HPLC法同時(shí)測(cè)定蒿茶中3種有機(jī)酸的含量

王 絨，楊 勇*，施曉琪，鄒雯燕，付晨偉,紀(jì)香峰，喻春皓*，崔 超，孔 晶

(1.淮陰工學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院制藥工程系，江蘇 淮安 223003；2.江蘇省特色資源開(kāi)發(fā)與藥用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223003)

蒿茶又名蘆蒿、藜蒿，是以菊科蒿屬(CompositaeArtemisia)蔞蒿(ArtemisiaselengensisTurcz. ex Bess.)的純野生香蔞尖為原料，采用現(xiàn)代制茶工藝加工而成的茶品，是集食用與藥用于一身的養(yǎng)身保健佳品，每年清明節(jié)前后采摘加工而成的品質(zhì)尤佳。蔞蒿性平、味甘，全草入藥，有消炎、止血、化痰、鎮(zhèn)咳等功效[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)，蔞蒿中的化學(xué)成分主要包括黃酮、酚酸、萜類、香豆素、維生素和生物堿等[2-8]，其中黃酮和酚酸類成分被認(rèn)為是其重要的活性成分[2,9-10]。有機(jī)酸類成分是中藥中常見(jiàn)的一類組成物質(zhì)，具有抗炎、活血化瘀等多種藥理活性[11-16]。目前，關(guān)于蒿茶中有機(jī)酸的研究鮮有報(bào)道[10]。由于蒿茶作為一種茶葉飲品，沖泡后，其中有機(jī)酸類成分必然為人們飲用。因此，有必要測(cè)定其含量進(jìn)行蒿茶的質(zhì)量評(píng)價(jià)。本文對(duì)蒿茶的水提液進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了多種有機(jī)酸成分。在此基礎(chǔ)上，本文以蒿茶中的有機(jī)酸類成分為指標(biāo)，考察了蒿茶的提取方法，建立HPLC含量測(cè)定方法，并基于不同產(chǎn)地的蒿茶樣品進(jìn)行研究，旨在為進(jìn)一步提高蒿茶的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀、G1315B型DAD檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)；FA2004型電子天平(上海電子科技有限公司)；H1850R型醫(yī)用離心機(jī)(長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；超聲清洗儀(天津市瑞普電子儀器公司)；Smart-S15UV型實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司)。

新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品(中藥對(duì)照品實(shí)驗(yàn)耗材中心，批號(hào)分別為01330-0226、01330-1008、01330-0418)；蒿茶樣品分別購(gòu)于茶葉店鋪，共5個(gè)產(chǎn)地，江蘇(批號(hào)：190528)、山西(批號(hào)：190101)、安徽(批號(hào)：190301)、甘肅(批號(hào)：181201)、陜西(180801003)。甲醇、乙腈和甲酸均是色譜純；其他試劑均是分析純；水是超純水。

1.2 方法

1.2.1提取工藝優(yōu)化

蒿茶作為茶葉飲品，沖泡后為人飲用，因此采用恒溫浸泡提取工藝。通過(guò)L9(43)正交試驗(yàn)考察料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)對(duì)總有機(jī)酸成分提取的影響，參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 蒿茶提取工藝因素水平表

1.2.2溶液制備

(1) 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備

精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品適量，加入甲醇溶解，配置成濃度均是0.8 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。需要使用時(shí)精密吸取各個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液適量混勻，再經(jīng)過(guò)稀釋成混合對(duì)照品溶液即可(新綠原酸16 μg·mL-1、綠原酸48 μg·mL-1、隱綠原酸16 μg·mL-1)。

(2) 供試品溶液制備

以江蘇蒿茶為例，按照下述步驟，制備5種不同產(chǎn)地蒿茶的供試品溶液。取江蘇蒿茶(批號(hào)：190528)約1.0 g，按照正交試驗(yàn)最佳工藝條件，加30 mL超純水，于水浴鍋80℃恒溫浸泡50 min，共提取3次，合并3次的提取液，離心，過(guò)濾，至100 mL的容量瓶中，定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm的濾膜過(guò)濾，即得到供試品溶液。

