響應(yīng)面法優(yōu)化苦蕎麥鹽溶性球蛋白提取工藝研究

吳 穎，王 嘯，邱樹(shù)毅，馬琳娜，郭佳佳

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025）

蕎麥有甜蕎麥、金蕎麥和苦蕎麥三種[1]。苦蕎麥（Fagopyrum tatarium）為廖科蕎麥屬、雙子葉、一年生草本植物[2]，是一種藥食同源植物。其豐富的蛋白質(zhì)（8.51%～18.87%）[3]含量高于甜蕎、小麥、水稻、高粱等[2]，且氨基酸種類多?？嗍w蛋白根據(jù)溶解性不同可分為水溶清蛋白、鹽溶球蛋白、醇溶蛋白、堿溶或者酸溶的谷蛋白[4]?？嗍w蛋白具有調(diào)節(jié)血脂代謝[5-6]、抗氧化[7]、抑菌[8-9]、調(diào)節(jié)腸道菌群[4-5，10]等多種生物活性。目前，提取植物種子蛋白的方法主要有堿溶酸沉法、乙醇提取法、膜分離法、超聲提取法、酶解酸沉法、離子交換法和Osborne法[11]。使用較多的是堿溶酸沉法，但加工過(guò)程中強(qiáng)堿易使蛋白理化性質(zhì)改變，并且在提取過(guò)程中會(huì)消耗大量的酸堿等缺點(diǎn)[3]。有研究表明，蕎麥蛋白降血壓降膽固醇功能優(yōu)于大豆蛋白[12]，李紅梅等[13]通過(guò)研究苦蕎麥四種蛋白成分體外抗氧化活性，清蛋白球蛋白均有體外抗氧化活性，其中球蛋白抗氧化活性最強(qiáng)?？嗍w麥不同蛋白組分活性作用不同，苦蕎球蛋白有較好的抗氧化性、抗疲勞[14]、降血脂[7]等活性作用?，F(xiàn)階段大部分都是對(duì)苦蕎麥球蛋白的功能性質(zhì)和生物活性進(jìn)行研究，但是對(duì)球蛋白的提取工藝研究較少?？嗍w麥球蛋白含有可應(yīng)用于食品和醫(yī)藥的活性成分，在研究球蛋白活性作用和加工特性前，高效制備球蛋白具有重要意義。Osborne分級(jí)法提取蛋白操作簡(jiǎn)單、成本低。該研究以貴州威寧苦蕎麥為研究對(duì)象，采用Osborne分級(jí)法提取苦蕎麥球蛋白，利用響應(yīng)面法優(yōu)化苦蕎麥球蛋白的提取工藝條件，高效制備球蛋白，為后面開(kāi)展球蛋白活性研究打好基礎(chǔ)，為苦蕎麥球蛋白的綜合開(kāi)發(fā)利用提供材料來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎麥：采摘于貴州省威寧縣；體積分?jǐn)?shù)85%的磷酸、氯化鈉（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇、石油醚（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo CR3i冷凍型多功能離心機(jī)：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：上海邦西儀器科技有限公司；SpectraMaxR190酶標(biāo)儀：美谷分子儀器有限公司；FA2004N電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；XTP-200G高速多功能粉碎機(jī)：浙江永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將干燥的苦蕎麥種子于多功能粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)80目篩。在苦蕎麥粉中以1∶5（g∶mL）的比例加入石油醚進(jìn)行攪拌脫脂處理，脫脂期間數(shù)次更換石油醚[11，15-16]。將脫脂后的苦蕎麥粉過(guò)濾收集，于通風(fēng)櫥中風(fēng)干備用。

1.3.2 Osborne分級(jí)法提取苦蕎麥球蛋白

稱取5.00 g處理過(guò)的苦蕎麥粉，在前期的研究基礎(chǔ)上，采用最優(yōu)工藝條件提取苦蕎麥清蛋白。將提取清蛋白后的沉淀用氯化鈉溶液在一定的鹽含量、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間的條件下進(jìn)行攪拌浸提，再次以相同條件離心，上清液為球蛋白溶液，取上清液測(cè)定球蛋白含量。

1.3.3 測(cè)定方法

苦蕎麥粗蛋白質(zhì)含量：按照參考文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行測(cè)定。

蛋白含量測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量[1]，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)（y），蛋白質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)（x），繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程：y=0.003 9x+0.006 2（R2=0.997 3）。

蛋白提取率計(jì)算公式[18]如下：

1.3.4 苦蕎麥球蛋白提取單因素試驗(yàn)

提取完清蛋白的沉淀用氯化鈉溶液攪拌浸提球蛋白，分別考察鹽含量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））、浸提溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）、浸提時(shí)間（30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min）對(duì)球蛋白提取率的影響。

