響應(yīng)面法優(yōu)化弗氏葡糖桿菌PFY-8產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵工藝

裴芳藝，薛 迪，馬巖石，劉宇超，劉得水，李 慧，劉 韓，陳 雪

（齊齊哈爾醫(yī)學院科研處，黑龍江齊齊哈爾 161000）

微生物胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是微生物在生長代謝過程中產(chǎn)生并分泌到細胞壁外的天然大分子物質(zhì)，具有重要的生物活性功能，廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域[1-2]。研究表明，微生物EPS可作為食品穩(wěn)定劑和增稠劑，增加食品黏度防止乳清沉淀[3]，可作為益生元添加到保健食品中，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[4-5]，可作為添加劑添加到藥品中，達到提高機體免疫力、降低膽固醇、抗腫瘤和抗氧化的作用[6-7]。目前用于生產(chǎn)EPS的微生物主要為乳酸菌中的嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）[8-9]、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[10-11]、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）[12]和魏斯氏菌屬（Weissellasp.）[13-14]等。葡糖桿菌屬（Gluconobactersp.）作為一類具有產(chǎn)EPS能力的微生物，近些年來也逐漸受到人們的關(guān)注，但受其產(chǎn)量的制約，很難應(yīng)用到大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)中。因此，對其產(chǎn)EPS條件的優(yōu)化成為研究的熱點[15-16]。

利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)EPS，需要多種營養(yǎng)成分和環(huán)境因素共同作用，各種因素間的相互作用錯綜復雜，具有高度的非線性[17-18]。因此，在微生物發(fā)酵產(chǎn)EPS過程中，優(yōu)化培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件對發(fā)酵水平的提高起著舉足輕重的作用，而在尋求最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的過程中，試驗設(shè)計及統(tǒng)計優(yōu)化發(fā)揮著重要作用[19]。目前針對培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化主要采用單因素試驗、正交試驗設(shè)計和響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）優(yōu)化等方法[20]。RSM主要用于研究反應(yīng)混合物中各組分所占比例與其產(chǎn)物生物學活性和含量之間的關(guān)系，確定最優(yōu)試驗條件[21]，已經(jīng)成為優(yōu)化加工條件、降低開發(fā)成本和提高產(chǎn)品質(zhì)量的一種有效方法，同時也成為一種快速優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的方法，廣泛地應(yīng)用于生物、食品和化學等領(lǐng)域[22]。

本研究以分離自自然發(fā)酵草莓汁中的弗氏葡糖桿菌（Gluconobacter frateurii）PFY-8為試驗菌株，以EPS含量為響應(yīng)值，采用單因素試驗和RSM方法優(yōu)化培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件，旨在進一步提高EPS的產(chǎn)量，為進一步利用G.frateuriiPFY-8大量生產(chǎn)EPS提供依據(jù)，同時也為其EPS分離純化、結(jié)構(gòu)分析和功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株弗氏葡糖桿菌（Gluconobacter frateurii）PFY-8：分離自自然發(fā)酵的草莓汁中，甘油管保存于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖、蔗糖、半乳糖、木糖、D-阿拉伯糖、醋酸鈉（CH3COONa）、硫酸錳（MnSO4）、硫酸鉀（K2HPO4）、七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、檸檬酸銨、吐溫-80、苯酚、硫酸、三氯乙酸（均為分析純）：天津市江天化工技術(shù)有限公司；牛肉浸膏、蛋白胨、酵母提取物（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，牛肉浸粉10 g/L，酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，CH3COONa 5 g/L，K2HPO42 g/L，MnSO40.25g/L，MgSO4·7H2O0.58g/L，檸檬酸銨2g/L，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 L。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BSC-1100-LⅡ-A2生物安全柜：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；HZQ-211C落地振蕩器、DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；AL204電子天平、FE28pH計：梅特勒-托利多集團；22331Hamburg高速離心機、5804R臺式高速大容量冷凍離心機：德國艾本德公司；V-5000可見分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株活化

