• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-429對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制

    2020-08-10 10:03:22韓清昕侯琳吳琍陳鳳婷于超紀(jì)涵青
    精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)雜志 2020年4期
    關(guān)鍵詞:報(bào)告基因熒光素酶質(zhì)粒

    韓清昕 侯琳 吳琍 陳鳳婷 于超 紀(jì)涵青

    (1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科,山東 青島 266003; 2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室)

    MicroRNAs是一類由20~25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA,通過與mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合,沉默后續(xù)靶基因發(fā)揮調(diào)控作用[1]。miR-429是miRNA-200家族成員之一,其作為癌基因或者抑癌基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用[2]。miR-429在多種組織中均有表達(dá),如在胃癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌組織中均呈異常表達(dá)[3]。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)是一種多功能內(nèi)吞細(xì)胞信號(hào)受體[4],表達(dá)于多種細(xì)胞表面。LRP1可通過介導(dǎo)細(xì)胞外配體的內(nèi)吞作用影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。本研究擬探討miR-429對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制,為進(jìn)一步尋找乳腺癌診斷治療的標(biāo)志物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    293T細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供),人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部中心實(shí)驗(yàn)室提供)。

    1.2 儀器與試劑

    Tecan Infinite Pro全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司),MTT試劑(美國(guó)Sigma公司),鼠抗人GAPDH抗體(北京全式金生物技術(shù)有限公司),兔抗人LRP1抗體(恩晶生物科技有限公司),pSI-Check2載體、HB-infusionTM無縫克隆試劑盒(漢恒生物科技有限公司),大腸桿菌菌株DH5a(美國(guó)Invitrogen公司),LRP1基因野生型3′UTR(LRP1-3UTR-wt)、突變型3′UTR(LRP1-3UTR-mu)片段由漢恒生物科技有限公司合成,質(zhì)粒DNA抽提試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

    人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和10 g/L的青鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基中,于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

    1.4 MTT方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞,以每孔約6 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,共鋪5塊板,待細(xì)胞密度達(dá)到40%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染,每孔按mimics NC 0.6 μL+EL轉(zhuǎn)染試劑0.4 μL的體系加入不同的轉(zhuǎn)染成分,按轉(zhuǎn)染成分不同共分為5組,分別為mimics NC組(A組)、空白對(duì)照組(B組)、inhibitors組(C組)、inhibitors NC組(D組)和miR-429 mimics組(E組)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染后的0、24、48、72、96 h分別檢測(cè)細(xì)胞活力。檢測(cè)前每孔加入稀釋好的5 g/L的MTT溶液10 μL,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液,每孔加入100 μL溶解甲瓚顆粒,震蕩2 min,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A)。

    1.5 Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞LRP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量

    將轉(zhuǎn)染后的5組細(xì)胞去除殘留培養(yǎng)液并用PBS清洗3次,加入RIPA蛋白裂解液,提取總蛋白,以BCA法檢測(cè)蛋白濃度。按SDS-PAGE凝膠試劑盒說明配置體積分?jǐn)?shù)0.10分離膠以及體積分?jǐn)?shù)0.05的濃縮膠,待電泳分離蛋白以后轉(zhuǎn)移至膜孔徑為0.45 μm的PVDF膜上;將剪好的條帶置于搖床上于50 g/L脫脂奶粉中封閉2 h,用1∶1 000稀釋好的鼠抗人GAPDH抗體、兔抗人LRP1抗體于室溫?fù)u床上孵育2.5 h,4 ℃下孵育過夜,TBST洗膜10 min,共3次;二抗室溫孵育1 h后,TBST洗膜3次。采用ECL發(fā)光液顯影,目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值計(jì)算。

    1.6 構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒

    以人基因組DNA為模板,應(yīng)用TargetScan 7.1軟件預(yù)測(cè)miR-429與LRP1基因3′UTR潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)位于第167~174個(gè)堿基。構(gòu)建含有miR-429應(yīng)答序列的LRP1基因3′UTR片段,然后突變結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)建突變型基因片段,目的基因片段及突變型基因片段兩端均添加與線性化載體兩端一致的基因序列,以便于拼接反應(yīng)的進(jìn)行。交由公司合成目的基因片段及突變型基因片段。按照HB-infusionTM無縫克隆試劑盒配置40 μL的酶切體系:400 mg/L載體2 μL,酶1 μL,10×buffer 4 μL、ddH2O 33 μL;將pSI-Check2載體進(jìn)行雙酶切,并跑膠回收;回收的線性化載體置于20 μL連接反應(yīng)體系中50 ℃溫浴20 min,將合成的基因片段與線性化載體連接。

