靶向激活miR-148b-3p對缺血性腦卒中小鼠腦功能的影響及機(jī)制*

李 明，劉 勇，董 海，王 彪，閻登富，劉 磊，何仲春

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科 (成都 610500)

缺血性腦卒中又稱腦梗死，是由各種原因引起的局部腦組織缺血缺氧性壞死，進(jìn)而產(chǎn)生對應(yīng)神經(jīng)功能缺失的一種腦血管疾病，具有較高的致死率和致殘率。目前臨床上所采用的溶栓、抗血小板聚集、血管介入治療等綜合性措施明顯改善了腦梗死患者梗死灶的血液供應(yīng)，但血管再通后的缺血-再灌注性損傷也極大影響患者遠(yuǎn)期腦功能的恢復(fù)[1]。更重要的是，當(dāng)前缺血性腦卒中在18～50歲成人中的發(fā)病率逐年增加，導(dǎo)致越來越多的勞動(dòng)力缺失，極大地增加了社會(huì)負(fù)擔(dān)[2]。因此，了解缺血性腦卒中發(fā)生的分子機(jī)制，積極開展新型有效的治療手段，以促進(jìn)腦梗死患者腦功能恢復(fù)和降低其致死率和致殘率，在當(dāng)前形勢下顯得極為重要。

微型RNA(microRNAs, miRs)是一類由21～25個(gè)核苷酸組成的短鏈RNA，主要通過與相應(yīng)靶基因mRNA的3′段非翻譯區(qū)(3′-UTR)相結(jié)合而抑制其功能性表達(dá)。研究[3-4]顯示，缺血性腦卒中患者血液中miR-148b-3p、miR-151b、miR-27b-3p、miR-20a-5p等多種miRs的含量明顯改變，miR-148b-3p被認(rèn)為可作為缺血性腦卒中的生物學(xué)標(biāo)記。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)炎癥小體激活是缺血性腦卒中發(fā)生的重要機(jī)制[5]。在IgA血管炎患者中，miR-148b-3p被證實(shí)是炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子[6]。miR-148b-3p是否通過調(diào)控NLRP3相關(guān)炎癥反應(yīng)而影響缺血性腦卒中，這一問題尚不清楚。本研究擬在小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)性腦卒中模型中，探討靶向激活miR-148b-3p對缺血性腦卒中小鼠腦功能的調(diào)控作用，以及NLRP3炎癥小體與miR-148b-3p調(diào)控腦卒中作用機(jī)制的關(guān)系，為miRs應(yīng)用于缺血性腦卒中防治的基礎(chǔ)與臨床研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級雄性C57BL/6小鼠(8～10周齡)50只，由成都醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。光照12 h/d，室內(nèi)溫度(21～22)℃，濕度40%～55%，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.1.2 主要藥品及試劑 水合氯醛(批號(hào)：C8383)、NLRP3抑制劑MCC950(批號(hào)：5381200001)、氯化三苯基四氮唑(TTC，批號(hào)：T8877)購自美國Sigma-Aldrich公司；TrizolTMPlus RNA純化試劑盒(批號(hào)：12183555)、SuperScript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶(批號(hào)：18080044)購自美國Invitrogen公司；miR-148b-3p引物、U6引物來自美國Invitrogen公司；miR-148b-3p agomiR和agomiR陰性對照品來自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；RIPA裂解液(批號(hào)：P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號(hào)：P0010S)購自上海碧云天公司；抗硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP，批號(hào)：NBP1-54578SS)購自美國Novus Biologicals公司；NLRP3(批號(hào)：sc-25778)購自美國Adipogen生命公司；GAPDH(批號(hào)：sc-365062)抗體、過氧化物酶連接的羊抗兔二抗IgG(批號(hào)：sc-2004)購自美國Santa Cruz公司。

1.2 動(dòng)物模型制作

參照文獻(xiàn)[7]方法制作MCAO性腦梗死模型：術(shù)前禁食6 h，采用10%水合氯醛按0.3 g/kg體重腹腔注射麻醉，仰臥位固定，消毒后，頸前正中切開，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，游離頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉處，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈根部，用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈靠近動(dòng)脈分叉處穿線備用，在備用線以下剪一小口，將頭端鈍化的2 cm 6-0號(hào)尼龍栓線從切口插入頸總動(dòng)脈，繼續(xù)插入拴線至頸內(nèi)動(dòng)脈上動(dòng)脈夾處，松開動(dòng)脈夾，繼續(xù)推進(jìn)尼龍拴線直至顱內(nèi)，遇阻力而停止，此時(shí)栓線插入深度距動(dòng)脈分叉處達(dá)1 cm左右，栓線頭剛好到達(dá)并封閉大腦中動(dòng)脈。然后，結(jié)扎頸總動(dòng)脈處備用的結(jié)扎線，依次分層縫合切口，拴線另一端暫時(shí)保留在體外。術(shù)后切口消毒，監(jiān)測其呼吸、體溫、心率。栓塞90 min后，拔去拴線以實(shí)現(xiàn)再灌注；再灌注72 h后，處死動(dòng)物，取材檢測。