取甘油保藏的G.frateuriiPFY-8菌株20 μL接種于30 mL MRS培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)48 h，再按2%（V/V）的接種量接種于MRS培養(yǎng)基，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h，活化3代后，用于后續(xù)試驗。

1.3.2 EPS的提取

多糖的提取參照DU R P等[12]的方法。將活化后的G.frateuriiPFY-8菌株以2%（V/V）接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。4 ℃、11 000 r/min離心20 min去除菌體。加入上清液3倍體積分數(shù)95%的乙醇，4 ℃靜置24 h，按上述條件離心收集沉淀，用適量去離子水溶解多糖沉淀，加入等體積的10%三氯乙酸，充分攪拌，4 ℃靜置24h后離心。上清液中加入3倍體積分數(shù)95%的乙醇，4℃靜置24 h，按上述條件離心，多糖沉淀溶于50 mL去離子水中，裝入透析袋，4 ℃透析2 d，每8 h換一次水，獲得粗胞外多糖（EPS）。

1.3.3 EPS含量的測定[23-24]

通過苯酚-硫酸法測定EPS的含量，以葡萄糖含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得到葡萄糖標準曲線回歸方程為：y=9.855x+0.009，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。根據(jù)標準曲線回歸方程計算菌株產(chǎn)EPS的含量。

1.3.4 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗

分別在MRS培養(yǎng)基中添加蔗糖、半乳糖、木糖、D-阿拉伯糖（20 g/L），考察不同碳源對EPS產(chǎn)量的影響；選取最有利于菌株產(chǎn)EPS的碳源，分別考察添加量為20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L、100 g/L、120 g/L、140 g/L碳源時EPS的產(chǎn)生情況；向優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，分別加入不同添加量牛肉浸粉（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L）、酵母提取物（0、2 g/L、4 g/L、6 g/L、8g/L、10 g/L）和蛋白胨（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L），考察不同添加量有機氮源對EPS產(chǎn)量的影響；向優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，分別加入添加量為0、1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0 g/L的檸檬酸銨，考察不同添加量檸檬酸銨對EPS產(chǎn)量的影響。

1.3.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗

分別選擇培養(yǎng)溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）、轉(zhuǎn)速（0、60 r/min、120 r/min、180 r/min、240 r/min）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、培養(yǎng)時間（24 h、48 h、72 h、96 h、120 h）、初始pH值水平（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5）條件下測定菌株產(chǎn)EPS的含量，確定其最佳培養(yǎng)條件。

1.3.6 Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇影響EPS產(chǎn)量的7個因素（蔗糖添加量、蛋白胨添加量、檸檬酸銨添加量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時間、初始pH值），以EPS產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，將每個因素分為高（+1）、低（-1）2個水平，共進行15組試驗。PB試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 PB試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of PB experiments design

1.3.7 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)PB試驗結(jié)果，以EPS產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，對影響因素蔗糖添加量（X1）、轉(zhuǎn)速（X5）、初始pH值（X7），進行中心組合試驗設(shè)計（central composite design，CCD），得到最優(yōu)方案。CCD試驗設(shè)計因素與水平見表2。

控制系統(tǒng)加入前饋補償功能后，一旦出現(xiàn)LNG流量或者壓力的擾動，前饋調(diào)節(jié)器就根據(jù)擾動的大小補償對被控量的影響。只要前饋函數(shù)設(shè)置相對合理，實現(xiàn)近似補償是可行的。

表2 中心組合試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of central composite experiments design

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計使用Design Expert 8.0.6；統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0；繪圖使用Excel 2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分對菌株產(chǎn)EPS的影響