    向在室溫解凍的100 μL DH5a感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入6 μL連接產(chǎn)物,搖勻后置于冰上30 min,于42 ℃水浴中熱擊90 s并迅速置于冰上冷卻。加入1 mL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基,混勻后置于37 ℃搖床220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。菌液搖勻離心后,取去除900 μL上清液后的100 μL培養(yǎng)基吸打混勻后涂布于含氨芐西林(Amp)的篩選平板上。平板正面向上至菌液完全吸收后倒置培養(yǎng)皿,37 ℃培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)化后的菌落在平板上挑菌,37 ℃下250 r/min搖菌14 h后用菌液進(jìn)行雙酶切,將陽性克隆菌液送測(cè)序公司測(cè)序。野生型報(bào)告基因質(zhì)粒含有正確結(jié)合位點(diǎn)的基因序列,突變型報(bào)告基因質(zhì)粒含有經(jīng)突變過的結(jié)合位點(diǎn)基因序列,將構(gòu)建的野生型以及突變型熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒分別命名為h-LRP1-3UTR-wt和h-LRP1-3UTR-mu。

    1.7 重組載體與miR-429 mimics或NC mimics分別共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

    將293T細(xì)胞按照轉(zhuǎn)染的成分不同隨機(jī)分為4組,分別為轉(zhuǎn)染h-LRP1-3UTR-mu與NC mimics組(F組)、h-LRP1-3UTR-mu與miR-429 mimics組(G組)、h-LRP1-3UTR-wt與NC mimics組(H組)、h-LRP1-3UTR-wt與miR-429 mimics組(I組),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,待96孔板中的293T細(xì)胞密度達(dá)到50%~70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,使用的是漢恒生物濃度為0.8 g/L的轉(zhuǎn)染試劑。將10 μL DMEM與0.16 μg的h-LRP1-3UTR-wt/h-LRP1-3UTR-mu目的質(zhì)粒以及5 pmoL的miR-429 mimics/NC mimics充分混勻后室溫放置(溶液1),將10 μL DMEM與0.3 μL的轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻(溶液2),室溫放置5 min后將溶液1與溶液2充分混勻,放置20 min。轉(zhuǎn)染前為細(xì)胞換取新鮮培養(yǎng)基,加入轉(zhuǎn)染混合物混勻后于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后換取新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

    1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因活性的檢測(cè)與分析

    轉(zhuǎn)染后的F、G、H、I組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h,棄掉舊的培養(yǎng)基,用PBS清洗2次,96孔板每孔加入100 μL蒸餾水稀釋的1×PLB,用移液槍吹散細(xì)胞,置于搖床上室溫緩慢搖15 min以后,吸取細(xì)胞裂解液至1.5 mL離心管中,4 ℃下12 000 r/min離心10 min,取上清液于新的EP管中;在96孔板中每孔加入100 μL熒光素酶檢測(cè)試劑 Ⅱ (LAR Ⅱ)工作液;每孔加入20 μL細(xì)胞裂解液,移液槍吹打混勻2~3次以后測(cè)定記錄螢火蟲熒光素酶活性值,此值為內(nèi)參值。每樣品中再加入Stop & Glo?Reagent 100 μL,移液槍吹打混勻后測(cè)定記錄海腎熒光素酶活性值,為報(bào)告基因發(fā)光值。熒光檢測(cè)儀會(huì)根據(jù)之前檢測(cè)到的螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性值的比值表示相對(duì)熒光素酶活性。應(yīng)用KEGG信號(hào)通路分析預(yù)測(cè)miR-429調(diào)控LRP1的表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用機(jī)制。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié) 果

    2.1 miR-429表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖影響

    析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示,分組、時(shí)間及分組與時(shí)間對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖活力有明顯的影響(F=3.94~342.90,P<0.05)。自細(xì)胞培養(yǎng)的第2天始各組細(xì)胞增殖活力與第0、1天比較差異有顯著性(F=40.53~116.33,P<0.05);在細(xì)胞培養(yǎng)的第2~4天,E組細(xì)胞的增殖活力明顯低于B、C、D組(F=4.53~19.12,P<0.05)。見表1。

