反義寡核苷酸藥物在精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用進(jìn)展及其作用機(jī)制

周海燕 (ZHOU Haiyan)

(倫敦大學(xué)學(xué)院，倫敦 WC1N 1EH)

周海燕，英國倫敦大學(xué)學(xué)院終身首席研究員，倫敦大學(xué)兒童健康研究所生物醫(yī)學(xué)研究中心青年學(xué)術(shù)委員會主席，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究生教學(xué)負(fù)責(zé)人。

本科與碩士就讀于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2002年于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院)獲得博士學(xué)位。隨后在瑞士巴塞爾大學(xué)、英國倫敦帝國理工大學(xué)和倫敦大學(xué)學(xué)院任博士后研究員、高級研究員、學(xué)科帶頭人、首席研究員等職務(wù)，擔(dān)任“Action Duchenne”、“Muscular Dystrophy UK”、“AFM-TELETHON”、“Myotubular Trust”、“Kidney Research UK”等多項國際基金的評審，是《Nature Communications》、《America Journal of Human Genetics》、《Brain》等十多家國際學(xué)術(shù)雜志的特約審稿人。

目前主要從事神經(jīng)肌肉疾病的基礎(chǔ)與臨床研究及核苷酸分子治療在多種疾病中的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。共發(fā)表SCI論文50余篇，獲獎10余項，其中2006年在比利時第11屆世界肌肉學(xué)會國際會議上獲頒“President Prize”，并被評選為當(dāng)年度青年肌病學(xué)家；2011年獲英國脊髓性肌肉萎縮癥信托基金頒發(fā)“青年科學(xué)家獎”。2015—2017年周海燕及其團(tuán)隊連續(xù)三年在世界肌肉學(xué)會國際會議上獲“The Léa Rose 脊髓性肌萎縮獎”。

在過去一個世紀(jì)里,小分子藥物及以蛋白質(zhì)為治療靶點的藥物開發(fā)研究取得了顯著的成績,但是與人類疾病密切相關(guān)的治療靶點仍然只是了解了其中的一小部分，因此尋找新的治療靶點是目前臨床上迫切需要解決的問題。核糖核酸是其中最具代表性的一類靶點，特別是調(diào)節(jié)mRNA或前體mRNA(pre-mRNA)均可以作為治療的新靶點，從而擴(kuò)展了靶點治療的研究范圍。隨著近20年來人類基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，在新藥開發(fā)領(lǐng)域，特別是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，根據(jù)基因組信息而設(shè)計的特異性核苷酸治療也取得了迅猛的發(fā)展。

目前已有的用以調(diào)節(jié)細(xì)胞中RNA功能的治療方案包括微小干預(yù)RNA(siRNA)、基因治療、基因組編輯、mRNA治療以及合成的反義寡核苷酸的治療。本文主要集中討論部分反義寡核苷酸藥物在遺傳疾病中相關(guān)的臨床應(yīng)用及其作用機(jī)制。

1 反義寡核苷酸藥物對相關(guān)疾病治療的作用機(jī)制

反義寡核苷酸為化學(xué)合成的單鏈核苷酸分子，通常為13～30個核酸序列的短片段(故稱為“寡核苷酸”)，這一核酸序列被設(shè)計成為與靶向基因序列互補(bǔ)(故稱為“反義”)，通過沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對的方式與特異的RNA序列結(jié)合。在生物信息學(xué)指導(dǎo)下通過精心設(shè)計，使該核苷酸片段對目標(biāo)RNA具有高度的特異性，從而達(dá)到基因靶向治療的目的。

與目標(biāo)基因結(jié)合后的反義寡核苷酸通過幾種不同的作用機(jī)制來調(diào)節(jié)目標(biāo)mRNA的功能，其中最常見的作用機(jī)制包括：①通過激活內(nèi)源性RNA酶促反應(yīng)而促進(jìn)對目標(biāo)mRNA的消化降解；②通過調(diào)節(jié)目標(biāo)pre-mRNA的剪接模式(pre-mRNA splicing)從而改變目標(biāo)RNA終極蛋白產(chǎn)物表達(dá)，這包括外顯子跳躍(exon skipping)和外顯子保留(exon inclusion)。

