近紅外光響應(yīng)性鹽酸多柔比星脂質(zhì)體的制備與表征*

祝俠麗，李玲華，王莎莎，巴妍妍，賈永艷

(河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046)

近紅外光響應(yīng)的腫瘤光熱治療(photothermal therapy，PTT)由于組織穿透性強(qiáng)、生物安全性好已引起廣泛關(guān)注[1-2]。作為新興的光敏劑，硫化銅納米材料具有成本低、易合成、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，已在腫瘤PTT治療領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大潛力[3-4]。但納米硫化銅本身很難通過(guò)調(diào)節(jié)溫度而控制藥物在腫瘤部位釋放[5]。脂質(zhì)納米遞藥載體具有腫瘤靶向性，結(jié)合局部加熱可增強(qiáng)納米載體在腫瘤血管的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect，EPR)，同時(shí)高熱可促使脂質(zhì)納米遞藥載體中的藥物在腫瘤組織釋放[6]。本課題擬以鹽酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride，DOX)為模型藥物，采用課題組合成的親水性納米硫化銅(PVP/CuS)為光敏劑，制備近紅外光響應(yīng)性的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體(DOX-PVP/CuS-Lip)，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行表征。

1 儀器與試藥

1.1儀器 N-1100-OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)郎儀器有限公司)；92-llN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Nano-ZS90電位及粒度分析儀；JEM-1400型透射電鏡(日本電子株式會(huì)社)；808 nm激光器(中國(guó)科學(xué)院院長(zhǎng)春激光所)。

1.2試藥 鹽酸多柔比星(DOX，大連美倫生物技術(shù)有限公司，純度≥99%，批號(hào)：25316-40-9)；豆磷脂(天津市光夏精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20160403)；膽固醇(鄭州奇華頓化工產(chǎn)品有限公司，批號(hào)：20150527)；親水性納米硫化銅(PVP/CuS，課題組制備，批號(hào)：20180317)；三氯甲烷、甲醇等均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1DOX-PVP/CuS-Lip的制備 本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散法制備DOX-PVP/CuS-Lip納米遞藥載體[7-8]，具體步驟如下：將DOX和PVP/CuS溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH值=7.4)作為水相，備用。另精密稱取豆磷脂和膽固醇置于茄形瓶中，加入三氯甲烷10 mL，使豆磷脂和膽固醇充分溶解。將茄形瓶置于40 ℃下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)，直至其形成均勻的薄膜，加入制備好的水相溶液，待薄膜完全溶解后，探超5 min。即得DOX-PVP/CuS-Lip納米混懸液。

2.2DOX-PVP/CuS-Lip的表征

2.2.1分散性及形態(tài)觀察 分別取空白脂質(zhì)體、含PVP/CuS的空白脂質(zhì)體及DOX-PVP/CuS-Lip納米混懸液適量，攝像記錄外觀狀態(tài)及分散性，結(jié)果見(jiàn)圖1。另取適量的空白脂質(zhì)體及DOX-PVP/CuS-Lip納米混懸液加超純水稀釋，滴至透射電鏡TEM專用銅網(wǎng)，并用3%磷鎢酸溶液染色，自然晾干后置于透射電鏡下觀察。結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖1可見(jiàn)，空白脂質(zhì)體外觀呈現(xiàn)為透明乳白色，PVP/CuS-Lip因銅離子的存在呈現(xiàn)藍(lán)綠色，DOX-PVP/CuS-Lip為紫紅色，三者均為分散性良好的納米混懸液。由圖2透射電鏡照片可見(jiàn)，空白脂質(zhì)體和DOX-PVP/CuS -Lip均呈類球形結(jié)構(gòu)，大小較為均勻。

2.2.2粒徑及電位 分別取空白脂質(zhì)體、PVP/CuS-Lip及DOX-PVP /CuS-Lip適量，用超純水稀釋后，于電位及粒度分析儀中進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，空白脂質(zhì)體和DOX-PVP/CuS-Lip的平均粒徑分別為131.6 nm(PDI=0.26)、和200.9 nm(PDI=0.43)，可見(jiàn)PVP/CuS及DOX加入后可導(dǎo)致脂質(zhì)納米載體的粒徑增大，但仍約為200 nm，符合納米制劑設(shè)計(jì)要求?？瞻字|(zhì)體及DOX-PVP/CuS -Lip的平均電位分別為(-15.9±0.8) mV和(-16.0±0.9) mV，說(shuō)明兩者均為較為穩(wěn)定的體系。

