圣約翰草提取物對慢性不可預(yù)知性應(yīng)激致小鼠抑郁模型的影響

傅松年，王江濤，羅福祥，曾貴榮，李治建，馬麗

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心理醫(yī)學(xué)中心，烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所毒理學(xué)研究室，烏魯木齊 803349；3.新藥藥效與安全性評價湖南省重點實驗室，長沙 410331）

圣約翰草，中藥名貫葉金絲桃，為藤黃科植物貫葉金絲桃的干燥地上部分。辛，寒。歸肝經(jīng)，具有疏肝解郁，清熱利濕，消腫通乳的功效。用于肝氣郁結(jié)，情志不暢，心胸郁悶，關(guān)節(jié)腫痛，乳癰，乳少［1］。圣約翰草中含有抗抑郁成份貫葉金絲桃素、金絲桃素、偽金絲桃素和金絲桃苷等。目前，圣約翰草提取物在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療輕中度抑郁障礙，療效顯著［2］，并已獲得國內(nèi)外指南的一致推薦［3］。本研究采用慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激法建立小鼠抑郁模型，采用自主活動懸尾行為學(xué)測試檢測血清中5-羥色胺 （5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲腎上腺素 （noradrenaline，NE） 的水平及腦海馬區(qū)病理學(xué)檢查，探討圣約翰草提取物對抑郁模型小鼠抗抑郁的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性ICR小鼠70只，體質(zhì)量18.0～22.0 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （湘） 2016-0002。飼養(yǎng)于新疆維吾爾醫(yī)藥研究所SPF級實驗室中，飼養(yǎng)溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，實驗動物使用許可證號：SCXK （新）2018-0001。

1.2 藥物及試劑

圣約翰草提取物，規(guī)格：每片質(zhì)量0.56 g，含圣約翰草 （貫葉金絲桃） 提取物306 mg，批號0070417，有效期至2020年1月。鹽酸氟西汀分散片，規(guī)格：20 mg （以氟西汀計），批號7339A，分包裝批號7339AA，有效期至2019年8月。購自禮來蘇州制藥有限公司。

1.3 主要儀器

AX4201ZH/E型電子天平［奧豪斯儀器 （常州）有限公司，ME2002E型電子天平，BEHAV動物行為機能系統(tǒng) （上海吉量科技有限公司），小動物懸尾測試儀 （成都泰盟科技技術(shù)有限公司產(chǎn)品），TDL-5-A型低速大容量離心機 （上海安亭科學(xué)儀器廠），MULTISKAN FC酶標(biāo)儀 （美國Thermo公司），TP1020生物組織自動脫水機 （德國萊卡公司），KD-BM/BLⅡ生物組織自動包埋機 （浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司），RM2235切片機 （德國萊卡公司），KD-T電腦生物組織攤烤片機 （浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司），DM4000型光學(xué)顯微鏡 （德國萊卡公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激法致小鼠抑郁模型的建立：雄性ICR小鼠70只，體質(zhì)量18.0～22.0 g，除正常對照組外，其余小鼠采用慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激法制備小鼠抑郁模型。實驗過程中采用禁食、禁水 （12 h）、晝夜顛倒 （12 h/12 h），強迫游泳 （10 min）、噪聲 （30 min）、頻閃 （12 h）、動物束縛 （12 h） （置于50 mL離心管內(nèi)，管直徑為3.0 cm，長約10 cm，管壁有6～7個直徑為0.5 mm的通風(fēng)口，束縛期間動物禁食禁水）、濕籠 （12 h）、傾籠 （12 h），每天隨機采取2～3種不同方式進行不規(guī)律刺激，連續(xù)4周。

1.4.2 分組與給藥：動物連續(xù)造模4周后根據(jù)糖水偏愛檢測結(jié)果將動物隨機分為正常對照組、模型對照組、鹽酸氟西汀組［2.6 mg/ （kg·d）］、圣約翰草提取物低、中、高劑量組［0.2 g/ （kg·d）、0.4 g/ （kg·d）、0.8 g/ （kg·d）］。正常對照組和模型對照組每天給予純水灌胃，其余各組分別給予相應(yīng)藥液，給藥體積為20 mL/kg，連續(xù)給藥4周，除正常對照組外，各組于給藥后1 h繼續(xù)進行慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激刺激。

1.4.3 糖水偏愛測試：糖水偏愛測試分為訓(xùn)練期和測試期。測試前2 d作為訓(xùn)練期，使動物充分適應(yīng)蔗糖飲水，第1個24 h給予動物2瓶1%蔗糖水。第2個24 h也是訓(xùn)練期，給予小鼠1瓶1%蔗糖水，1瓶純水。測試前不禁食，禁水8 h。測試期，同時給予小鼠1 瓶1%蔗糖水，1瓶純水，測試15 h內(nèi)動物分別飲用糖水和純水水量。測試中間，將2個瓶子位置互換以避免位置偏愛影響因素。測試結(jié)束，計算糖水偏愛指數(shù) （糖水偏愛指數(shù)=糖水消耗/總液體消耗×100%）。