1.1 反義寡核苷酸藥物對目標(biāo)mRNA的切割降解

目前美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的6種反義寡核苷酸藥物當(dāng)中，有3種，即Fomivirsen、Mipomersen和Inotersen都是通過對目標(biāo)mRNA的切割降解而達(dá)到降低與疾病相關(guān)的mRNA及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)。其共同作用機(jī)制為通過反義寡核苷酸與目標(biāo)mRNA核苷酸序列的互補(bǔ)結(jié)合，其中來源于合成的反義寡核苷酸中的部分DNA序列與目標(biāo)mRNA結(jié)合后形成的DNA-RNA雜合體將會吸引內(nèi)源性RNA酶H(RNase H)至該位點，對目標(biāo)mRNA進(jìn)行切割與降解，從而達(dá)到降低目標(biāo)基因產(chǎn)物表達(dá)的效果(圖1A)。

Fomivirsen(Vitraven)是第一個被FDA批準(zhǔn)用于疾病治療的反義寡核苷酸藥物。該藥物由21個硫代脫氧核苷酸組成，通過與人類巨細(xì)胞病毒中的關(guān)鍵基因UL123的序列互補(bǔ)結(jié)合，抑制其編碼蛋白IE2的合成而抑制該病毒的復(fù)制。Fomivirsen主要是用于治療艾滋病病人中巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎[1]。該藥于1998年獲FDA批準(zhǔn)上市,后來由于其他有效抗艾滋病病毒藥物的應(yīng)用，于2002年及2006年分別退出歐洲及美國市場。

Mipomersen(Kynamro)于2013年獲FDA批準(zhǔn)用于治療純合子型家族性高膽固醇血癥患者。該藥通過與載脂蛋白Apo B-100 mRNA核酸序列特異性互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致其被切割及降解。Apo B-100是低密度脂蛋白(LDL)及其代謝前體極低密度脂蛋白(VLDL)的主要載脂蛋白，可降低肝臟中LDL的生成，達(dá)到治療作用[2]。由于該藥在部分患者中會造成一定程度的肝功能損傷，故僅用于經(jīng)過其他降脂藥物和飲食治療仍不能控制的頑固性高膽固醇血癥患者。

Inotersen(Tegsedi)于2018年被FDA批準(zhǔn)用于治療家族性淀粉樣多發(fā)神經(jīng)病變(FAP)。該病是由于甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白(TTR)基因突變而誘導(dǎo)蛋白產(chǎn)物的錯誤折疊，進(jìn)而導(dǎo)致淀粉樣沉積物在體內(nèi)多個組織中積聚，包括周圍神經(jīng)元和心臟內(nèi)而致病。Inotersen通過與TTR mRNA核酸序列的特異性互補(bǔ)結(jié)合,切割并降解該目標(biāo)mRNA，從而達(dá)到抑制TTR蛋白在肝臟的生成，從而降低其在血液循環(huán)中的水平[3]。

1.2 反義寡核苷酸藥物對pre-mRNA剪接的校正

除了針對成熟mRNA進(jìn)行的基因表達(dá)抑制作用外，反義寡核苷酸還可以通過空間位阻，阻斷其他功能基團(tuán)與pre-mRNA中參與基因剪接的功能序列的結(jié)合，調(diào)節(jié)或改變該pre-mRNA的基因剪接模式，誘導(dǎo)產(chǎn)生新的功能性蛋白質(zhì)異形體，從而達(dá)到治療作用。這其中以反義寡核苷酸誘導(dǎo)的外顯子跳躍治療和外顯子保留治療最具代表性(圖1B)。