1.3 動(dòng)物分組處理

將50只雄性C57BL/6小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)、栓塞模型組(MCAO組)、NLRP3抑制劑組(MCC950組)、miR陰性對照轉(zhuǎn)染組(NC agomiR組)、miR-148b-3p激動(dòng)劑轉(zhuǎn)染組(miR-148b-3p agomiR組)，每組10只。假手術(shù)組的手術(shù)過程只進(jìn)行至暴露頸內(nèi)動(dòng)脈。其他4組按照上述過程完成MCAO模型建立及隨后的再灌注。手術(shù)后即刻，MCC950組腹腔注射50 mg/kg體重的MCC950，Sham組、MCAO組腹腔注射與MCC950組同等容積的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)。

miR陰性對照轉(zhuǎn)染組、miR-148b-3p激動(dòng)劑轉(zhuǎn)染組在執(zhí)行MCAO模型前60 min通過側(cè)腦室注射給予agomiR陰性對照品或miR-148b-3p agomiR。側(cè)腦室注射miR-148b-3p agomiR的方法參考文獻(xiàn)[8]。小鼠經(jīng)10%水合氯醛(0.3 g/kg體重)腹腔注射麻醉，俯臥位固定腦立體定位儀(瑞沃德，深圳)上，頭部75%乙醇消毒，正中切開皮膚，暴露顱骨。找出并標(biāo)記注射進(jìn)針點(diǎn)(前囟0.58 mm，腹側(cè)2.1 mm，左側(cè)1.2 mm)，在進(jìn)針點(diǎn)處鉆孔，植入套管，直至左側(cè)腦室。將miR-148b-3p agomiR(30 pmol/g體重)或agomiR陰性對照品(30 pmol/g體重)與DOTAP脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑按100 pmol∶1 μL比例混合為6 μL液體，在37 ℃下孵育15 min后，利用微量注射器將此混合液在20 min內(nèi)注入左側(cè)腦室，留針10 min，緩慢拔去微量注射器?？p合頭部皮膚，將小鼠由立體定向儀移下，放入恒溫恒濕的孵育箱中，37 ℃下保溫60 min；再完成MCAO模型制作。

1.4 腦功能缺陷評分

再灌注72 h時(shí)按照Vemuganti等[9]方法，采用5分制評估小鼠腦功能缺陷程度：0分，無任何腦功能缺陷(正常)；1分，不能正常伸展右前肢(輕度缺陷)；2分，肢體向右側(cè)轉(zhuǎn)圈彎曲(中度缺陷)；3分，行走時(shí)向右側(cè)傾倒(重度缺陷)；4分，不能自發(fā)行走(極重度缺陷)；5分，意識(shí)障礙。

1.5 腦梗死灶體積測定

再灌注72 h后，小鼠在10%水合氯醛腹腔注射麻醉下斷頭處死，快速取腦組織，做冠狀切片(每片厚度1.5 mm)。切片放置于2%氯化三苯基四氮唑(TTC)中37 ℃下孵育15 min，將染色后的腦片置于掃描儀中掃描，圖片存儲(chǔ)后采用Image pro plus軟件對腦片中梗死體積進(jìn)行分析。腦梗死體積百分?jǐn)?shù)參照文獻(xiàn)[10]計(jì)算。

1.6 RT-PCR分析

再灌注72 h后，小鼠斷頭處死，快速分離梗死區(qū)周圍腦皮質(zhì)組織，采用Trizol試劑盒提取總RNA，經(jīng)SuperScript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用以下引物序列進(jìn)行擴(kuò)增：miR-148b-3p引物序列5′-CTCACATGGTGTCGTGGAGTCGG CTTAACAGTTGAGTACCAAGTT-3′；內(nèi)參U6引物序列5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。擴(kuò)增反應(yīng)條件包括95 ℃ 10 min，40個(gè)循環(huán)的95 ℃15 s、60 °C 1 min。采用2-△△Ct法做相對半定量分析，以表達(dá)量比值miR-148b-3p/U6作為miR-148b-3p的相對表達(dá)量。