1.4.4 空場測試：給藥結(jié)束后將動物放入測試箱中，適應(yīng)3 min后開始檢測，檢測10 min內(nèi)小鼠自發(fā)活動。

1.4.5 懸尾測試：將小鼠倒置，尾部固定于懸尾裝置上，頭部距桌面約5 cm，使小鼠前后左右均無攀抓的地方，小鼠間有擋板隔開視線，防止互相干擾，檢測每只動物5 min的活動情況。

1.4.6 ELISA法檢測小鼠血清指標(biāo)：行為學(xué)檢測結(jié)束后，對動物禁食，次日眼眶取血，分離血清，ELISA法檢測圣約翰草提取物對小鼠血清中5-HT、NE含量的影響。

1.4.7 海馬組織病理學(xué)觀察：行為學(xué)測試結(jié)束后，灌流固定取海馬組織，石蠟切片，染色、脫水、透明及封固后，光鏡觀察海馬組織神經(jīng)元形態(tài)并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 圣約翰草提取物對小鼠糖水偏愛的影響

與正常對照組比較，模型對照組小鼠糖水偏愛指數(shù)明顯降低 （P< 0.05）。與模型對照組比較，鹽酸氟西汀組，圣約翰草提取物低、中、高劑量組小鼠糖水偏愛指數(shù)顯著升高 （P< 0.01）。見表1。

2.2 圣約翰草提取物對小鼠空場活動的影響

表1 圣約翰草提取物對小鼠糖水偏愛的影響 （，n=10）Tab.1 Effect of St.John’s wort extract on sugar water preference in mice （，n=10）

表1 圣約翰草提取物對小鼠糖水偏愛的影響 （，n=10）Tab.1 Effect of St.John’s wort extract on sugar water preference in mice （，n=10）

1） P < 0.05，compared with normal control group；2） P < 0.01，compared with model control group.

與正常對照組比較，模型對照組小鼠自主活動總路程、平均速度均明顯減少 （P< 0.05）、活動時間顯著減少 （P< 0.01），休息時間顯著增加 （P< 0.01）。與模型對照組比較，圣約翰草提取物低、中、高劑量組小鼠總路程、平均速度、活動時間均明顯降低（P< 0.05），休息時間顯著增加 （P< 0.05或P< 0.01）。見表2。

2.3 圣約翰草提取物對小鼠懸尾活動的影響

表2 圣約翰草提取物對小鼠空場的影響 （，n=10）Tab.2 Effect of St.John’s wort extract on mice in relation to the open field test （，n=10）

1） P < 0.05，2） P < 0.01，compared with normal control group；3） P < 0.05，4） P < 0.01，compared with model control group.

與正常對照組比較，模型對照組小鼠活動靜止時間顯著延長 （P< 0.01）。與模型對照組比較，圣約翰草提取物低、中、高劑量組均能顯著縮短靜止時間 （P< 0.05或P< 0.01），且與鹽酸氟西汀組作用相當(dāng)。見表3。

2.4 圣約翰草提取物對小鼠血清5-HT、NE含量的影響

與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清中5-HT、NE含量明顯降低 （P< 0.05）。與模型對照組比較，圣約翰草中、高劑量組小鼠血清中5-HT含量明顯升高 （P< 0.05） ；圣約翰草中、高劑量組小鼠血清中NE含量明顯升高 （P< 0.05）。見表4。

2.5 小鼠海馬錐體細(xì)胞萎縮、變性評分

與正常對照組比較，模型對照組小鼠海馬錐體細(xì)胞萎縮、變性，主要處于重度損害狀態(tài)，且動物只數(shù)較多。與模型對照組比較，圣約翰草提取物低、中、高劑量組小鼠海馬錐體細(xì)胞主要處于正常和輕度損害，且正常狀態(tài)較多；圣約翰草提取物高劑量組有部分小鼠海馬錐體細(xì)胞處于輕度損害；鹽酸氟西汀組小鼠海馬錐體細(xì)胞主要處于輕度損害，且動物只數(shù)較多。評分標(biāo)準(zhǔn)：對大腦海馬損傷情況進行評分，按照海馬錐體細(xì)胞萎縮、變性程度分為0分，正常；1分，輕度損害 （病變<20%） ；2分，中度損害（病變20%～40%） ；3分，重度損害 （病變>40%），見表5。

表3 圣約翰草提取物對小鼠懸尾活動的影響 （，n=10）Tab.3 Effect of St.John’s wort extract on mice in relation to the tail suspension test （，n=10）

表3 圣約翰草提取物對小鼠懸尾活動的影響 （，n=10）Tab.3 Effect of St.John’s wort extract on mice in relation to the tail suspension test （，n=10）

1） P < 0.01，compared with normal control group；2） P < 0.01，3） P < 0.05，compared with model control group.

表4 圣約翰草提取物對小鼠血清5-HT、NE含量的影響 （，n=10）Tab.4 Effect of St.John’s wort extract on the serum 5-HT and NE levels of mice （，n=10）

表4 圣約翰草提取物對小鼠血清5-HT、NE含量的影響 （，n=10）Tab.4 Effect of St.John’s wort extract on the serum 5-HT and NE levels of mice （，n=10）

1） P < 0.05，compared with normal control group；2） P < 0.05，compared with model control group.

