沙糖橘S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因克隆及表達(dá)分析

唐文武 吳秀蘭

摘要：【目的】克隆沙糖橘S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因（CrSAMDC），并明確其在不同組織和干旱脅迫下的表達(dá)特征，為開(kāi)展SAMDC基因分子機(jī)理研究提供理論依據(jù)，同時(shí)為柑橘抗逆分子育種提供候選基因。【方法】以6年生沙糖橘為材料，利用RT-PCR克隆CrSAMDC基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CrSAMDC基因在不同組織和干旱脅迫下的表達(dá)譜，并開(kāi)展原核誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)及Southern雜交分析?！窘Y(jié)果】從沙糖橘嫩葉克隆獲得的CrSAMDC基因cDNA序列全長(zhǎng)1736 bp，含有1個(gè)1131 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼376個(gè)氨基酸殘基;CrSAMDC蛋白相對(duì)分子量為40.69 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.27，為親水性蛋白，其二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，分別占32.98%和42.02%，β-轉(zhuǎn)角僅占6.91%，延伸鏈占18.09%;與克里曼丁橘（Citrus clementina，XP_024047984.1）和甜橙（C. sinensis，KDO62315.1）的SAMDC蛋白親緣關(guān)系較近，其氨基酸序列同源性分別為99.5%和97.3%;具有LSE-SSLF的酶原剪切位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域及與SAMDC蛋白降解相關(guān)的PEST結(jié)構(gòu)域（TVHITPED-GFSYASYE）。CrSAMDC基因在沙糖橘的葉、花、果肉和果皮中均有表達(dá)，且在分裂旺盛的嫩葉和花器官中高表達(dá);干旱脅迫下，CrSAMDC基因表達(dá)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，以干旱脅迫后24 h的相對(duì)表達(dá)量最高。CrSAMDC基因在沙糖橘基因組中以單拷貝形式存在，且通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體能成功誘導(dǎo)表達(dá)獲得CrSAMDC融合蛋白?！窘Y(jié)論】CrSAMDC基因在沙糖橘中的表達(dá)具有組織特異性，且以單拷貝存在，在干旱脅迫下呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，即參與干旱脅迫響應(yīng)的多胺代謝調(diào)控。

關(guān)鍵詞： 沙糖橘;CrSAMDC基因;多胺;干旱脅迫;原核表達(dá);Southern雜交

Abstract：【Objective】The S-adenosylmethionine decarboxylase gene（CrSAMDC） was cloned from Shatangju， and the expression characteristics of the CrSAMDC gene was analyzed in different tissues and under drought stress. This provided basis for further molecular mechanism of SAMDC gene and provided candidate genes for Citrus stress resistant molecular breeding. 【Method】CrSAMDC gene was cloned by using reverse transcriptional PCR（RT-PCR） with six-year Sha-tangju as materials. Bioinformatics was conducted as well. Real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR） method was adopted to study the expressions of CrSAMDC gene in different tissues and under drought stress. Prokaryotic induction exogenous protein expression and Southern blot analysis were conducted. 【Result】The cDNA full-length sequence of CrSAMDC gene cloned fron Shatangju new leaves was 1736 bp， with an open reading frame（ORF） of 1131 bp， encoding 376 amino acids. CrSAMDC protein relative molecular weight was 40.69 kD， theoretical isoelectric point（pI） was 5.27. It was a hydrophilic protein. Its secondary structure was mainly consisted of α-helix（32.98%） and random coil（42.02%）， β-turn only accounted for 6.91%， and extended chain accounted for 18.09%. It had the close genetic relationship with SAMDC protein of Citrus clementina（XP_024047984.1） and C. sinensis（KDO62315.1）， their amino acid sequence homology were 99.5% and 97.3%.? It had LSE-SSLF prozyme cleavage site domain and PEST domains related to SAMDC protein degradation（TVHITPED-GFSYASYE）.? CrSAMDC gene was expressed in leaves， flowers， flesh and peel of Shatangju， and was highly expressed in young leaves and flowers with vigorous division. Under drought stress， the expression level of CrSAMDC gene first increased and then decreased， and the highest expression level was reached at 24 h.? CrSAMDC gene exists as a single copy， and CrSAMDC fusion protein could be obtained through induction of prokaryotic expression vector. 【Conclusion】The expression of CrSAMDC gene in Shatangju has tissue specificity， and exists as single copy. It up-regulates its expression under drought stress， which means that involves in the regulation of polyamine metabolism in response to drought stress.