1.3.5 苦蕎麥球蛋白提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法中的Box-Behnken Design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行設(shè)計(jì)。以鹽含量（A）、料液比（B）、浸提溫度（C）和浸提時(shí)間（D）為考察因素，以球蛋白提取率（R）為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，優(yōu)化提取球蛋白的最佳工藝參數(shù)。每個(gè)試驗(yàn)組合重復(fù)測(cè)定2次，取其平均值作為結(jié)果，其因素與水平編碼表見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽含量對(duì)苦蕎麥球蛋白提取率的影響

圖1 鹽含量對(duì)苦蕎麥球蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of salt content on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

由圖2可知，在一定鹽含量范圍內(nèi)，隨著鹽含量的增加，蛋白提取率逐漸增加。當(dāng)鹽含量為1.0%時(shí)球蛋白提取率達(dá)到最大值3.81%，鹽含量為1.2%時(shí)球蛋白提取率有所下降?？赡苁躯}含量過(guò)大，鹽與水分子作用加強(qiáng)，造成球蛋白溶解度降低[18]，或是蛋白質(zhì)亞基之間相互作用造成影響，破壞了蛋白的穩(wěn)定性，蛋白提取率下降[19]。因此，選擇鹽含量1.0%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 料液比對(duì)苦蕎麥球蛋白提取率的影響

圖2 料液比對(duì)苦蕎麥球蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

由圖2可知，料液比增加，促進(jìn)了球蛋白在鹽溶液中的溶解，料液比為1∶15（g∶mL）時(shí)蛋白提取率達(dá)到最大值5.37%。隨著料液比的繼續(xù)增加，蛋白提取率開(kāi)始下降，可能是體系中鹽離子增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而使球蛋白溶解度降低，提取率下降[20]。因此，選擇料液比為1∶15（g∶mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 浸提溫度對(duì)苦蕎麥球蛋白提取率的影響

圖3 浸提溫度對(duì)苦蕎麥球蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

由圖3可知，隨著浸提溫度的升高，蛋白提取率增大。在30～40 ℃之間蛋白提取率顯著增加?？赡苁菧囟壬哂兄诘鞍踪|(zhì)分子熱運(yùn)動(dòng)，從而有更多蛋白質(zhì)溶于水。在50～55 ℃之間蛋白提取率增加緩慢，浸提溫度為55 ℃時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最大值5.43%。蛋白質(zhì)的糊化和變性溫度是在60～80 ℃之間，浸提溫度是50 ℃和55 ℃時(shí)蛋白提取率變化不大，但是溫度過(guò)高，對(duì)蛋白穩(wěn)定性有影響，且提取成本增加。因此，選擇浸提溫度55 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 浸提時(shí)間對(duì)苦蕎麥球蛋白提取率的影響

圖4 浸提時(shí)間對(duì)苦蕎麥球蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

由圖4可知，隨著浸提時(shí)間增加，蛋白提取率增大，浸提時(shí)間是90 min時(shí)蛋白提取率達(dá)到最大值4.70%。90～105 min時(shí)蛋白提取率下降。主要是由于浸提時(shí)間達(dá)90 min時(shí)，蛋白溶出已達(dá)到飽和狀態(tài)，攪拌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，部分蛋白發(fā)生水解，蛋白提取率反而降低。因此選擇浸提時(shí)間90 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)提取苦蕎麥球蛋白單因素試驗(yàn)結(jié)果，由Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)出的試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 苦蕎麥球蛋白提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests for extraction condition optimization of globulin from tartary buckwheat

2.5.2 回歸方程及方差分析

通過(guò)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行擬合，得如下回歸方程：R=5.72+0.30A-0.070B+0.33C+0.20D-0.42AB-0.047AC-0.027AD-0.66BC+0.013BD-0.26CD-0.64A2-0.70B2-0.54C2-0.57D2

對(duì)于上述回歸模型進(jìn)行方差分析，并對(duì)模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表3。F值來(lái)檢驗(yàn)各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性的高低，P越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，而失擬項(xiàng)P＞0.05不顯著。由表3方差分析結(jié)果可知，模型F=71.26，P＜0.000 1表明差異極顯著，并且失擬項(xiàng)P=0.564 9＞0.05，說(shuō)明該模型顯著。模型決定系數(shù)R2=0.986 2，說(shuō)明擬合程度很好，且調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.972 3，預(yù)測(cè)決定系數(shù)R2pre=0.937 3，方差相差很小，說(shuō)明可信度高，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)蛋白提取率最優(yōu)提取工藝。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，鹽含量、料液比、溫度和時(shí)間對(duì)蛋白提取率影響均顯著（P＜0.05）；各因素對(duì)蛋白提取率影響程度為C＞A＞D＞B。對(duì)于交互作用來(lái)說(shuō)，鹽含量和料液比、料液比和溫度以及溫度和時(shí)間交互作用對(duì)球蛋白提取率的影響顯著（P＜0.05），鹽含量和溫度、鹽含量和時(shí)間以及料液比和時(shí)間交互作用對(duì)球蛋白提取率的影響不顯著（P＞0.05），對(duì)于模型的二次項(xiàng)來(lái)說(shuō)均極顯著。