    表1 各組細(xì)胞增殖活力比較

    2.2 miR-429表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞LRP1蛋白表達(dá)的影響

    Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,E、A、B、C、D組細(xì)胞的LRP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.51±0.07、1.11±0.29、2.38±0.77、1.83±0.48、1.93±0.48,E組細(xì)胞LRP1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于A、B、C、D組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.26,P<0.05)。

    2.3 LRP1與miR-429的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

    通過TargetScan 7.1軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),LRP1與miR-429存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。

    圖2 TargetScan 7.1軟件預(yù)測(cè)miR-429與LRP1 3′UTR的結(jié)合位點(diǎn)

    E、A、B、C、D分別為E、A、B、C、D組

    圖1 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組MDA-MB-231細(xì)胞LRP1蛋白的表達(dá)情況

    2.4 重組載體構(gòu)建質(zhì)粒結(jié)果

    將雙酶切后的h-LRP1-3UTR-wt和h-LRP1-3UTR-mu載體質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后,切膠回收的片段交由公司測(cè)序。比較圖3A(LRP1基因3′UTR野生型部分測(cè)序圖,陰影部分為與miR-429結(jié)合序列)和圖3B(LRP1基因 3′UTR突變型部分測(cè)序峰圖,陰影部分為突變與miR-429結(jié)合序列)的測(cè)序圖,表明兩種重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    A:h-LRP1-3UTR-wt部分測(cè)序圖;B:h-LRP1-3UTR-mu部分測(cè)序圖

    2.5 熒光素酶活性分析

    熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示,I組、H組熒光素酶活性分別為0.50±0.01、1.00±0.02,兩組比較差異有顯著性(t=39.78,P<0.01)。突變后,G組、F組熒光素酶活性分別為0.99±0.38、1.00±0.01,兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過KEGG信號(hào)通路分析LRP1基因結(jié)果顯示,細(xì)胞膜表面的LRP1蛋白可通過參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)β淀粉樣蛋白(Aβ)低聚體的水平,調(diào)控細(xì)胞周期。

    3 討 論

    細(xì)胞膜表面的LRP1蛋白可內(nèi)吞Aβ,在胞內(nèi)進(jìn)一步濃縮聚合為Aβ聚合體[6],Aβ是由在各種組織中廣泛存在的淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)β和γ-分泌酶水解產(chǎn)生。當(dāng)miR-429過表達(dá)使LRP1蛋白翻譯量減少時(shí),Aβ聚合體的合成減少,更多的Aβ以低聚Aβ的形式進(jìn)入細(xì)胞,在線粒體內(nèi)抑制細(xì)胞色素c氧化酶Ⅳ亞型(CxⅣ)以及A-β結(jié)合乙醇脫氫酶(ABAD)的作用使線粒體功能紊亂誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,或在線粒體內(nèi)直接作用于肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶D(CypD),通過線粒體膜通道孔(MPTP)進(jìn)入細(xì)胞基質(zhì),活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。已有研究表明APP與侵襲性乳腺癌密切相關(guān),可能抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[7]。本課題前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)miR-429表達(dá)可降低LRP1蛋白表達(dá)水平,乳腺癌細(xì)胞的遷移能力降低[8]。這可能是由LRP1表達(dá)量降低時(shí)Aβ聚合體生成減少,抑制APP水解,APP積聚增多而低聚Aβ生成增多引起。

    miR-429與人類多種惡性腫瘤密切相關(guān),在不同的癌組織中發(fā)揮抑癌或者促癌作用。miR-429通過靶向調(diào)控基因表達(dá)在腫瘤中發(fā)揮抑癌作用,該結(jié)果在對(duì)骨肉瘤、宮頸癌、胃癌、口腔鱗癌、食管癌及膠質(zhì)瘤的研究中得到證實(shí)[9-14]。有研究表明,miR-429在肺癌、前列腺癌及子宮內(nèi)膜癌中通過靶向調(diào)控基因表達(dá)發(fā)揮促癌作用[15-17]。YU等[18]的研究結(jié)果表明,miR-429在胰腺癌中可通過調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)的表達(dá),提高胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。本研究MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,上調(diào)miR-429表達(dá)后MDA-MB-231細(xì)胞增殖活力明顯降低,說明miR-429表達(dá)可抑制人乳腺癌細(xì)胞的增殖。