1.7 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析

再灌注72 h后，小鼠斷頭處死，快速分離梗死區(qū)周圍腦皮質(zhì)組織，采用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量。每泳道40 μg蛋白經(jīng)8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉液室溫下阻斷2 h，PVDF膜經(jīng)抗TXNIP、NLRP3、GAPDH一抗于4 ℃孵育過夜，過氧化物酶連接的羊抗兔二抗IgG于室溫孵育1 h。最后，加化學(xué)發(fā)光試劑顯示目的蛋白條帶。采用ImageJ軟件檢測蛋白條帶光密度，并做統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 熒光素酶實(shí)驗(yàn)

利用starBase V2.0在線數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測TXNIP mRNA上的miR-148b-3p調(diào)節(jié)靶點(diǎn)[11]。采用定點(diǎn)突變試劑盒(GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System, Invitrogen公司)誘使TXNIP 3′-UTR的miR-148b-3p結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，產(chǎn)生突變型TXNIP 3′-UTR。將野生型TXNIP 3′-UTR或突變型TXNIP 3′-UTR克隆入pRL-CMV載體(美國Promega公司)。將小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞N2a細(xì)胞系以0.5×105個(gè)/孔密度接種于96孔板。讓細(xì)胞共轉(zhuǎn)染野生型TXNIP 3′-UTR或突變型TXNIP 3′-UTR的熒光素酶構(gòu)建物和miR-148b-3p模擬物(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。轉(zhuǎn)染48 h后，各孔加入雙熒光素酶檢測底物試劑(美國Promega公司)，檢測數(shù)據(jù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠缺血性腦卒中時(shí)miR-148b-3p/ TXNIP/NLRP3軸的表達(dá)變化

為驗(yàn)證miR-148b-3p/TXNIP/NLRP3軸在小鼠缺血性腦卒中的可能作用，本研究首先檢測了缺血區(qū)腦組織中miR-148b-3p/TXNIP/NLRP3的表達(dá)量。MCAO組小鼠患側(cè)大腦皮層表現(xiàn)出典型梗死灶，Sham組小鼠皮層則無明顯異常。各組腦組織中TXNIP和NLRP3蛋白的代表性電泳條帶如下(圖1)。與Sham組相比，MCAO組腦組織中miR-148b-3p表達(dá)明顯降低，TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)量則明顯增多(表1)。

表1 各組小鼠缺血區(qū)腦組織miR-148b-3p、TXNIP、NLRP3表達(dá)比較

2.2 激活miR-148b-3p對缺血性腦卒中小鼠腦組織TXNIP/NLRP3軸表達(dá)的影響

為驗(yàn)證炎癥反應(yīng)與miR-148b-3p保護(hù)小鼠缺血性腦卒中的關(guān)系，本研究觀察了miR-148b-3對缺血區(qū)腦組織TXNIP、NLRP3表達(dá)的影響。與Sham組相比，MCAO組小鼠腦組織TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)量均顯著增大，提示患病小鼠腦組織炎癥反應(yīng)存在；與NC agomiR組相比，miR-148b-3p agomiR組腦組織TXNIP、NLRP3蛋白表達(dá)量均顯著降低(表1)。

為進(jìn)一步探討miR-148b-3p與TXNIP的關(guān)系，采用starBase V2.0在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測到TXNIP mRNA上的miR-148b-3p調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-148b-3p對TXNIP mRNA的靶向調(diào)節(jié)作用。在轉(zhuǎn)染野生型TXNIP 3′-UTR載體時(shí)，與空白對照(Wt-TXNIP+NC miR)組相比，miR-148b-3p模擬物明顯降低了轉(zhuǎn)染野生型TXNIP 3′-UTR載體下的熒光素酶活性。而在轉(zhuǎn)染突變型TXNIP 3′-UTR載體時(shí)，miR-148b-3p模擬物并未改變轉(zhuǎn)染突變型TXNIP 3′-UTR載體下的熒光素酶活性(表2)。