2.1.1 碳源種類對EPS產(chǎn)量的影響

EPS產(chǎn)量不僅受菌體自身遺傳因素的影響，而且培養(yǎng)基組成（碳源、氮源）和培養(yǎng)條件也會對菌株EPS產(chǎn)量造成很大影響[25]。因此，可通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分來提高菌株產(chǎn)EPS的能力。由圖1可知，G.frateuriiPFY-8可利用多種碳源合成EPS，其中蔗糖作為碳源時，EPS產(chǎn)量最高，為（12.90±0.41）g/L，其次是半乳糖（9.42±0.56）g/L、木糖（7.78±0.43）g/L、D-阿拉伯糖（5.92±0.43）g/L。因此，選擇最佳碳源為蔗糖。

圖1 不同碳源對菌株P(guān)FY-8胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on exopolysaccharide production of strain PFY-8

圖2 蔗糖添加量對菌株P(guān)FY-8胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of sucrose addition on exopolysaccharide production of strain PFY-8

2.1.2 蔗糖添加量對EPS產(chǎn)量的影響蔗糖添加量對EPS產(chǎn)量的影響見圖2。由圖2可知，隨著蔗糖添加量的增加，EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在蔗糖添加量為80 g/L時，G.frateuriiPFY-8的EPS產(chǎn)量最高，為（25.60±0.34）g/L，是蔗糖添加量為20 g/L的1.95倍。說明在MRS培養(yǎng)基中加入一定添加量的蔗糖，可以大幅度提高EPS的產(chǎn)量。因此，選擇最佳蔗糖添加量為80 g/L。

2.1.3 有機氮源添加量對EPS產(chǎn)量的影響

圖3 牛肉浸粉（A）、酵母提取物（B）及蛋白胨（C）添加量對菌株P(guān)FY-8胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of beef extract (A),yeast extract (B) and peptone (C)addition on exopolysaccharide production of strain PFY-8

由圖3可知，隨著氮源添加量的增加，EPS的產(chǎn)量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當牛肉浸膏、酵母提取物、蛋白胨添加量分別為10 g/L、8 g/L、15 g/L時，發(fā)酵液中EPS產(chǎn)量最高，分別為（25.40±0.56）g/L、（28.94±0.38）g/L、（30.19±0.45）g/L。因此，選擇最佳牛肉浸膏、酵母提取物、蛋白胨添加量分別為10 g/L、8 g/L、15 g/L。

2.1.4 檸檬酸銨添加量對EPS產(chǎn)量的影響

檸檬酸銨添加量對EPS產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著檸檬酸銨添加量的增加，EPS的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當檸檬酸銨添加量為3 g/L時，G.frateuriiPFY-8的EPS產(chǎn)量最高，為（31.10±0.32）g/L。因此，選擇最佳檸檬酸銨添加量為3 g/L。

圖4 檸檬酸銨添加量對菌株P(guān)FY-8胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of ammonium citrate addition on exopolysaccharide production of strain PFY-8

2.2 發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)EPS的影響

培養(yǎng)溫度對菌株G.frateuriiPFY-8產(chǎn)EPS影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，EPS的產(chǎn)量呈現(xiàn)先升后降趨勢，當培養(yǎng)溫度為25 ℃時，EPS產(chǎn)量最高，為（32.06±0.66）g/L?？赡苁且驗檫^高的培養(yǎng)溫度不僅影響菌株生長，還會降低合成EPS酶的活性，從而降低菌株生產(chǎn)EPS的量。因此，選擇最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃。

2.2.2 轉(zhuǎn)速對EPS產(chǎn)量的影響

轉(zhuǎn)速主要影響培養(yǎng)基的溶氧量，菌株G.frateuriiPFY-8為嚴格好氧菌[26]，因此，研究發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)速對EPS合成的影響極為重要。轉(zhuǎn)速對菌株G.frateuriiPFY-8產(chǎn)EPS影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，在一定范圍內(nèi)隨著轉(zhuǎn)速的增加，EPS含量增加，當搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min時，EPS的含量最高，為（31.15±0.47）g/L。當搖床轉(zhuǎn)數(shù)較低時，單位時間內(nèi)培養(yǎng)液的溶氧量較低，菌體的生長速度和EPS生成速率下降，隨著搖床轉(zhuǎn)速的不斷增加，菌體生長速度和EPS合成速度增加。但當轉(zhuǎn)速超過一定范圍時，由于剪切力過大，破壞菌體結(jié)構(gòu)，使菌體過早衰亡，反而降低EPS產(chǎn)量[27]。因此，選擇最佳搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。