Key words： Shatangju; CrSAMDC gene; polyamine; drought stress; prototypical expression; Southern blot analysis

0 引言

【研究意義】多胺在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和緩解逆境脅迫等方面發(fā)揮重要作用，S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（S-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC）作為多胺合成的關(guān)鍵限速酶，主要參與植物防御干旱脅迫的調(diào)控過(guò)程（郝愛(ài)平和王婷婷，2014;Wi et al.，2014）。沙糖橘是我國(guó)南方主栽的柑橘品種，多種植于丘陵山地等干旱缺水地區(qū)，易受干旱和低溫等氣候影響及病蟲(chóng)害威脅，尤其是近年來(lái)全球氣候變暖，導(dǎo)致持續(xù)高溫干旱和缺乏降雨等異常氣候頻發(fā)，對(duì)我國(guó)柑橘生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響（王靜，2009;李果果等，2018）。因此，開(kāi)展沙糖橘SAMDC基因克隆及表達(dá)分析，對(duì)研究柑橘的抗逆分子機(jī)理及遺傳改良具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】多胺是由兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基組成具有促進(jìn)細(xì)胞分裂分化的低分子脂肪族含氮堿，在生物體內(nèi)廣泛分布，具有刺激生長(zhǎng)和延緩衰老的作用（張雪梅等，2012）。植物中的多胺主要以腐胺（Putrescine，Put）、尸胺（Cadavarine，Cad）和亞精胺（Spermidine，Spd）等形式存在，在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性、形態(tài)建成及延緩衰老等方面發(fā)揮重要作用（Bouchereau et al.，1999;趙維峰等，2004;Alcázar et al.，2006;Groppa and Benavides，2008）。SAMDC作為精胺和亞精胺合成過(guò)程的限速脫羧酶，能催化S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）脫羧并形成氨丙基，然后在精胺合成酶（Spermine synthase，SPMS）催化作用下，提供的氨丙基與腐胺反應(yīng)生成精胺;或在亞精胺合成酶（Spermidine synthase，SPDS）作用下，氨丙基與腐胺反應(yīng)生成亞精胺（Kakkar et al.，2000;李亞棟和何近剛，2012）。目前，已在馬鈴薯（Mad Arif et al.，1994）、曼陀羅（Torrigiani et al.，2005）、番茄（Sinha and Rajam，2013）、甘蔗（文樂(lè)等，2015）、胡蘿卜（王廣龍等，2017）、陸地棉（梁其干等，2019）和白菜（唐文武和吳秀蘭，2019）等多種植物中分離獲得SAMDC，其作為限速酶調(diào)控著植物體內(nèi)多胺的合成，在植物的抗逆境脅迫、細(xì)胞分裂分化、種子萌發(fā)及花果發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮重要作用（Minocha et al.，2014）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】沙糖橘是我國(guó)南方地區(qū)重要的柑橘品種，但至今有關(guān)沙糖橘SAMDC基因（CrSAMDC）的克隆及其功能研究尚無(wú)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以無(wú)籽沙糖橘為材料，利用RT-PCR克隆CrSAMDC基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CrSAMDC基因在不同組織和干旱脅迫下的表達(dá)譜，并開(kāi)展原核誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)及Southern雜交分析，以期為開(kāi)展SAMDC基因分子機(jī)理研究提供理論依據(jù)，同時(shí)為柑橘抗逆分子育種提供候選基因。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為廣東地區(qū)種植的無(wú)籽沙糖橘品種，由肇慶市四會(huì)果園提供。選擇生長(zhǎng)旺盛的6年生沙糖橘果樹(shù)，在不同時(shí)期摘取其嫩葉（春梢期）、老葉（越冬期）、花（花芽期）、30 d幼果果肉和30 d幼果果皮，每3株果樹(shù)為1個(gè)重復(fù)，共設(shè)3個(gè)重復(fù)，所有材料取樣后置于-80 ℃冰箱保存，用于總RNA提取。干旱脅迫處理時(shí)，采集6年生沙糖橘果樹(shù)上的新發(fā)秋梢，再以10% PEG-6000對(duì)其進(jìn)行模擬干旱脅迫，脅迫時(shí)間分別設(shè)為3、6、9、12、24和36 h，以0 h為對(duì)照，設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1. 2 CrSAMDC基因克隆