A：通過內(nèi)源性核糖核酸酶介導(dǎo)的mRNA降解；B:通過空間位阻對pre-mRNA的剪接進(jìn)行調(diào)節(jié)

1.2.1反義寡核苷酸藥物在杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)中的治療應(yīng)用 DMD是由于編碼抗肌萎縮蛋白Dystrophine(DMD)基因的突變而引發(fā)的致死性神經(jīng)肌肉疾病，其中約80%的DMD患者是由于外顯子缺失或重復(fù)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄本讀碼框的破壞，從而導(dǎo)致抗肌萎縮蛋白的缺失。反義寡核苷酸可通過誘導(dǎo)與突變位點鄰近的外顯子跳躍，恢復(fù)mRNA的閱讀框及后續(xù)的蛋白合成。這樣形成的抗肌萎縮蛋白雖然短于正常蛋白，但仍然包含有基本的蛋白質(zhì)功能，可以減緩肌纖維變性并延緩疾病進(jìn)展，使其臨床表現(xiàn)類似于輕型的貝克爾肌營養(yǎng)不良癥[4]。

Eteplirsen(Exondys 51)于2016年被FDA批準(zhǔn)用于DMD患者外顯子51跳躍治療[4-5]。DMD基因包含有79個外顯子。該反義核苷酸藥物通過與DMDpre-mRNA中外顯子51的核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合，在mRNA合成的過程中去除了外顯子51的轉(zhuǎn)錄，從而在骨骼肌中生成較短但仍具功能性的抗肌萎縮蛋白。外顯子51的跳躍治療適用于大約13%的DMD患者。

基于相似機(jī)理，Golodirsen(Vyondys 53)通過誘導(dǎo)DMD基因中外顯子53的跳躍從而達(dá)到治療的目的[6]。該反義核苷酸于2019年被FDA批準(zhǔn)用于DMD患者外顯子53的跳躍治療。這是第二個被FDA批準(zhǔn)的用于治療DMD的反義核苷酸藥物，適用于大約8%的DMD患者。

1.2.2反義寡核苷酸藥物用于脊髓性肌萎縮癥(SMA)的治療 SMA是由于運動神經(jīng)元存活基因(SMN1)突變引起的SMN蛋白缺乏所致。SMN2與SMN1是旁系同源基因。雖然兩者的編碼序列幾乎一致，然而由于SMN2外顯子7中的第6個核苷酸的堿基變化，故而導(dǎo)致SMN2中的外顯子7不能被有效地轉(zhuǎn)錄并且翻譯成SMN蛋白。在SMA中，盡管SMN1基因已經(jīng)發(fā)生了突變，但SMN2的基因序列是沒有被改變的。多項體內(nèi)試驗及體外實驗證明反義寡核苷酸藥物能有效地促進(jìn)SMN2基因中外顯子7的剪接機(jī)制，從而增強(qiáng)功能性SMN蛋白的合成[7-8]。

Nusinersen(Spinraza)是第一個用于治療臨床所有類型的SMA患者的反義核苷酸藥物[9-10]。該藥含有18個核苷酸序列，與SMN2的內(nèi)含子7中的一段序列(ISS-N1)進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合，從而增強(qiáng)外顯子7的剪接及其后續(xù)的功能性SMN蛋白的合成。自2016年獲得FDA批準(zhǔn)后，該藥目前已經(jīng)在世界多個國家獲得批準(zhǔn)上市。

2 反義寡核苷酸藥物的研發(fā)進(jìn)程與挑戰(zhàn)