    LRP1作為一種多功能內(nèi)吞細(xì)胞信號(hào)受體,具有內(nèi)吞和信號(hào)活性。在腫瘤中LRP1的表達(dá)水平經(jīng)常被下調(diào),有研究認(rèn)為低LRP1水平是不良預(yù)后因素[19]。已經(jīng)研究證實(shí)LRP1在食管癌中發(fā)揮調(diào)控作用[20]。SONG等[21]的研究表明,miR-205可通過下調(diào)LRP1基因的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞的遷移,人類LRP1的表達(dá)部分受特異性miRNA的調(diào)控,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移減少。本研究Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)miR-429的表達(dá)水平可致LRP1蛋白表達(dá)量下調(diào)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果顯示,miR-429可顯著下調(diào)h-LRP1-3UTR-wt的熒光素酶表達(dá),說明兩者間存在結(jié)合作用,miR-429未能下調(diào)h-LRP1-3UTR-mu的熒光素酶的表達(dá),說明了突變成功。miR-429對(duì)LRP1存在靶向調(diào)控作用,在蛋白質(zhì)翻譯的過程中下調(diào)LRP1基因的表達(dá)。目前關(guān)于miR-429以及LRP1在乳腺癌中的研究較少,本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因的方法成功構(gòu)建LRP1-3UTR熒光素酶報(bào)告基因載體,并首次驗(yàn)證了miR-429與LRP1的靶向調(diào)控關(guān)系,并通過KEGG通路分析初步證實(shí)了miR-429可能是通過調(diào)節(jié)LRP1基因的表達(dá)調(diào)控乳腺癌細(xì)胞周期的作用機(jī)制。

    總之,本研究首次驗(yàn)證miR-429通過對(duì)LRP1基因的靶向調(diào)控作用來抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖,其對(duì)LRP1基因的靶向調(diào)控作用是通過與LRP1基因3′UTR互補(bǔ)結(jié)合得以實(shí)現(xiàn)的,但miR-429靶向調(diào)控LRP1基因發(fā)揮抑癌作用的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