1. 2. 1 葉片總RNA提取及cDNA第一鏈合成 取6年生無(wú)籽沙糖橘果樹(shù)的嫩葉，采用RNAout試劑盒（北京天恩澤基因科技有限公司）提取其總RNA，并以DNaseⅠ（TaKaRa公司）進(jìn)行消化。采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Life technology公司）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1. 2. 2 引物序列設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 根據(jù)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)已公布的甜橙（Citrus sinensis）SAMDC基因序列（Gene ID：Cs4g02260）設(shè)計(jì)并篩選出1對(duì)PCR引物CrSAMDC-F/CrSAMDC-R（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司廣州分公司合成。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板擴(kuò)增CrSAMDC基因cDNA序列，PCR反應(yīng)體系50.0 μL：Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL，10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 2.0 μL，CrSAMDC-F和CrSAMDC-R（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA模板（100 ng）2.0 μL，加ddH2O補(bǔ)充至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒（TaKaRa公司）回收純化目的片段。

1. 2. 3 CrSAMDC基因測(cè)序分析 將CrSAMDC基因與克隆載體pMD19-T連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、質(zhì)粒DNA提取及PCR鑒定后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 3 CrSAMDC蛋白生物信息學(xué)分析

利用NCBI對(duì)CrSAMDC基因cDNA序列進(jìn)行編碼蛋白搜索，并以BLAST進(jìn)行同源比對(duì)分析;采用ExPASy中的ProtParam進(jìn)行CrSAMDC蛋白理化性質(zhì)分析，使用ProtScale預(yù)測(cè)其親/疏水性;利用PredictProtein預(yù)測(cè)CrSAMDC蛋白功能結(jié)構(gòu)域;使用SWISS-MODEL進(jìn)行CrSAMDC蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);最后以DNAMAN和MEGA 7.0進(jìn)行蛋白序列多重比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1. 4 CrSAMDC基因在不同組織及干旱脅迫下的表達(dá)分析

根據(jù)CrSAMDC基因cDNA序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物QCrSAMDC-F/QCrSAMDC-R（表1），以柑橘ACTB基因?yàn)閮?nèi)參（Wu and Tang，2016），按SYBR熒光定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，并采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量（Livak and Schmittgen，2001）。

1. 5 CrSAMDC基因原核表達(dá)載體構(gòu)建及融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

設(shè)計(jì)含有EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)接頭的引物pET32CS-F/pET32CS-R（表1），然后擴(kuò)增攜帶有酶切位點(diǎn)的CrSAMDC基因。同時(shí)以EcoR I和Sal I雙酶切pET32a原核表達(dá)載體，并與攜帶酶切位點(diǎn)的Cr-SAMDC基因進(jìn)行大片段連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-CrSAMDC。經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板、雙酶切及測(cè)序等鑒定后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET32a-CrSAMDC轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）原核表達(dá)菌株中，以pET32a空載體為對(duì)照。將克隆菌株接種至含氨芐青霉素（Amp+）的LB培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后按1∶100比例再接種至LB培養(yǎng)基，37 ℃下?lián)u床（200 r/min）培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，加入1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1. 6 Southern雜交分析

采用CTAB法提取沙糖橘嫩葉基因組DNA（約10 μg），分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I、Sac I和Dra I在37 ℃下進(jìn)行酶切（約12 h），再以0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，具體操作參考Wu和Tang（2016）的方法。探針引物為Southern-F/Southern-R（表1），擴(kuò)增片段為597 pb，PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同1.2.2。

2 結(jié)果與分析

2. 1 CrSAMDC基因克隆及測(cè)序分析結(jié)果

以沙糖橘嫩葉總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用CrSAMDC-F/CrSAMDC-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得1條約1700 bp的清晰條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果顯示，CrSAMDC基因cDNA序列全長(zhǎng)1736 bp，含有1個(gè)1131 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼376個(gè)氨基酸殘基（圖2）。

2. 2 CrSAMDC蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果

利用ProtParam對(duì)CrSAMDC蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，CrSAMDC蛋白由376個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為40.69 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.27;其中，絲氨酸（Ser）含量最高，占13.3%，色氨酸（Trp）含量最低，僅占1.1%;正電荷氨基酸殘基[天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）]41個(gè)，占氨基酸總數(shù)的10.9%，負(fù)電荷氨基酸殘基[精氨酸（Arg）+賴氨酸（Lys）]31個(gè)，占氨基酸總數(shù)的8.2%。ProScale親/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CrSAMDC蛋白疏水性最強(qiáng)的是第73位亮氨酸（Leu），其分值為1.811;親水性最強(qiáng)的是第163位脯氨酸（Pro），其分值為-2.244;平均親水系數(shù)為-0.016，即CrSAMDC蛋白為親水性蛋白。CrSAMDC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，分別占32.98%和42.02%，β-轉(zhuǎn)角僅占6.91%，延伸鏈占18.09%。使用SWISS-MODEL對(duì)CrSAMDC蛋白進(jìn)行同源建模分析，結(jié)果（圖3）表明該蛋白與PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中人類(lèi)SAMDC S68A（1msv.1.A）的相似性為31.35%，全局模型質(zhì)量評(píng)估值（GMQE）為0.62。