通過使用化學(xué)合成的反義寡核苷酸來調(diào)節(jié)目標(biāo)RNA功能作為疾病治療手段最早始于1978年，用于抑制Rous肉瘤中RNA病毒的翻譯與復(fù)制[11-12]。然而直到1998年，F(xiàn)DA才批準(zhǔn)了第一個反義寡核苷酸藥物Fomivirsen。在過去的幾十年間，生物信息學(xué)以及新一代基因測序技術(shù)的飛速發(fā)展解決了過去許多未被發(fā)現(xiàn)的新的致病基因及遺傳缺陷，這為反義寡核苷酸提供了新的治療靶點。同時，各種新的核苷酸合成技術(shù)的出現(xiàn)，以及對核苷酸分子的不同化學(xué)修飾，提高了該類藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性及治療效果，降低了藥物生產(chǎn)的成本，從而突破了該類藥物開發(fā)中化學(xué)合成與制造中的瓶頸[13]。最近幾年來一些高效的新型反義核苷酸藥物在臨床上的應(yīng)用，比如Eteplirsen和Golodirsen在DMD中的應(yīng)用，Nusinersen在SMA中的應(yīng)用，使反義寡核苷酸藥物又得以復(fù)興。雖然在過去幾年，反義寡核苷酸藥物取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但其在不同疾病中的廣泛應(yīng)用仍存在一些亟待解決的問題，包括藥物的安全性以及藥物對靶器官的有效遞送等方面。

反義核苷酸藥物治療應(yīng)用中最常見的副作用包括如下幾種：①免疫炎性反應(yīng)：一些寡核苷酸可與Toll樣受體(TLR)結(jié)合，而誘發(fā)患者注射部位及全身的炎性反應(yīng)，包括注射部位皮膚炎性反應(yīng)，以及發(fā)熱、寒戰(zhàn)和僵直等。②腎臟或肝臟毒性：在硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸治療后，部分患者會出現(xiàn)蛋白尿和肝臟轉(zhuǎn)氨酶增高，極少數(shù)患者有腎小球腎炎或急性腎小管壞死的報道。③血小板計數(shù)減少：這些副作用均與劑量有關(guān),可以隨著劑量降低或暫停用藥而消失[14]。

可通過兩方面的措施對藥物的安全性進(jìn)行控制：①在前期設(shè)計時要盡量降低反義核苷酸序列與靶向基因之外的其他基因的互補(bǔ)結(jié)合，即所謂的“序列脫靶效應(yīng)”。②對相應(yīng)的核苷酸進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾[13,15]。最常用的修飾包括對核糖2′位置的甲基(2′-O-methyl)或者對甲氧乙基(2′-O-methoxye-thyl)修飾,從而增加了對其同源序列的親和力；或者使用硫代磷酸酯鍵代替核糖之間的磷酸二酯鍵使其對核酸酶具有抵抗性，不易被內(nèi)源性核酸酶降解，從而延長了藥物半衰期，降低了給藥頻率。

作為大分子親水性的化合物，寡核苷酸藥物在體內(nèi)對靶器官的遞送是目前藥物發(fā)展遇到的最大難題之一[16]。就目前已開發(fā)的藥物，寡核苷酸藥物在局部給藥的疾病中的療效明顯優(yōu)于需全身給藥的疾病，如Nusinersen采取的就是鞘內(nèi)注射給藥方式。Nusinersen是目前最成功的反義寡核苷酸藥物，全球治療的SMA病例已達(dá)上萬例。由于寡核苷酸不能通過血腦屏障，因此需要重復(fù)鞘內(nèi)注射給藥，從而使藥物能集中作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是運動神經(jīng)元。而對于其他需要全身給藥的疾病，如何將藥物有效遞送至靶組織一直是寡核苷酸藥物開發(fā)中的關(guān)鍵難題。Eteplirsen在DMD臨床療效相對較低的一個原因就是大部分藥物經(jīng)靜脈注射后，會經(jīng)腎小球濾過而迅速排出，而體內(nèi)剩余的藥物則只有一小部分被骨骼肌吸收。