    猜你喜歡
    報(bào)告基因熒光素酶質(zhì)粒
    NNMT基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗(yàn)證
    不同雙熒光素酶方法對(duì)檢測(cè)胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
    重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá)
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    啟動(dòng)子陷阱技術(shù)在植物啟動(dòng)子克隆研究中的應(yīng)用
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對(duì)其增殖的影響
    報(bào)告基因標(biāo)記在干細(xì)胞治療急性心肌梗死中的應(yīng)用進(jìn)展
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    人多巴胺D2基因啟動(dòng)子區(qū)—350A/G多態(tài)位點(diǎn)熒光素酶表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定及活性檢測(cè)
    BAG4過表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的鑒定
    青春草亚洲视频在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美色视频一区免费| 久久久久九九精品影院| 久久综合国产亚洲精品| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 又黄又爽又刺激的免费视频.| av国产免费在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 青春草亚洲视频在线观看| 国内精品宾馆在线| 男人狂女人下面高潮的视频| 成人一区二区视频在线观看| av在线蜜桃| 久久亚洲精品不卡| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲在久久综合| 日本黄色视频三级网站网址| avwww免费| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 毛片女人毛片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 网址你懂的国产日韩在线| 91久久精品电影网| 国产高清视频在线观看网站| 国产精华一区二区三区| 日本一本二区三区精品| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产黄片视频在线免费观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 日韩欧美在线乱码| 午夜福利在线在线| 色综合站精品国产| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国内揄拍国产精品人妻在线| 一夜夜www| 一进一出抽搐动态| 可以在线观看毛片的网站| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 草草在线视频免费看| 18禁在线播放成人免费| 国产视频内射| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲精品色激情综合| 欧美成人a在线观看| 久久久国产成人精品二区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 成人漫画全彩无遮挡| 国产真实乱freesex| 国产在视频线在精品| www.av在线官网国产| 久久精品人妻少妇| 国产精品日韩av在线免费观看| 久99久视频精品免费| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲真实伦在线观看| or卡值多少钱| 能在线免费观看的黄片| 中文资源天堂在线| 成人毛片60女人毛片免费| av福利片在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产人妻一区二区三区在| av在线老鸭窝| 国产黄片美女视频| 只有这里有精品99| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产男人的电影天堂91| 亚洲欧美清纯卡通| 久久久久免费精品人妻一区二区| 九草在线视频观看| 深夜a级毛片| 色综合站精品国产| 男人的好看免费观看在线视频| 午夜精品在线福利| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 午夜视频国产福利| 色综合色国产| 大型黄色视频在线免费观看| 国产不卡一卡二| 成年女人永久免费观看视频| 精品久久久久久久末码| 色视频www国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美潮喷喷水| 中文资源天堂在线| 免费av不卡在线播放| 边亲边吃奶的免费视频| av国产免费在线观看| 天堂√8在线中文| 午夜亚洲福利在线播放| 日韩高清综合在线| 女人被狂操c到高潮| 最近最新中文字幕大全电影3| 18+在线观看网站| 九草在线视频观看| 午夜福利高清视频| www日本黄色视频网| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美zozozo另类| 国产精品蜜桃在线观看 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产黄片美女视频| 精品久久久久久久久av| 人妻久久中文字幕网| 一个人看的www免费观看视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产高清激情床上av| 免费搜索国产男女视频| 亚洲三级黄色毛片| 久久久午夜欧美精品| 国产黄片视频在线免费观看| 99热这里只有是精品50| 国产真实伦视频高清在线观看| av在线播放精品| 国产免费男女视频| 最好的美女福利视频网| 91久久精品国产一区二区成人| 直男gayav资源| 国内精品美女久久久久久| 有码 亚洲区| 色视频www国产| 看十八女毛片水多多多| 久久99热这里只有精品18| 亚洲欧洲日产国产| 午夜福利高清视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产精品人妻久久久久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精品久久久噜噜| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产激情偷乱视频一区二区| .国产精品久久| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲av免费在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲人成网站高清观看| 国内精品一区二区在线观看| ponron亚洲| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 午夜精品一区二区三区免费看| 成人永久免费在线观看视频| 我的女老师完整版在线观看| 免费看av在线观看网站| 天堂中文最新版在线下载 | 一级av片app| 人体艺术视频欧美日本| 有码 亚洲区| 中出人妻视频一区二区| 国产免费一级a男人的天堂| a级毛片a级免费在线| 极品教师在线视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 一级毛片久久久久久久久女| 国产在视频线在精品| 精品人妻偷拍中文字幕| 成人午夜高清在线视频| 久久久a久久爽久久v久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成人午夜精彩视频在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久午夜福利片| 日韩视频在线欧美| 男女下面进入的视频免费午夜| 男人的好看免费观看在线视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 黑人高潮一二区| 