2.6 海馬組織病理學(xué)檢查

與正常對照組比較，模型對照組小鼠海馬組織神經(jīng)元損傷程度較重，表現(xiàn)為海馬錐體細(xì)胞排列不規(guī)則，部分神經(jīng)元丟失、錐體細(xì)胞萎縮、變性及數(shù)量減少，主要處于重度損害狀態(tài) （病變>40%） ；與模型對照組比較，圣約翰草低、中、高劑量組均能逆轉(zhuǎn)以上改變，可見小鼠海馬組織神經(jīng)元損傷程度較輕，表現(xiàn)為海馬椎體細(xì)胞排列較為規(guī)則，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞核形態(tài)正常，主要處于正常狀態(tài)，少數(shù)處于輕度損害 （病變<20%），見圖1。

3 討論

慢性不可預(yù)知性模型是目前研究抑郁模型常用疾病模型之一，該模型穩(wěn)定性與重復(fù)性好，能更好地模擬人類在社會環(huán)境中面臨的高壓、孤獨、擁擠等應(yīng)激因素，因此被廣泛用于抑郁癥發(fā)病機制和抗抑郁藥物的藥理學(xué)研究［4-5］?？旄腥笔且钟舭Y的一個典型癥狀，糖水偏愛實驗多用于評價快感缺失的經(jīng)典行為學(xué)檢測實驗。空場實驗是經(jīng)典的情緒相關(guān)行為學(xué)檢測實驗，用于評價動物的好奇和自我探索行為。懸尾實驗檢測絕望行為，是抗抑郁藥物初篩以及檢測模型動物是否出現(xiàn)“抑郁樣”行為的常用檢測實驗［6-7］。本研究結(jié)果表明，慢性不可預(yù)知性小鼠模型動物表現(xiàn)出糖水偏愛指數(shù)降低、小鼠自主活動測試中的休息時間增加，懸掛測試中的不動時間增加，提示造模成功。圣約翰草提取物能明顯改善慢性不可預(yù)知致小鼠行為學(xué)改變，主要表現(xiàn)在升高小鼠糖水偏愛指數(shù)、減少小鼠自主活動測試中的休息時間，減少懸掛測試中的不動時間。

表5 圣約翰草提取物對小鼠海馬錐體細(xì)胞萎縮、變性評分的影響 （n=10）Tab.5 Effect of St.John’s wort extract on the atrophy and degeneration of the hippocampal pyramidal cells in mice （n=10）

圖1 圣約翰草提取物對抑郁癥模型小鼠海馬組織神經(jīng)元的影響 HE×200Fig.1 Effect of St.John’s wort extract on the neurons in the hippocampal tissue of depression model mice HE×200

目前臨床上主要以5-HT、NE重吸收抑制劑作為抑郁癥治療的首選藥物，此類藥物可通過阻斷5-HT或NE重吸收，提升其在突觸間隙的濃度，進而有效緩解病情［8］。中樞神經(jīng)遞質(zhì)在調(diào)節(jié)情緒、學(xué)習(xí)和記憶方面起著重要作用。慢性應(yīng)激可影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，導(dǎo)致應(yīng)激小鼠海馬組織5-HT、NE水平降低，相關(guān)研究表明圣約翰草提取物能夠均衡地抑制再攝取泵對5-HT、NE的再攝取，使此兩種神經(jīng)遞質(zhì)在突觸前膜的重吸收減少。反饋性地增加神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，致其在突觸間隙的濃度增加［9-11］。本研究結(jié)果表明，模型對照組小鼠海馬中5-HT、NE含量等明顯低于正常小鼠，圣約翰草提取物能夠明顯提高抑郁模型小鼠血清中5-HT、NE的水平，其結(jié)果與文獻報道一致。海馬體是腦組織邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，與情感和記憶有關(guān)，海馬對調(diào)節(jié)情緒、學(xué)習(xí)和記憶、行為等起重要作用，也是應(yīng)激反應(yīng)的高位調(diào)節(jié)中樞。臨床抑郁患者海馬組織萎縮、神經(jīng)元減少［12］，研究［13］表明長期慢性應(yīng)激能損傷小鼠海馬神經(jīng)元，主要表現(xiàn)在海馬神經(jīng)元細(xì)胞減少，本研究結(jié)果顯示，慢性不可預(yù)知性小鼠模型小鼠海馬組織細(xì)胞排列稀疏紊亂，部分椎體出現(xiàn)細(xì)胞壞死，海馬神經(jīng)元減少，圣約翰草提取物能明顯改善海馬組織病理改變［14-15］。提示圣約翰草提取物可改善抑郁小鼠海馬組織神經(jīng)元的損傷。

綜上所述，圣約翰草提取物的抗抑郁作用可能與增加調(diào)節(jié)血清中5-HT、NE濃度，減輕海馬組織神經(jīng)元損傷有關(guān)。