A.空白脂質(zhì)體；B.含PVP/CuS空白脂質(zhì)體；C.DOX-PVP/CuS-Lip。

A.空白脂質(zhì)體；B.DOX-PVP/CuS-Lip。

2.2.3包封率及載藥量 精密量取DOX-PVP/CuS-Lip納米混懸液0.2 mL，用甲醇破乳定容至5 mL，混合均勻后，在波長(zhǎng)232 nm處測(cè)定吸光度，記為A總。精密量取DOX-PVP/CuS-Lip 1 mL置于超濾管中，在5000 r·min-1離心20 min。取濾液0.2 mL用超純水定容至5 mL，混合均勻后，在232 nm處測(cè)定吸光度，記為A游。按照下列公式計(jì)算包封率和載藥量[9]：包封率(%)=(W總-W游)/W總×100%；載藥量(%)=(W總-W游)/M總×100%。說(shuō)明：W總表示加藥的總質(zhì)量；W游表示游離藥物的質(zhì)量；M總表示脂質(zhì)體的總質(zhì)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DOX-PVP/CuS-Lip 中DOX的包封率和載藥量分別為(91.0±2.0)%(n=3)和(11.02±0.2)%(n=3)，符合納米制劑設(shè)計(jì)要求。

A～B.空白脂質(zhì)體及DOX-PVP/CuS-Lip粒徑分布圖；C～D.空白脂質(zhì)體及DOX-PVP/CuS-Lip電位分布圖。

2.3光熱轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn) 量取DOX-PVP/CuS-Lip納米混懸液3 mL置于石英比色池，利用808 nm激光[2.5 W·(cm2)-1]照射，每30 s記錄溫度隨時(shí)間的變化[10]。以超純水做空白對(duì)照。然后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，溫度為縱坐標(biāo)繪制光-熱轉(zhuǎn)換曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 GA-DTX-PVP/CuS-Lip的光熱轉(zhuǎn)換曲線

由圖4可見(jiàn)，DOX-PVP/CuS-Lip納米混懸液在808 nm激光的照射下，溫度隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯上升，照射6 min后溫度能升高至約50 ℃。與此同時(shí)，超純水組溫度基本不變，說(shuō)明DOX-PVP/CuS- Lip具有明顯的光熱轉(zhuǎn)化效應(yīng)。

2.4體外釋放實(shí)驗(yàn) 采用透析法進(jìn)行釋放度實(shí)驗(yàn)，具體方法如下[11]：精密量取DOX溶液(1 mg·mL-1)2 mL或納米混懸液置于透析袋(MWCO=30 kDa)，釋放介質(zhì)為pH值=7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)100 mL，設(shè)定恒溫振蕩器的溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1。分別于不同時(shí)間點(diǎn)取樣4 mL，每次取樣后補(bǔ)充同體積的空白介質(zhì)。另同法考察DOX-PVP/CuS-Lip在45 ℃ 下的釋放特性。應(yīng)用溶出數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算累積釋放量。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，累積釋放百分率為縱坐標(biāo)，繪制釋藥曲線，結(jié)果見(jiàn)圖5。

A.37 ℃；B.DOX-PVP/CuS-Lip

圖5A顯示DOX溶液和DOX-PVP/CuS-Lip的釋放特征存在明顯差別，DOX溶液在約2 h時(shí)其釋放率已達(dá)到100%，而DOX-PVP/CuS-Lip在8 h之后其釋放率達(dá)到43.6%。由此可見(jiàn)，與DOX溶液比較，DOX-PVP/CuS-Lip具有明顯的藥物緩釋作用。另由圖5B可見(jiàn)，DOX-PVP/CuS-Lip在45 ℃條件下釋藥速度快于37 ℃下釋放速度，如6 h 37 ℃和45 ℃條件下的累積釋放率分別為39.1% 和63.7%，說(shuō)明DOX-PVP/CuS-Lip體外釋藥具有溫度依賴特征，結(jié)合局部外加熱可加快制劑中的藥物釋放。

3 討論

本課題采用薄膜分散法制備一種可用于腫瘤光熱化聯(lián)合治療的DOX-PVP/CuS-Lip。該納米載體的平均粒徑為200.9 nm，DOX的包封率為91.0%，符合納米制劑設(shè)計(jì)要求。波長(zhǎng)808 nm近紅外激光照射下，該納米混懸液具有時(shí)間依賴型的光熱轉(zhuǎn)換特征。體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DOX-PVP/CuS-Lip具有明顯的緩釋作用和溫度依賴性釋藥特征。本實(shí)驗(yàn)可為下一步進(jìn)行DOX-PVP/CuS- Lip結(jié)合近紅外激光進(jìn)行體內(nèi)外抗腫瘤活性研究奠定基礎(chǔ)。