热99re8久久精品国产| 少妇熟女aⅴ在线视频| 色吧在线观看| 午夜激情福利司机影院| 99视频精品全部免费 在线| 国产视频首页在线观看| 99久久成人亚洲精品观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲国产精品成人综合色| 别揉我奶头 嗯啊视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 婷婷六月久久综合丁香| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产精品三级大全| 成年av动漫网址| 国产精品综合久久久久久久免费| 日韩高清综合在线| 久久久久国产网址| 99在线人妻在线中文字幕| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 麻豆久久精品国产亚洲av| 免费大片18禁| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲经典国产精华液单| 国产爱豆传媒在线观看| 丰满的人妻完整版| 综合色丁香网| 97在线视频观看| 成人性生交大片免费视频hd| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 水蜜桃什么品种好| 在现免费观看毛片| 久久久久精品性色| 亚洲国产成人一精品久久久| 日韩成人伦理影院| 男的添女的下面高潮视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产高清有码在线观看视频| 国产乱来视频区| 亚洲精品456在线播放app| 欧美+日韩+精品| 伊人亚洲综合成人网| 最近最新中文字幕免费大全7| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产爽快片一区二区三区| 国产欧美亚洲国产| 国产精品成人在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲国产精品国产精品| 欧美日韩在线观看h| 美女cb高潮喷水在线观看| 麻豆成人av视频| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲成人一二三区av| 久久99一区二区三区| 免费观看无遮挡的男女| 日韩成人伦理影院| xxx大片免费视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 久久久久久久久久久久大奶| 99久国产av精品国产电影| 一个人看视频在线观看www免费| 大片电影免费在线观看免费| 久久久a久久爽久久v久久| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产在线免费精品| 9色porny在线观看| 国产av一区二区精品久久| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲五月色婷婷综合| 99视频精品全部免费 在线| 国产成人av激情在线播放 | 少妇丰满av| 人妻少妇偷人精品九色| 制服丝袜香蕉在线| 婷婷色综合www| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲av男天堂| 在线观看www视频免费| 日本-黄色视频高清免费观看| 中文字幕av电影在线播放| kizo精华| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲不卡免费看| 欧美日韩成人在线一区二区| 免费黄色在线免费观看| 全区人妻精品视频| 美女福利国产在线| 国产成人精品福利久久| 日本爱情动作片www.在线观看| 考比视频在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 老女人水多毛片| 国产熟女午夜一区二区三区 | 国产精品 国内视频| 好男人视频免费观看在线| 国产又色又爽无遮挡免| 精品一区二区免费观看| 国产精品熟女久久久久浪| 各种免费的搞黄视频| 日本wwww免费看| 国产亚洲最大av| 国产精品国产三级国产专区5o| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美日韩在线观看h| xxx大片免费视频| 婷婷色综合www| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久ye,这里只有精品| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产精品99久久久久久久久| 国产国语露脸激情在线看| 一区二区三区免费毛片| 男人添女人高潮全过程视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产av国产精品国产| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲激情五月婷婷啪啪| av国产精品久久久久影院| 在线观看人妻少妇| 视频在线观看一区二区三区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 99视频精品全部免费 在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日韩强制内射视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 夫妻午夜视频| 国产精品国产av在线观看| 少妇的逼好多水| 国产成人精品一,二区| 亚洲av.av天堂| 亚洲精品国产av蜜桃| 91国产中文字幕| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美日韩av久久| 制服丝袜香蕉在线| 成年人午夜在线观看视频| 99国产综合亚洲精品| 丝袜美足系列| 99精国产麻豆久久婷婷| 午夜91福利影院| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 午夜老司机福利剧场| 性高湖久久久久久久久免费观看| 91精品国产国语对白视频| 亚洲久久久国产精品| 中国国产av一级| 久久这里有精品视频免费| 在线观看三级黄色| 青春草视频在线免费观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 日本欧美视频一区| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品国产av在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品人妻久久久久久| 一级毛片电影观看| 国产精品不卡视频一区二区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久狼人影院| 久久久国产一区二区| 涩涩av久久男人的天堂| 成年人免费黄色播放视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲欧美成人精品一区二区| 精品一区在线观看国产| 免费看不卡的av| av一本久久久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 交换朋友夫妻互换小说| av天堂久久9| 在线观看一区二区三区激情| 制服丝袜香蕉在线| 久久久久视频综合| 国产69精品久久久久777片| 久热这里只有精品99| 精品人妻偷拍中文字幕| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 在线播放无遮挡| www.