表2 各組N2a細(xì)胞熒光素酶活性比較(分，

2.3 激活miR-148b-3p/NLRP3軸對缺血性腦卒中小鼠腦功能評分及腦梗死灶體積的影響

miR-148b-3p激動(dòng)劑(miR-148b-3p agomiR)用于小鼠缺血性腦卒中模型，以觀察激活miR-148b-3對其腦功能缺陷評分及腦梗死灶體積的影響。與Sham組相比較，MCAO組小鼠腦功能缺陷評分和腦梗死灶體積均顯著增大，提示患病小鼠腦部結(jié)構(gòu)與功能顯著受損；與NC agomiR組相比，miR-148b-3p激動(dòng)劑(miR-148b-3p agomiR)轉(zhuǎn)染組腦功能缺陷評分明顯降低，腦梗死灶體積顯著縮小。NLRP3抑制劑MCC950用于小鼠缺血性腦卒中模型，以驗(yàn)證NLRP3相關(guān)炎癥反應(yīng)在缺血性腦卒中發(fā)生中的作用。與MCAO組相比較，MCC950組小鼠腦功能缺陷評分明顯降低，腦梗死灶體積明顯縮小(表3)。

表3 各組小鼠腦功能缺陷評分及腦梗死灶體積百分?jǐn)?shù)比較

3 討論

研究[12]表明，miRs廣泛表達(dá)于真核生物體內(nèi)，盡管在進(jìn)化上高度保守，但功能上miRs在細(xì)胞分化、機(jī)體發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程可能發(fā)揮著巨大作用。在患有缺血性腦卒中的患者與動(dòng)物體內(nèi)，多種miRs的表達(dá)量發(fā)生了顯著性改變[3,13]。一些miRs(miR-151b、miR-27b-3p等)的表達(dá)明顯上調(diào)，而另一些miRs(miR-148b-3p等)則顯著下調(diào)。下調(diào)的miR-148b-3p可視作缺血性腦卒中發(fā)生的生物學(xué)標(biāo)記[3]。但miR-148b-3p在缺血性腦卒中發(fā)生機(jī)制中的作用并不清楚。為此，本研究在小鼠缺血性腦卒中疾病模型中觀察了缺血區(qū)腦組織miR-148b-3p表達(dá)量的變化及其與小鼠缺血性腦卒中發(fā)生的關(guān)系。結(jié)果顯示，在腦卒中小鼠的缺血區(qū)腦組織中miR-148b-3p表達(dá)量顯著下調(diào)，而側(cè)腦室給予miR-148b-3p激動(dòng)劑預(yù)處理明顯縮小了患病小鼠的腦梗死灶體積，改善了腦功能缺陷，提示內(nèi)源性miR-148b-3p的表達(dá)下調(diào)可能與小鼠缺血性腦卒中發(fā)生相關(guān)，激活miR-148b-3p則對小鼠缺血性腦卒中及其腦功能缺陷有明顯保護(hù)性作用。

研究[14]顯示，氧化應(yīng)激反應(yīng)在缺血性腦卒中發(fā)生機(jī)制中起重要作用。氧自由基的產(chǎn)生，可促進(jìn)TXNIP與內(nèi)源性抗氧化物硫氧還蛋白分離，隨后TXNIP通過與NLRP3結(jié)合而激活NLRP3炎癥小體形成[15]。NLRP3炎癥小體在結(jié)構(gòu)上包括核心部分NLRP3、接頭蛋白ASC和caspase-1前體。NLRP3炎癥小體激活后可通過caspase-1激活而促進(jìn)IL-1β等炎性因子前體的裂解、成熟和釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。盡管研究[16-17]顯示，miR-148b-3p可調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)中施萬細(xì)胞的的遷移活動(dòng)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，但miR-148b-3p保護(hù)缺血性腦卒中小鼠腦損傷的具體信號(hào)機(jī)制并不清楚。本研究通過觀察激活miR-148b-3p對腦卒中小鼠腦組織NLRP3及其上游分子TXNIP表達(dá)的影響，以探討NLRP3炎癥反應(yīng)與miR-148b-3p保護(hù)小鼠缺血性腦卒中作用機(jī)制的關(guān)系。結(jié)果顯示，缺血性腦卒中導(dǎo)致小鼠缺血區(qū)腦組織中NLRP3、TXNIP的蛋白表達(dá)上調(diào)，而側(cè)腦室給予miR-148b-3p激動(dòng)劑預(yù)處理在改善腦卒中小鼠腦功能損傷的同時(shí)還顯著下調(diào)TXNIP、NLRP3的蛋白表達(dá)；應(yīng)用NLRP3抑制劑MCC950也明顯改善腦卒中小鼠的腦損傷；同時(shí)，采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-148b-3p對TXNIP mRNA的靶向調(diào)節(jié)作用，結(jié)果證實(shí)TXNIP應(yīng)該是miR-148b-3p的一個(gè)直接調(diào)節(jié)靶。

綜上所述，激活miR-148b-3p對小鼠缺血性腦卒中的保護(hù)性作用機(jī)制可能與其抑制促炎性TXNIP/NLRP3信號(hào)軸有關(guān)。