利用MEGA 7.0中的鄰接法（Neighbour-joining，NJ）構(gòu)建基于SAMDC氨基酸序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖4）顯示，CrSAMDC蛋白與克里曼丁橘（C. clementina，XP_024047984.1）和甜橙（KDO62315.1）的SAMDC蛋白親緣關(guān)系較近，其氨基酸序列同源性分別為99.5%和97.3%;然后與阿月渾子（Pistacia vera，XP_031285063.1）、博落回（Macleaya cordata，OVA09485.1）、毛白楊（Populus trichocarpa，XP_002324514.2）和番木瓜（Carica papaya，XP_021902142.1）的SAMDC蛋白聚在同一分支上。歐洲栓皮櫟（Quercus suber，XP_023920228.1）、楊梅（Morella rubra，KAB1211990.1）和筍瓜（Cucurbita maxima，XP_022999703.1）的SAMDC蛋白則聚為另一分支。利用DNAMAN對(duì)上述物種的SAMDC蛋白進(jìn)行序列多重比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均含有LSE-SSLF的酶原剪切位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域，以及與SAMDC蛋白降解相關(guān)的PEST結(jié)構(gòu)域（TVHITPED-GFSYASYE），顯示出SAMDC蛋白功能結(jié)構(gòu)域的高度保守特征。

2. 3 CrSAMDC基因表達(dá)分析結(jié)果

選取6年生沙糖橘果樹(shù)的嫩葉、老葉、花、30 d幼果果肉和30 d幼果果皮等5個(gè)組織樣品，提取其總RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CrSAMDC基因的組織表達(dá)特性。由圖5可知，CrSAMDC基因在沙糖橘的葉、花、果肉和果皮中均有表達(dá)，但以嫩葉的相對(duì)表達(dá)量最高，其次為花，而30 d幼果果肉的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為嫩葉的14.5%。說(shuō)明CrSAMDC基因表達(dá)具有明顯的組織特異性，且在分裂旺盛的嫩葉和花器官中高表達(dá)。

為研究干旱脅迫下CrSAMDC基因的表達(dá)特性，采用10% PEG-6000對(duì)新發(fā)秋梢進(jìn)行模擬干旱脅迫處理，分別于脅迫處理后0、3、6、9、12、24和36 h取樣進(jìn)行檢測(cè)分析。由圖6可知，隨著干旱脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CrSAMDC基因的相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。以干旱脅迫后24 h的相對(duì)表達(dá)量最高，是對(duì)照處理的7.35倍。說(shuō)明沙糖橘在干旱脅迫下可通過(guò)調(diào)節(jié)CrSAMDC基因高效表達(dá)，促進(jìn)精胺和亞精胺等多胺合成，緩解干旱環(huán)境對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以維持沙糖橘正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

2. 4 Southern雜交分析結(jié)果

為明確CrSAMDC基因在沙糖橘基因組中的拷貝數(shù)目，而進(jìn)行Southern雜交分析，結(jié)果（圖7）顯示，采用探針上無(wú)酶切位點(diǎn)的EcoR I、BamH I和Sac I進(jìn)行酶切，Southern雜交僅檢測(cè)到1條條帶;而采用含有1個(gè)酶切位點(diǎn)的Dra I進(jìn)行酶切，Southern雜交檢測(cè)到2條條帶，說(shuō)明CrSAMDC基因在沙糖橘基因組中可能以單拷貝形式存在。

2. 5 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況

經(jīng)EcoR I和Sac I雙酶切鑒定及測(cè)序分析，可確認(rèn)pET32a-CrSAMDC為正確的重組質(zhì)粒。對(duì)含有重組質(zhì)粒pET32a-CrSAMDC的BL21（DE3）原核表達(dá)菌株進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，然后利用超聲波破碎細(xì)胞并離心，分別收集上清液和沉淀，以12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖8）顯示，在上清液中檢測(cè)到1條約61.0 kD的條帶，與預(yù)期的融合蛋白大小相符，而pET32a空載體在21.0 kD附近出現(xiàn)明顯的GST標(biāo)簽蛋白條帶，說(shuō)明CrSAMDC融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功，且主要以可溶性的形式存在。