圖6 轉(zhuǎn)速對菌株P(guān)FY-8胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of rotation speed on exopolysaccharide production of strain PFY-8

2.2.3 接種量對EPS產(chǎn)量的影響

接種量對菌株G.frateuriiPFY-8產(chǎn)EPS的影響結(jié)果見圖7。由圖7可知，隨著接種量的增加，菌株產(chǎn)EPS的含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當接種量為9%時，EPS產(chǎn)量最低，為（29.04±0.208）g/L，這說明過大的接種量，使培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)加速消耗，導致合成EPS的前體物質(zhì)減少，反而降低EPS產(chǎn)量[28]。當接種量為5%時，EPS含量最高，為（4.10±0.08）g/L。因此，菌株的最適接種量為5%。

圖7 接種量對菌株P(guān)FY-8胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of inoculum on exopolysaccharide production of strain PFY-8

2.2.4 培養(yǎng)時間對EPS產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)時間對菌株G.frateuriiPFY-8產(chǎn)EPS影響結(jié)果見圖8。由圖8可知，在一定時間內(nèi)，隨著培養(yǎng)時間的延長，EPS含量逐漸增加，培養(yǎng)時間為96 h時，EPS含量最高，可達到（34.33±0.31）g/L。但超過一定范圍后，EPS含量開始下降，可能由于培養(yǎng)成分的消耗，阻礙了菌株的正常生長，進而影響了EPS的生成[29]。因此，選擇最佳培養(yǎng)時間為96 h。

圖8 培養(yǎng)時間對菌株P(guān)FY-8胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of culture time on exopolysaccharide production of strain PFY-8

2.2.5 初始pH值對EPS產(chǎn)量的影響

菌株生長和EPS的合成需在最適的pH值條件下進行，pH值可影響菌體細胞膜的功能、細胞的形態(tài)和細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝[30]。初始pH值對菌株G.frateuriiPFY-8產(chǎn)EPS影響結(jié)果見圖9。由圖9可知，過高和過低的初始pH值均不利于菌株G.frateuriiPFY-8合成EPS，當初始pH值為5.5時，EPS產(chǎn)量最高，為（36.75±0.47）g/L，說明偏酸性環(huán)境有利于菌株EPS的積累。因此，選擇最佳初始pH值為5.5。

圖9 初始pH值對菌株P(guān)FY-8胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of initial pH value on exopolysaccharide production of strain PFY-8

2.3 PB試驗分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，篩選出對EPS影響較為顯著的因素，進行PB試驗。PB試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

由表4可知，模型F值為23.48，P值為0.004 3＜0.01，說明試驗?zāi)Ｐ途哂酗@著性。相關(guān)系數(shù)R2=0.976 2，說明存在97.62%的試驗數(shù)據(jù)可用該模型解釋，調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2=0.934 7，二者均接近1，說明預(yù)測值與試驗值之間相關(guān)度高，可以用該模型模擬菌株EPS的發(fā)酵過程。信噪比=16.198（＞4），證明該模型可以很好的擬合試驗數(shù)據(jù)。各變量對EPS影響顯著程度依次為X1＞X7＞X5＞X4＞X2＞X6＞X3，即蔗糖添加量、轉(zhuǎn)速和初始pH值對菌株產(chǎn)EPS影響極顯著（P＜0.01）。因此，進一步選擇蔗糖添加量（X1）、轉(zhuǎn)速（X5）和初始pH值（X7）進行響應(yīng)面試驗。

表3 PB試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and results of PB experiments

表4 PB試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of PB experiments results

2.4 響應(yīng)面試驗分析

在PB試驗基礎(chǔ)上，選擇蔗糖添加量（X1）、轉(zhuǎn)速（X5）和初始pH值（X7）為影響因子，EPS產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