1.2.3色譜條件優(yōu)化

本試驗(yàn)在最優(yōu)提取條件下，采用Kromasil 100-5C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm；考察不同流動(dòng)相體系：甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水對(duì)蒿茶HPLC方法分離效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒿茶提取工藝

由表2結(jié)果可知，浸泡提取主次影響因素為：料液比>提取次數(shù)>提取時(shí)間>提取溫度，最佳提取條件為料液比1︰30 g·mL-1，提取時(shí)間為50 min，溫度為80℃，提取次數(shù)為3次。

表2 蒿茶提取工藝正交設(shè)計(jì)表

2.2 HPLC色譜條件優(yōu)化

甲醇和乙腈為流動(dòng)相常用溶劑。本研究考察了不同流動(dòng)相體系：甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水(見(jiàn)圖1)，分別在320 nm檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行HPLC分析，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸時(shí)，分離時(shí)間與分離效果均優(yōu)于其他三種流動(dòng)相體系，因此，選擇乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相。

圖1 不同流動(dòng)相下HPLC譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

在“2.2”色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，混合對(duì)照品、江蘇蒿茶供試品溶液與陰性對(duì)照的色譜圖如圖1所示，各組分分離度均大于1.5。

注：1: 新綠原酸；2: 綠原酸；3: 隱綠原酸

圖2 對(duì)照品混標(biāo)和供試品溶液的HPLC色譜圖

2.3.2線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1, 2, 4, 8, 16和20 μL，每個(gè)體積分別重復(fù)進(jìn)樣3次，注入液相色譜儀， 按照“2.1”色譜條件下分析，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表3。新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸這3種有機(jī)酸的峰面積在一定質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 3種有機(jī)酸的線性關(guān)系

2.3.3檢測(cè)限與定量限

精密量取“2.3.1”下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，逐級(jí)稀釋后按“2.1”色譜條件下分析，測(cè)得新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的檢測(cè)限分別為1.1, 2.4, 3.4 ng，定量限分別為3.7, 7.8, 11.4 ng。

2.3.4精密度試驗(yàn)

按“2.3.1”項(xiàng)制備混合對(duì)照品溶液，在“2.1”色譜條件下，重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果顯示新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸峰面積的RSD值分別為3.34%、3.00%、3.47%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液，在“2.1”色譜條件下，分別在0, 2, 4, 8, 16, 24 h內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸峰面積的RSD值分別為1.10%、0.40%、1.48%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.3.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液6份，在“2.1”色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸峰面積的RSD值分別為2.05%、0.47%、3.35%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.7加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取0.1 g已知含量的蒿茶9份，再分別精密加入新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品溶液適量，按“2.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下，進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算平均加樣回收率介于96.9%～104.6%，RSD介于2.0%～2.4%，表明該方法準(zhǔn)確可靠(見(jiàn)表2)。

表4 加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.3.8樣品含量測(cè)定

精密稱取5批蒿茶樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，在“2.1”色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各成分含量(見(jiàn)表5)。

表5 不同產(chǎn)地蒿茶中有機(jī)酸的含量測(cè)定結(jié)果 (mg·g-1)

由表5可知，不同產(chǎn)地的蒿茶中有機(jī)酸含量有所差異，江蘇>陜西>安徽>山西>甘肅，其中江蘇產(chǎn)地蒿茶中有機(jī)酸含量最高達(dá)到70.406 mg·g-1，甘肅產(chǎn)地蒿茶含量最低為2.849 mg·g-1，兩者相差約25倍。

3 結(jié)論

本研究建立了HPLC法測(cè)定蒿茶中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸3種有機(jī)酸的含量，方法操作簡(jiǎn)便，具有良好的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性。將之用于考察提取工藝對(duì)有機(jī)酸含量的影響，并研究不同產(chǎn)地的蒿茶樣品中有機(jī)酸的含量差異。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的蒿茶樣本中，均檢測(cè)到3種有機(jī)酸，有機(jī)酸含量范圍為2.849～70.406 mg·g-1，含量最高相差約25倍。茶葉中的酚酸類成分具有抗氧化、降血脂等作用，本研究結(jié)果為蒿茶作為保健產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)及蒿茶的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。