高壓氧對2型糖尿病小鼠攝食及胰島素敏感性的影響

宋莉敏 劉媛 張迪 袁駿華 張彩順 董靜，2

(青島大學，山東 青島 266071 1 基礎醫(yī)學院特種醫(yī)學系； 2 生理學教研室)

2型糖尿病(2DM)是最常見的DM類型,患者由于胰島素分泌相對不足和外周胰島素抵抗可導致高糖血癥[1]，其并發(fā)癥對人們健康有著嚴重影響[2]。高壓氧(HBO)療法是指在高于周圍環(huán)境大氣壓的壓力下使用高濃度的氧氣進行治療[3]。HBO療法作為一種安全的非侵入性方式，可增加組織和微血管系統(tǒng)的氧氣濃度，臨床上主要用于治療患者一氧化碳中毒及組織栓塞、缺血等疾病[4-7]。近年來研究發(fā)現，HBO可以改善DM患者血糖水平、DM病足和DM神經性病變[8-12]。目前研究表明，HBO治療對DM患者的動脈粥樣硬化和血糖控制有益[13]。HBO可增強骨骼肌中的葡萄糖和脂質代謝[14]，表明HBO可預防DM大鼠的血糖升高和脂肪細胞肥大，降低DM大鼠血糖水平并且改善骨骼肌的氧化能力[15]。但是對HBO與2DM小鼠攝食水平以及胰島素抵抗的關系尚缺乏深入研究。本實驗旨在觀察HBO是否會影響2DM小鼠攝食水平以及改善胰島素抵抗，并且采用免疫熒光方法觀察HBO對于下丘腦弓狀核神經肽Y表達的影響，從而進一步完善HBO對DM治療作用的研究。現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 動物來源

5周齡雄性C57BL/6J小鼠35只，體質量約為15 g，購于青島市藥品檢驗所。

1.2 小鼠2DM模型的制備

小鼠以高脂飲食(HFD)(含質量分數0.59的普通鼠糧，質量分數0.20的糖，質量分數0.18的豬油和質量分數0.03的蛋黃)喂養(yǎng)1周后，連續(xù)3 d每天注射低劑量鏈脲佐菌素(STZ,60 mg/kg，美國Sigma-Aldrich公司)，繼續(xù)HFD喂養(yǎng)6周，同時以同周齡僅以HFD喂養(yǎng)并注射檸檬酸鈉緩沖溶液的C57BL/6J小鼠作為對照組。小鼠飼養(yǎng)于標準動物房，室溫(23±2)℃，7：00～19：00點進行光照，嚴格按照12-12 h晝夜循環(huán)，濕度50%～60%，自由飲水和進食。以空腹血糖水平高于12 mmol/L并且穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(HOMA-IR)異常增高，為2DM小鼠造模成功[16]。

造模成功的15只小鼠隨機分為2DM組(7只小鼠)和2DM+HBO組(8只小鼠)，HFD的小鼠隨機分為HFD組(6只小鼠)以及HFD+HBO組(7只小鼠)。HFD+HBO組、2DM+HBO組小鼠置于動物高壓氧艙(煙臺冰輪高壓氧艙有限公司)內每天18：00～19:00 HBO治療。HBO治療開始時，純氧洗艙10 min，5 min內將艙內壓力升至2個絕對大氣壓，然后在2個絕對大氣壓，體積分數1.00氧氣下持續(xù)暴露60 min，治療結束以后將艙內壓力在5 min內緩慢降低至室內壓。HBO治療每天1次，持續(xù)1周。HFD組和2DM組小鼠置于相同環(huán)境，不做處理。處理小鼠的規(guī)程由青島大學動物保護和使用委員會認證。本研究符合國立衛(wèi)生研究院《實驗室護理與使用指南》的指導方針。

1.3 觀察指標及測定方法

1.3.1小鼠血糖水平、HOMA-IR以及攝食量測定采用德國貝朗倍佳血糖儀于1周HBO治療結束后小鼠尾靜脈采集血標本，常規(guī)測定空腹血糖水平，采用小鼠酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒測定空腹血漿胰島素(CEA448Mu,武漢優(yōu)爾生商貿有限公司)水平。通過以下公式計算HOMA-IR[17]：HOMA-IR=空腹血漿胰島素(mU/L)×空腹血漿葡萄糖(mmol/L)/22.5。在HBO治療的第7天，于13：00禁食，HBO結束后給予HFD，并測量第1～12小時的累積攝食量。

1.3.2免疫熒光法檢測小鼠下丘腦弓狀核神經肽Y陽性神經元表達 HBO治療結束后，所有小鼠分別腹腔注射8 g/L水合氯醛(0.4 g/kg)麻醉，心臟灌注后，迅速斷頭取腦置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，于4 ℃冰箱固定24 h后，再用300 g/L蔗糖溶液脫水24 h。根據小鼠大腦立體定位圖譜對下丘腦弓狀核核團行10～15 μm厚冰凍切片，切片置于載玻片上。切好的腦片于60 ℃溫箱中烘烤4 h以后，用PBST溶液浸泡20 min，置于修復液內，用微波爐95 ℃中火抗原修復10 min，待自然冷卻以后PBST溶液洗滌3次，每次7 min。用小牛血清室溫封閉2 h，加入神經肽Y抗體(羊抗鼠，1∶100,英國Abcam公司)后4 ℃下繼續(xù)孵育腦片12 h，PBST溶液沖洗3次后，加入熒光標記的驢抗羊IgG(NL101, 1∶200，美國R&D Systems公司)后室溫下繼續(xù)避光孵育2 h，PBST溶液洗片后，使用封片液(PBST和甘油體積比為1∶1)封片，熒光顯微鏡下觀察神經肽Y的表達。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 HFD組與2DM組小鼠血糖水平和HOMA-IR比較