配體結(jié)合的反義核苷酸技術(shù)(LiCA)是目前正在開發(fā)的用以解決這一難題的代表性技術(shù)。其可通過與靶器官上的特異受體結(jié)合，而將核苷酸藥物遞送到靶細(xì)胞內(nèi)。如寡核苷酸可以與N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)結(jié)合，而后者是肝細(xì)胞特異的脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的配體。這種配體-受體介導(dǎo)的藥物傳遞，不但可將寡核苷酸藥物特異地遞送到靶細(xì)胞內(nèi)，而且還可以大幅度降低所需的寡核苷酸藥物的劑量以及治療頻率[17]。以GalNAc-ASGPR介導(dǎo)的反義寡核苷酸治療目前還處于試驗治療階段，主要針對的是與肝細(xì)胞來源的蛋白質(zhì)產(chǎn)物相關(guān)疾病的治療[18]。

3 反義寡核苷酸藥物在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

反義寡核苷酸藥物的開發(fā)極大地促進(jìn)了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。除了能特異性地調(diào)控靶基因達(dá)到治療目的外，反義寡核苷酸還可以準(zhǔn)確地針對特異的基因突變進(jìn)行修復(fù)，例如Eteplirsen以及Golodirsen在DMD中的治療即是如此。反義寡核苷酸藥物的應(yīng)用極大地促進(jìn)了該類藥物在基因突變所致罕見遺傳病中的治療應(yīng)用。同時，美國FDA及歐洲EMA等權(quán)威認(rèn)定機(jī)構(gòu)針對罕見病治療的孤兒藥(又稱罕見藥)開通了快速資格認(rèn)定通道，也進(jìn)一步促進(jìn)了反義寡核苷酸藥物在罕見病中的治療開發(fā)。

Milasen是另一個具有代表性的反義寡核苷酸藥物，可用來治療巴頓病，目前僅發(fā)現(xiàn)1例患兒患有該罕見病[19]。研究者借助于下一代基因測序技術(shù)，在該患兒的MFSD8基因中發(fā)現(xiàn)了能引起該基因剪接異常的突變，該突變導(dǎo)致了罕見的致死性的神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥，而設(shè)計出的反義寡核苷酸藥物Milasen可有效糾正這一罕見的基因缺陷，從患兒確診到最終接受Milasen治療僅用了10個月時間。臨床證實Milasen不僅有效改善了患兒的癥狀，還迅速延緩了該例患兒快速惡化的進(jìn)程。盡管Milasen的例子在當(dāng)前尚不具有普遍性，但是它的成功為將來更多針對不同疾病而特異設(shè)計的反義核苷酸藥物的精準(zhǔn)應(yīng)用開創(chuàng)了先河。

4 結(jié)語

隨著生物信息學(xué)、分子遺傳學(xué)、藥理學(xué)及化學(xué)合成技術(shù)的日益成熟，反義寡核苷酸藥物研究取得了飛速發(fā)展。反義寡核苷酸藥物已經(jīng)顯示了其在治療腫瘤、病毒、代謝性疾病以及神經(jīng)肌肉和神經(jīng)退行性疾病中的廣泛應(yīng)用，為很多目前無法解決的醫(yī)學(xué)難題提供了潛在的治療方案，是目前最有應(yīng)用前景的基因靶向治療藥物[20]。然而，反義核苷酸技術(shù)仍處在發(fā)展中階段，仍然有很多困難需要解決。如何提升該類藥物在體內(nèi)的療效，增強(qiáng)對靶器官的特異遞送，降低其在人體內(nèi)的副作用，以及對該類藥物長期療效與毒副作用的更進(jìn)一步認(rèn)識，是目前反義寡核苷酸藥物研發(fā)正在研究的問題。另外，隨著對RNA調(diào)節(jié)機(jī)制認(rèn)識的提高，以及生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，我們期待更多的新藥作用機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，并將基因組信息應(yīng)用于藥物設(shè)計，從而進(jìn)一步推進(jìn)反義寡核苷酸藥物在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。