前瞻性研究中相似[10]，即不同來源的精子的新生兒出生缺陷率沒有差異。同樣許多研究[3， 6， 11-13]表明，無論睪丸或附睪來源的精子ICSI后其結(jié)局并沒有明顯的差異，且與正常射出精子ICSI相比的妊娠率等結(jié)局也無顯著差異。在ICSI周期中男性因素不影響高質(zhì)量囊胚形成率與妊娠率。

相比射精對(duì)照組，睪丸來源精子在生成的胚胎的兩組在受精后胚胎發(fā)育早期有差異，但從5細(xì)胞后差異不明顯且活產(chǎn)率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2016年的meta分析表明睪丸精子組和射精組兩組間的受精率無顯著差異[14]。睪丸精子組與射精組流產(chǎn)率無顯著差異[15]。另一篇2018年的meta分析顯示優(yōu)胚率， 著床率和妊娠率方面，睪丸精子ICSI優(yōu)于射精子ICSI[16]。同樣，另一篇在對(duì)精子DNA片段化水平高的男性進(jìn)行ICSI的系統(tǒng)回顧中，相對(duì)射精組，睪丸組流產(chǎn)率低且?guī)П肼矢遊17]。這可能是由于氧化應(yīng)激作用，睪丸組的DNA斷裂率比射精組要低得多。而低DNA斷裂率證明與與高抱嬰率與低流產(chǎn)率相關(guān)。有研究建議DNA斷裂和少弱精癥及反復(fù)IVF失敗的病人采取TESA更佳[18]。但是DNA斷裂是否與先天性畸形相關(guān)尚不清楚。

我們推測(cè)新鮮周期下ICSI增加先天性心臟病風(fēng)險(xiǎn)可能與受精方式本身相關(guān)。并且與IVF相比，ICSI繞過了卵母細(xì)胞對(duì)精子的自然選擇的屏障，可能會(huì)使質(zhì)量差的精子受精，將某種基因缺陷和高遺傳風(fēng)險(xiǎn)的基因傳給下一代，從而增加了后代出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)。ICSI的過程中體外培養(yǎng)會(huì)使精子活動(dòng)力的減低并伴有DNA的斷裂和基因印記的改變。有研究[19] 發(fā)現(xiàn)相比IVF組，ICSI組的胚胎染色體畸變率高，且與精子培養(yǎng)環(huán)境和精子孵育時(shí)間密切相關(guān)。與常規(guī)的IVF過程相比，單精子胞漿注射技術(shù)增加了對(duì)于卵母細(xì)胞內(nèi)的顯微有創(chuàng)操作，因此ICSI操作過程中也可能存在對(duì)卵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)的機(jī)械性損傷，導(dǎo)致受精異常、染色體非整倍性和胚胎發(fā)育異常。而這些非整倍體胚胎可發(fā)育到囊胚。在注射過程中，頂體膜和酶經(jīng)常與精子一起注射到卵母細(xì)胞中，然而，在傳統(tǒng)的受精過程中，它們從不穿透卵母細(xì)胞的質(zhì)膜，大量頂體酶干擾受精的進(jìn)程。因此ICSI被認(rèn)為可增加染色體數(shù)目異常發(fā)生的概率。ICSI治療后的男性后代出現(xiàn)Y染色體缺失及染色體核型異常發(fā)生率相對(duì)較高，包括22q11.2缺失，18號(hào)染色體異常等。

而染色體改變和基因異常等遺傳因素是CHD的危險(xiǎn)因素。22q11.2微缺失被認(rèn)為與嚴(yán)重主動(dòng)脈肺動(dòng)脈側(cè)支動(dòng)脈、PDA、肺動(dòng)脈閉鎖和VSD等主要CHD發(fā)病有關(guān)。GATA4等基因的突變、拷貝數(shù)變異、多態(tài)性和甲基化常都可引起心臟畸形，其中心臟特異轉(zhuǎn)錄因子基因TBX5、GATA4等異?？蓪?dǎo)致如ASD、VSD、PDA、TOF、心內(nèi)膜墊缺損及右心室發(fā)育不良等許多遺傳性和單發(fā)CHD。多種miRNAs、cirRNAs和lncRNAs的表達(dá)調(diào)控異常也逐漸被發(fā)現(xiàn)與CHD相關(guān)。ICSI有創(chuàng)的受精方式和配子較高的低質(zhì)量率所帶來的胚胎染色體及基因異常率增加，可能與ICSI組子代較高的CHD發(fā)生率有關(guān)。

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