3 討論

柑橘是熱帶亞熱帶地區(qū)多年生木本果樹(shù)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年全球柑橘收獲面積945.35萬(wàn)ha，收獲產(chǎn)量14645.90萬(wàn)t（張浩，2018）。我國(guó)柑橘種植面積258.72萬(wàn)ha，柑橘產(chǎn)量3816.78萬(wàn)t（田楠坤，2019）。我國(guó)柑橘主要種植在丘陵山地等露天旱地環(huán)境中，其生長(zhǎng)周期長(zhǎng)且受自然環(huán)境調(diào)控，易受干旱和低溫等氣候影響及病蟲(chóng)害威脅（王靜，2009）。多胺是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和緩解逆境脅迫的關(guān)鍵物質(zhì)，而SAMDC作為多胺合成的關(guān)鍵限速酶，可能參與植物應(yīng)對(duì)干旱及低溫等逆境脅迫的調(diào)控過(guò)程（Wi et al.，2014;劉長(zhǎng)命等，2019）。王靜（2009）研究發(fā)現(xiàn)，枳在低溫脅迫下其SAMDC基因被誘導(dǎo)表達(dá)，且低溫脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，SAMDC基因表達(dá)量越高。王廣龍等（2017）在胡蘿卜中克隆獲得SAMDC基因，并證實(shí)其在高溫、低溫、干旱及鹽漬等逆境脅迫下高表達(dá)，在胡蘿卜抗逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。本研究從沙糖橘中克隆獲得CrSAMDC基因，其cDNA序列全長(zhǎng)1736 bp，編碼376個(gè)氨基酸殘基，與擬南芥、胡蘿卜等雙子葉植物的SAMDC蛋白氨基酸殘基數(shù)目相近（王廣龍等，2017），與克里曼丁橘和甜橙的SAMDC蛋白親緣關(guān)系最近，其氨基酸序列同源性分別為99.5%和97.3%;CrSAMDC蛋白含有高度保守的酶原剪切位點(diǎn)LSE-SSLF及與SAMDC蛋白降解相關(guān)PEST結(jié)構(gòu)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，CrSAMDC基因在沙糖橘各組織中均有表達(dá)，但其表達(dá)量具有明顯的組織特異性，以在分裂旺盛的嫩葉和花器官中表達(dá)量較高，與SAMDC基因在馬鈴薯（Mad Arif et al.，1994）、胡蘿卜（王廣龍等，2017）、甘蔗（劉金仙等，2010）等作物中的表達(dá)分布相似。

在干旱脅迫下，植物可通過(guò)上調(diào)SAMDC基因表達(dá)水平，以提高體內(nèi)多胺含量而增強(qiáng)抗氧化能力，進(jìn)而提高植株的抗旱性（Wi et al.，2014;文樂(lè)等，2015）。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫下CrSAMDC基因表達(dá)水平呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，以干旱脅迫后24 h的表達(dá)量最高，即干旱脅迫會(huì)誘導(dǎo)CrSAMDC基因高水平表達(dá)，因此推測(cè)沙糖橘可能通過(guò)合成多胺來(lái)緩解干旱環(huán)境對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響，說(shuō)明CrSAMDC基因參與干旱脅迫響應(yīng)的代謝調(diào)控過(guò)程。Southern雜交分析的結(jié)果表明，CrSAMDC基因在沙糖橘基因組中可能含有1個(gè)拷貝數(shù)，與紐荷爾臍橙（C. junos）的檢測(cè)結(jié)果（王靜，2009）基本一致。此外，本研究通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-CrSAMDC，并通過(guò)BL21（DE3）原核表達(dá)菌株成功誘導(dǎo)表達(dá)獲得約61.0 kD的融合蛋白，為進(jìn)一步探究SAMDC在調(diào)控抗旱脅迫等非生物逆境作用的分子機(jī)制及遺傳改良等提供了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

CrSAMDC基因在沙糖橘中的表達(dá)具有組織特異性，且以單拷貝存在，在干旱脅迫下呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，即參與干旱脅迫響應(yīng)的多胺代謝調(diào)控。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）