色视频.com| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 男女边吃奶边做爰视频| 内地一区二区视频在线| 母亲3免费完整高清在线观看 | 久久久欧美国产精品| 女人精品久久久久毛片| 国产精品久久久久久久久免| 母亲3免费完整高清在线观看 | videosex国产| 少妇的逼好多水| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 制服诱惑二区| 黄色视频在线播放观看不卡| 成年人免费黄色播放视频| 国产精品免费大片| 妹子高潮喷水视频| 日韩av免费高清视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产深夜福利视频在线观看| 欧美精品一区二区大全| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲av免费高清在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 黄色怎么调成土黄色| 午夜福利,免费看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 青春草视频在线免费观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 少妇 在线观看| 伦理电影大哥的女人| 最近中文字幕高清免费大全6| av黄色大香蕉| 日韩精品有码人妻一区| 久久ye,这里只有精品| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲,欧美,日韩| 在线观看三级黄色| 91成人精品电影| 精品国产一区二区久久| 韩国高清视频一区二区三区| 色网站视频免费| 观看美女的网站| 一个人免费看片子| 69精品国产乱码久久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久 成人 亚洲| 在线精品无人区一区二区三| 欧美国产精品一级二级三级| 97超碰精品成人国产| 免费av中文字幕在线| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久久久国产网址| 亚洲综合精品二区| 成人毛片60女人毛片免费| 一本一本综合久久| 国产极品天堂在线| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产成人91sexporn| 国产成人精品一,二区| 国国产精品蜜臀av免费| 国产毛片在线视频| 亚洲成人手机| 永久免费av网站大全| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品无大码| 亚洲av综合色区一区| 日韩中字成人| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 精品久久国产蜜桃| 两个人免费观看高清视频| 亚洲情色 制服丝袜| av有码第一页| 国模一区二区三区四区视频| 久久99一区二区三区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| av播播在线观看一区| 国产乱来视频区| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品一区www在线观看| 久久99一区二区三区| 性色avwww在线观看| 免费观看性生交大片5| 在线精品无人区一区二区三| 国模一区二区三区四区视频| 22中文网久久字幕| 免费看av在线观看网站| 美女国产视频在线观看| 久久久精品免费免费高清| 午夜免费鲁丝| 色网站视频免费| av女优亚洲男人天堂| 只有这里有精品99| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 99久久中文字幕三级久久日本| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久影院123| 成人免费观看视频高清| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 超色免费av| 久久久久久久大尺度免费视频| 极品人妻少妇av视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 黑人猛操日本美女一级片| 国产成人freesex在线| 一本久久精品| 精品人妻偷拍中文字幕| 中文字幕亚洲精品专区| 国产男人的电影天堂91| 国产精品99久久久久久久久| av电影中文网址| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 精品午夜福利在线看| a级片在线免费高清观看视频| 一区二区三区四区激情视频| 在线天堂最新版资源| 在线免费观看不下载黄p国产| 美女主播在线视频| 国产色婷婷99| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久人妻熟女aⅴ| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 精品久久久噜噜| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 人体艺术视频欧美日本| 一边摸一边做爽爽视频免费| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 亚洲精品一区蜜桃| 欧美少妇被猛烈插入视频| 九草在线视频观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美精品一区二区免费开放| 久久久久久久久久久丰满| 一边亲一边摸免费视频| 一个人看视频在线观看www免费| 日韩免费高清中文字幕av| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 中文字幕免费在线视频6| 国产亚洲欧美精品永久| 免费大片黄手机在线观看| 日本欧美国产在线视频| 亚洲天堂av无毛| 午夜影院在线不卡| 国产成人av激情在线播放 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 高清黄色对白视频在线免费看| 婷婷成人精品国产| 国产精品人妻久久久影院| 高清视频免费观看一区二区| 国产亚洲精品久久久com| 黄片无遮挡物在线观看| 一级爰片在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 熟妇人妻不卡中文字幕| 超色免费av| 国产视频内射| 视频在线观看一区二区三区| 少妇人妻精品综合一区二区| 男女边摸边吃奶| 国产精品国产三级国产专区5o| 一区在线观看完整版| 欧美成人午夜免费资源| 草草在线视频免费看| 丁香六月天网| 欧美精品国产亚洲| 久久久精品免费免费高清| 中文字幕最新亚洲高清| 久久精品国产亚洲av涩爱| 91精品国产国语对白视频| 欧美最新免费一区二区三区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产av精品麻豆| 99九九在线精品视频| 国产av精品麻豆| 欧美少妇被猛烈插入视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 22中文网久久字幕| 久久人人爽人人片av| 2022亚洲国产成人精品| 美女视频免费永久观看网站| 99热国产这里只有精品6| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美bdsm另类| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 毛片一级片免费看久久久久| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲高清免费不卡视频| 久久国产精品大桥未久av| av不卡在线播放| 男女免费视频国产| 少妇人妻精品综合一区二区| 中文欧美无线码| 熟妇人妻不卡中文字幕| 一级毛片 在线播放| 亚洲少妇的诱惑av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 丝瓜视频免费看黄片| 五月伊人婷婷丁香| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 99热全是精品| 日韩人妻高清精品专区| 国产乱来视频区| 99热国产这里只有精品6| 丁香六月天网| 国产精品免费大片| 欧美+日韩+精品| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日本色播在线视频| 老女人水多毛片| 免费观看性生交大片5| 国产精品 国内视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 久久精品久久精品一区二区三区| 天天操日日干夜夜撸| 伊人久久国产一区二区| 午夜免费鲁丝| 国产精品 国内视频| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久免费观看电影| av在线老鸭窝| 国产免费视频播放在线视频| 在线看a的网站| 三上悠亚av全集在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 91久久精品电影网| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲三级黄色毛片| 欧美日韩国产mv在线观看视频|