2.5.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

響應(yīng)面圖可以更加直觀形象的反映出各單因素以及各單因素之間交互影響的強(qiáng)弱關(guān)系。響應(yīng)面中，固定某個(gè)因素，改變另一個(gè)因素引起響應(yīng)值變化，如果響應(yīng)面走勢(shì)較陡，說(shuō)明該因素對(duì)響應(yīng)值影響顯著，反之則不顯著。響應(yīng)面優(yōu)化模型因素（鹽含量、料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間）交互作用對(duì)球蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖5。

由圖5分析可知，鹽含量和料液比交互作用對(duì)蛋白提取率影響的等高線圖為橢圓形，說(shuō)明鹽含量和料液比交互作用對(duì)蛋白提取率影響顯著。當(dāng)料液比不變時(shí)，隨著鹽含量的增加，蛋白提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。同樣，當(dāng)鹽含量不變時(shí)，隨著料液比增加，蛋白提取率也呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，且變化較為明顯。當(dāng)鹽含量為1.05%，料液比為1∶14（g∶mL）左右時(shí)蛋白提取率達(dá)到最大值。

鹽含量和浸提溫度以及鹽含量和浸提時(shí)間交互作用對(duì)蛋白提取率的影響的等高線圖都接近圓形，說(shuō)明對(duì)結(jié)果的影響不顯著。雖然影響不顯著，但當(dāng)固定一個(gè)變量，蛋白提取率會(huì)隨著另一個(gè)變量的增大先上升后下降，但是變化不是很大。當(dāng)鹽含量為1.05%，浸提溫度為51 ℃，浸提時(shí)間為90 min附近達(dá)到最大值。

圖5 鹽含量、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間交互作用對(duì)苦蕎麥球蛋白提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between salt content,material-liquid ratio,extraction temperature and time on extraction rate of globulin from tartary buckwheat

料液比和浸提溫度對(duì)蛋白提取率影響的等高線圖為橢圓形，說(shuō)明對(duì)結(jié)果的影響較為顯著。當(dāng)料液比不變時(shí)，隨著浸提溫度的增加，蛋白提取率呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)。但是當(dāng)浸提溫度不變時(shí)，隨著料液比增加，蛋白提取率先迅速增加，然后出現(xiàn)少量的減小，且變化較為明顯。在浸提溫度為53 ℃，料液比為1∶13（g∶mL）附近達(dá)到最大值。

料液比和浸提時(shí)間交互作用對(duì)蛋白提取率的影響的等高線圖近似圓形，說(shuō)明對(duì)結(jié)果的影響不顯著。隨著因素的變化，蛋白提取率變化趨勢(shì)為拋物面，在料液比1∶15（g∶mL），浸提時(shí)間為90 min取得最大值。

浸提溫度和浸提時(shí)間交互作用對(duì)蛋白提取率的影響，等高線圖為較扁的橢圓形，說(shuō)明對(duì)蛋白提取率的影響較為顯著。隨著因素的增加，蛋白提取率先增加，在浸提溫度為51 ℃，浸提時(shí)間為90 min左右達(dá)到最大值，然后蛋白提取率出現(xiàn)小量下降，且隨著因素的變化，結(jié)果變化明顯。

響應(yīng)面圖均為開(kāi)口向下的凸面，故響應(yīng)值R存在極大值，為進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)果，根據(jù)Design-Expert軟件得出在鹽含量、料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間交互影響下，最優(yōu)提取工藝為：鹽含量為1.07%，料液比為1∶12.73（g∶mL），浸提溫度為52.54 ℃，浸提時(shí)間為89.50 min，在此條件下模型預(yù)測(cè)的蛋白提取率為5.87%。

2.5.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，得到最佳預(yù)測(cè)工藝條件為：鹽含量為1.07%，料液比為1∶12.73（g∶mL），浸提溫度為52.54 ℃，浸提時(shí)間為89.50 min，在此條件下模型預(yù)測(cè)的蛋白提取率為5.87%?？紤]實(shí)際操作，修改條件為鹽含量1.00%、料液比1∶13（g∶mL）、浸提溫度為50 ℃、浸提時(shí)間為90 min，在此條件下，得出蛋白提取率為5.60%，與預(yù)測(cè)值5.87%接近，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際蛋白提取率。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法，以鹽含量、料液比、攪拌時(shí)間、攪拌溫度為試驗(yàn)因素，以球蛋白提取率為響應(yīng)值，試驗(yàn)中苦蕎麥鹽溶性球蛋白的最佳提取工藝條件為鹽含量1.00%、料液比1∶13（g∶mL），浸提時(shí)間90 min，浸提溫度50 ℃，在此條件下蛋白提取率為5.60%?？嗍w麥蛋白是調(diào)節(jié)人體生理功能的良好食品，食品界與醫(yī)藥界都有相關(guān)研究，且日益受到人們的關(guān)注。本研究結(jié)果為解決苦蕎麥在食品和醫(yī)藥界的應(yīng)用提供思路，為高效制備苦蕎麥球蛋白提供依據(jù)。