由表6可知，回歸模型的F值為2 632.15，P＜0.000 1，決定系數(shù)R2=0.999 6，調(diào)整決定系數(shù)R2=0.999 2，信噪比=138.977（＞4），變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=0.18%，說明試驗精確度和準確度高。模型失擬項P=0.164 8＞0.05，說明所選模型擬合性較好，無其他顯著性影響因素。因此，可以判斷CCD是可靠的，該模型可以較好的應(yīng)用于G.frateuriiPFY-8合成EPS的理論預(yù)測。一次項（X1、X5、X7）和二次項（X12、X52、X72）對菌株產(chǎn)EPS有極顯著影響（P＜0.01），交互項（X1X5、X5X7）對菌株產(chǎn)EPS有顯著影響（P＜0.05），交互項（X1X7）對菌株產(chǎn)EPS無顯著影響（P＞0.05）。

表5 中心組合試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Design and results of central composite experiments

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果，得到模型擬合方程如下：

各因素之間的交互作用對G.frateuriiPFY-8產(chǎn)EPS影響的響應(yīng)面圖見圖10。

圖10 蔗糖添加量、轉(zhuǎn)速和初始pH值對菌株P(guān)FY-8產(chǎn)胞外多糖影響的響應(yīng)面及等高線Fig.10 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between sucrose addition,rotation speed and initial pH value on exopolysaccharide production of strain PFY-8

由圖10A可知，當初始pH值為5.5時，蔗糖添加量和轉(zhuǎn)速的交互作用對EPS的合成影響顯著。由圖10B可知，當轉(zhuǎn)速為120 r/min時，蔗糖添加量和初始pH值的交互作用對EPS的合成影響不顯著。由圖10C可知，當蔗糖添加量為80 g/L時，轉(zhuǎn)速和初始pH值的交互作用對EPS的合成影響顯著。蔗糖添加量、轉(zhuǎn)速和初始pH值三者之間有較明顯的交互作用，其交互作用強弱的順序為X1X5＞X5X7＞X1X7。

2.5 驗證試驗

通過Design Expert 8.0.6軟件求解方程，得出預(yù)測的最優(yōu)條件為蔗糖添加量86.11 g/L、轉(zhuǎn)速125.92 r/min和初始pH值5.55，在該條件下EPS產(chǎn)量預(yù)測值為36.86 g/L。為后續(xù)試驗方便，將擬合最優(yōu)條件修正為蔗糖添加量86g/L、轉(zhuǎn)速130r/min、初始pH值5.6。為檢測擬合結(jié)果的可信度，采用修正后的條件進行驗證試驗，測得G.frateuriiPFY-8的EPS產(chǎn)量實際值為（37.07±0.38）g/L，與預(yù)測值無顯著差異（P＞0.05），是優(yōu)化前的1.55倍。

3 結(jié)論

為提高菌株G.frateuriiPFY-8的EPS產(chǎn)量，本研究聯(lián)合采用單因素試驗和RSM法，建立菌株G.frateuriiPFY-8發(fā)酵EPS的多項式模型，確定其最佳培養(yǎng)基為葡萄糖20 g/L，蔗糖86 g/L，牛肉浸膏10 g/L，酵母提取物8 g/L，蛋白胨15 g/L，CH3COONa 5 g/L，K2HPO42 g/L，MnSO40.25 g/L，檸檬酸銨3 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，吐溫-80 1 mL/L。最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速130 r/min、接種量5%、培養(yǎng)時間96 h、初始pH值5.6。在此優(yōu)化條件下，G.frateuriiPFY-8的EPS產(chǎn)量為（37.07±0.38）g/L，是優(yōu)化前的1.55倍。本研究為進一步利用G.frateuriiPFY-8大量生產(chǎn)EPS提供理論依據(jù)，同時也為其EPS分離純化、結(jié)構(gòu)分析和功能研究提供理論支持。