HFD組及2DM組小鼠的空腹血糖水平分別為(6.43±0.30)、(15.12±1.18)mmol/L，2DM組小鼠的空腹血糖水平較HFD組明顯增高(t=-6.953，P<0.05)；HFD組、2DM組小鼠HOMA-IR分別為1.49±0.41、5.16±1.67，2DM組小鼠的HOMA-IR較HFD組小鼠明顯增高(t=-5.219，P<0.05)。

2.2 各組小鼠HBO治療前后空腹血糖差值以及HOMA-IR比較

HFD組、HFD+HBO組、2DM組和2DM+HBO組小鼠HBO治療前后空腹血糖差值分別為(1.21±1.60)、(2.60±1.95)、(7.50±4.37)、(-1.16±2.57)mmol/L，而各組治療1周后HOMA-IR分別為14.39±7.87、14.30±6.31、45.33±12.81、31.98±11.05。與2DM組相比，2DM+HBO組小鼠空腹的血糖以及HOMA-IR顯著改善(F=11.206、36.567，P<0.05)。與HFD組相比，HFD+HBO組小鼠治療1周后空腹血糖差值和HOMA-IR差異并無顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 2DM小鼠累積攝食量和下丘腦弓狀核神經肽Y表達比較

第1～12小時小鼠累積攝食量檢測結果顯示，與2DM組相比，2DM+HBO組小鼠第11小時和第12小時累積攝食量顯著增加(F=5.635、7.598，P<0.05)；而HFD組和HFD+HBO組之間的累積食物攝入量沒有顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。下丘腦弓狀核免疫熒光顯示，與HFD組相比，2DM小鼠弓狀核神經肽Y表達增加。與2DM組相比，2DM+HBO組小鼠弓狀核神經肽Y表達增加，但HFD組與HFD+HBO組之間沒有顯著統(tǒng)計學差異(圖1)。

表1 HBO治療對小鼠累積攝食量的影響

A：HFD組，B：HFD+HBO組，C：2DM組，D：2DM+HBO組。免疫熒光法，200倍

3 討 論

DM是人群中最常見的代謝紊亂，主要影響細胞兩大營養(yǎng)物質即碳水化合物以及脂質的代謝，導致代謝途徑的破壞以及有害代謝物的產生。

軀體的功能和活動需要通過食物攝入獲取能量，而食物的攝入量會受到饑餓、壓力以及其他條件的影響[18]。中樞神經系統(tǒng)對攝食主要通過弓狀核中的神經元進行調節(jié)，其中厭食神經元表達黑素皮質素抑制進食，促食欲神經元表達神經肽Y刺激進食[19]。研究表明，與正常人相比，2DM患者循環(huán)系統(tǒng)中神經肽Y表達會增加[20]，本實驗結果顯示，與HFD組相比，2DM組小鼠下丘腦弓狀核神經肽Y表達增加。在本研究中，HBO+2DM組小鼠累積攝食量增加，同時弓狀核中神經肽Y的表達增加，但空腹血糖水平明顯降低，表明HBO治療可能通過改善2DM小鼠葡萄糖的轉運及氧化利用而降低血糖水平[21-22]。本研究結果還顯示，經HBO治療后2DM小鼠胰島素敏感性明顯升高。葡萄糖轉運體4(GLUT4)是依賴于胰島素IRS1-Akt-GLUT4信號通路促進葡萄糖向細胞內轉運的蛋白，因此，GLUT4被認為是機體內葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要調節(jié)劑[23]。2DM小鼠的骨骼肌不僅對胰島素的敏感性下降，而且GLUT4的表達水平也同時降低，這使得葡萄糖的吸收以及利用能力降低從而使血糖水平上升[24-25]。另外，本研究結果還表明，HBO治療可改善2DM小鼠HOMA-IR，由此推測HBO通過促進Akt蛋白磷酸化進一步激活來促進GLUT4膜轉運，從而使得血糖水平降低，但是此猜想還需要進一步的驗證。

另外本研究結果顯示，與HFD組相比，HFD+HBO組小鼠累積攝食量呈現降低的趨勢，但血糖卻無明顯變化。研究表明缺氧可刺激白色脂肪細胞產生與炎癥相關的脂肪因子，導致胰島素抵抗[26-27]。脂肪酸的氧化與食物攝入的調節(jié)密切相關[28]。脂肪細胞分泌的脂肪因子例如瘦素，通常在胰島素抵抗模型中增加，并與食欲調節(jié)有關系[29]。因此，對于HFD+HBO組小鼠累積攝食量變化可能的解釋是HBO影響了調節(jié)脂質代謝的脂肪因子的釋放，這是一個需要進一步探討的方向。

研究表明HBO治療的主要機制是增加組織氧分壓[30-31]。但是氧分壓改善胰島素敏感性的機制還需要進一步探究。

總之，HBO增加了2DM小鼠累積攝食量及弓狀核中神經肽Y的表達，同時還改善了胰島素敏感性。本研究為HBO治療2DM提供了一定的理論依據。